專利名稱：：齊墩果酸在制備治療皮膚瘢痕藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥
技術領域：
，是齊墩果酸在制備治療皮膚瘢痕藥物中的應用。
背景技術：
：瘢痕是創傷修復的必然產物，凡涉及真皮層的傷口幾乎都以瘢痕愈合而告終。過度增生的瘢痕常會破壞人體表面的完整性或伴有各種程度的功能障礙，給病人帶來精神和身體上的雙重痛苦。皮膚瘢痕發病率高，但目前臨床應用的藥物或療效不夠理想，或副作用較多，或有效成分不明確難以大量推廣應用。齊墩果酸(Oleanolicacid,OA)為白色針狀結晶，是中藥女貞子中的主要有效成分。熔點309°C，可溶于甲醇、乙醇、苯、乙醚、丙酮和氯仿，幾乎不溶于水，對酸堿均不穩定。其結構式如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>HsCCHs齊墩果酸齊墩果酸的植物來源來源于木樨科植物齊墩果OleaeuropaeaL.葉，女貞LigustrumlucidumAit.果實，龍膽科植物青葉膽SwertiamileensisT.N.HeetW.L.Shi全草。廣泛分布于自然界中。齊墩果酸具有肝保護、抗癌、抗突變的作用以及對免疫系統和心血管的作用。在實驗研究中發現，OA可使變性壞死的肝組織恢復正常來減輕丙氨酸活力下降、肝組織炎癥反應減弱、血中丙種球蛋白下降，并能促進肝細胞再生，使壞死區迅速修復，從而抑制膠原纖維增生，使肝硬變難以形成(李志梅，孫志勇，劉華慶.齊墩果酸對大鼠肝損傷的保護作用[J]·貴州醫藥，2004，28(7):582)。有研究認為，OA對結腸癌細胞系HCT15產生影響的作用機制是通過阻斷腫瘤細胞的細胞周期而抑制腫瘤細胞的增殖(LiJ，GuoWJ,YangQY.EffectsofursolicacidandoleanolicacidonhumancoloncarcinomacelllineHCT15[J],WorldJGastroenterol,2002,8(3):493.)。動物實驗結果表明OA對II、III、IV型變態反應具有明顯抑制作用(王立新，韓廣軒，劉文庸，等.齊墩果酸的化學與藥理研究.藥學實踐雜志，2001，19(2):10)。齊墩果酸對心血管疾病的作用是齊墩果酸藥理作用研究的新發現。SomowtLO等首次提出OA具抗高血壓及強心活性。研究指出，OA對實驗性高血壓大鼠無直接降壓作用，但有直接的強心作用。當大鼠長期(6wk)服用OA60mg/kg后，能有效抑制嚴重高血壓的發展，且OA的降血脂及抗氧化活性比熊果酸高(SomovaL0,NadarA,RammananP，etal.Cardiovascular,antihyperlihpidemicandantioxidanteffectsofoleanolicandursolicacidsinexperimentalhypertension[J].Phytomedicine,2003，10(23):115-121.)。但至今未見有關齊墩果酸促進瘢痕成纖維細胞凋亡的報導。
發明內容本發明對齊墩果酸提供一種制備治療瘢痕藥物的新用途。經過體外細胞實驗和動物實驗，表明齊墩果酸能顯著促進瘢痕成纖維細胞凋亡，抑制兔耳瘢痕增生。所以，齊墩果酸可以用于制備治療瘢痕的藥物。圖1為齊墩果酸對人增生性瘢痕細胞活力(0D值)的影響2為齊墩果酸對瘢痕成纖維細胞凋亡的流式二維點3為齊墩果酸對瘢痕成纖維細胞caspase-3活性的影響4為齊墩果酸抑制兔耳瘢痕增生的瘢痕指數5為齊墩果酸抑制兔耳增生性瘢痕組織I型膠原6為齊墩果酸升高兔耳增生性瘢痕組織MMPl7為齊墩果酸抑制兔耳增生性瘢痕組織TGF-β1圖具體實施例方式齊墩果酸誘導人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞凋亡實驗(一)試劑1.胎牛血清(FBSHyclone)2.磷酸緩沖液(PBSHyclone)3.二甲基亞砜(DMS0Sigma)4.甲基四唑藍(MTTAmresco)，用PBS配制成0.5%MTT5.0.25%胰酶、0.25%胰酶(不含EDTA)(Sigma)6.DMEM細胞培養液(Sigma)7.齊墩果酸(中國藥品生物制品檢定所，批號)8.細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物技術發展有限公司)9.凱基Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(南京凱基生物技術發展有限公司)10.兔I型膠原酶聯免疫試分析試劑盒(上海朗頓生物技術有限公司)11.兔基質金屬蛋白酶1(MMPl)酶聯免疫試分析試劑盒(上海朗頓生物技術有限公司)12.兔轉化生長因子β1(TGF-β1)酶聯免疫分析試劑盒(上海朗頓生物技術有限公司)(二)制備人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞取16-30歲病人皮膚增生性瘢痕，在無菌條件下，去除表皮和皮下組織，生理鹽水反復沖洗后剪切成0.5-1.Omm3的組織塊，接種于一次性培養瓶壁上，組織塊間距0.3-0.5mm，加入FBS適量，按常規在細胞培養箱內倒置培養2h后，加入含20%FBS的DMEM培養液(含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)5ml繼續培養，每周換液2次。待原代細胞生長基本融合成片時，吸除培養液，PBS液漂洗2次后加入0.25%胰酶消化約lmin，倒置顯微鏡下見胞質回縮、細胞間隙增大時，吸棄胰酶，加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化，吸管輕輕吹打瓶壁細胞使呈細胞懸液，按13比例分裝傳代，使用第3-6代細胞進行以下實驗。(三)齊墩果酸對瘢痕成纖維細胞活力影響實驗MTT比色實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法。酶聯免疫檢測儀所測得的光吸收值間接地反映了細胞活力。本實驗將齊墩果酸用DMEM配制成濃度分別為0、10、20、40、80μg/ml溶液。其中0μg/ml組即為空白對照組。取對數生長期的瘢痕成纖維細胞，用含10%FBS的DMEM培養液配制成5XIO4個/ml的細胞懸液，以每孔100μ1分別接種于3塊96孔培養板，置CO2培養箱培養24h后，吸棄培養液，用PBS洗一遍，加入DMEM100μ1，做細胞饑餓處理12h。然后，吸棄DMEM，每塊板分別加入上述配制的不同濃度的齊墩果酸溶液100μ1/孔，每組10個平行孔，繼續培養，3塊板分別于12h、24h加入0.5%MTT20μ1染色，繼續培養4h，吸棄培養液，每孔加DMSO150μ1，振蕩10-15min，自動酶標儀測定OD值(波長570nm)，分別測得不同濃度齊墩果酸培養不同時間的細胞活力(細胞活力=實驗組吸收值/空白對照組吸收值X100%)，重復做三批細胞實驗，結果見圖1。由圖1可見，在12h、24h不同的時間點，齊墩果酸各劑量組與空白對照組相比，細胞活力均有顯著下降，且呈明顯的量效和時效關系。特別是>20μg/ml劑量組對成纖維細胞增殖抑制非常明顯，與空白對照組相比有顯著性差異。說明齊墩果酸能明顯抑制瘢痕成纖維細胞的增殖。(四)齊墩果酸對增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的影響實驗流式細胞術可以研究細胞的各種功能狀態，包括細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等。本實驗將齊墩果酸用DMEM配制成濃度分別為0和40μg/ml溶液。其中0μg/ml組即為空白對照組。將對數生長期的瘢痕成纖維細胞，用含10%FBS的DMEM培養液配制成1.5XIO5個/ml的細胞懸液，以每孔2ml分別接種于1塊6孔培養板，置CO2培養箱培養24h后，吸棄培養液，用PBS洗一遍，加入2ml的DMEM培養液，饑餓12h。然后，吸棄DMEM，分別加入上述配制的不同濃度的齊墩果酸溶液2ml/孔，繼續培養12h后，吸棄培養液，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，1500rpm離心5min,PBS緩沖液洗滌2次，分別加入500μ1的BindingBuffer懸浮細胞，加入AnnexinV-FITC和PropidiumIodide各5μ1，混勻；室溫避光反應5-15min，流式細胞儀分析細胞凋亡率。其凋亡二維點圖可分為四個象限，左上為死亡細胞；左下為活細胞；右上為晚期凋亡和死亡細胞；右下為早期凋亡細胞；凋亡率為右上部分與右下部分凋亡和死亡細胞百分率之和；結果見圖2。由圖2可見，齊墩果酸作用12小時后，細胞凋亡明顯，隨給藥濃度增加，凋亡率顯著增加。給藥組早期和晚期凋亡率分別為71.09%和19.28%，顯著高于空白對照組的6.08%和5.56%。說明齊墩果酸能顯著抑制瘢痕成纖維細胞的增殖且能誘導其凋亡。(五)齊墩果酸對瘢痕成纖維細胞caspase-3活性的影響Caspase(Cysteine-requiringAspartateProtease)是一個在細胞調亡過禾呈中起重要作用的蛋白酶家族。本實驗將齊墩果酸用DMEM配制成濃度分別為0、10、20、40μg/ml溶液。其中Oyg/ml組即為空白對照組。將對數生長期的瘢痕成纖維細胞，用含10%FBS的DMEM培養液配制成1.5XIO5個/ml的細胞懸液，以每孔2ml分別接種于1塊6孔培養板，置CO2培養箱培養24h后，吸棄培養液，用PBS洗一遍，加入2ml的DMEM培養液，饑餓12h。然后，吸棄DMEM，分別加入上述配制的不同濃度的齊墩果酸溶液2ml/孔，繼續培養12h后，吸收細胞培養基，用胰酶消化并收集細胞；用PBS洗滌細胞兩次(離心2000rpm，5min)收集35XIO6個細胞，盡量去除PBS上清；在收集的沉淀細胞中加入50μ1冰冷LysisBuffer(注意使用前每50μ1LysisBuffer加入0.5μ1DTT)，吹打均勻；置冰上裂解20min，其間渦旋振蕩34次，每次IOs；4°C，離心(10，OOOrpm)Imin；小心吸取上清(含裂解的蛋白質)轉移至新的管中，并放置冰上待用；取少量上清(12μ1)，按常規方法(Braford法)測定其中的蛋白濃度。再吸取50μ1含100200μg蛋白的細胞或組織裂解上清；如體積不足50μ1，則用LysisBuffer補足至總體積50μ1(各組均采用同樣的蛋白量進行測定禾口比較)；力口入50μ1的2XReactionBuffer；力口入5μ1Caspase-3Substrate并于37°C避光孵育4小時；用酶標儀或分光光度計(100μ1的比色皿)在λ=405nm測定其吸光值。通過計算OD誘導劑/OD陰性對照(50μ1LysisBuffer+50μ12XReactionBuffer)的倍數來確定凋亡誘導劑組Caspase-3活化程度。結果見圖3。由圖3可見，齊墩果酸作用12小時后，caspase-3顯著高于空白對照組。說明齊墩果酸能夠明顯誘導增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡。齊墩果酸對兔耳增生性瘢痕的抑制實驗本實驗分成4組(1)模型對照組，(2)齊墩果酸低劑量組，(3)齊墩果酸中劑量組，(4)齊墩果酸高劑量組。上述藥物均為膏劑，其第1-4組的藥物組成及其重量百分比如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取新西蘭兔4只，雌雄不拘，清潔級，兔齡3-4個月，體重2.2-2.6kg。由中國人民解放軍第二軍醫大學實驗動物中心提供。飼養室溫度18-22°C，相對濕度60%-75%，人工混合飼料喂養。動物分籠適應性飼養3天后，按常規用藥25%烏拉坦靜注，麻醉。兔耳75%酒精消毒后，用圓形鉆刀在兔耳腹側面中線沿長軸避開血管兩側作直徑為7mm的圓形切口，完整切除全層皮膚，去除軟骨膜，保留軟骨。每耳6處，間隔2cm。術后創面涂抹金霉素軟膏防止感染。術后第7天，將48個瘢痕創面隨機分成4組，即齊墩果酸軟膏高、中、低劑量組和模型對照組，每組12個創面，分別外涂相應的藥物軟膏，并輕揉直到藥物吸收。每天1次，每處瘢痕給藥約50mg，造模后第5天開始連續外用給藥24天。第29天，用游標卡尺測量兔耳瘢痕厚度和瘢痕邊沿正常耳厚度，瘢痕指數=(瘢痕厚度+正常耳厚度)/正常耳厚度。測得各組瘢痕指數，進行比較，結果見圖4。由圖4可見，中、高劑量組藥效明顯，與模型對照組相比，兔耳瘢痕指數明顯減小，具有顯著性差異。實驗結果表明，齊墩果酸能顯著抑制皮膚瘢痕成纖維細胞增殖和誘導其凋亡，能減小瘢痕指數，因此，可用于制備治療皮膚瘢痕的藥物。齊墩果酸對兔耳增生性瘢痕I型膠原、MMPl和TGF-β1表達影響實驗將測定完瘢痕指數的兔耳增生性瘢痕組織切下，加入一定量的PBS，ΡΗ7.4。用液氮迅速冷凍保存，標本融化后保持2-8°C的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用勻漿器將標本充分勻漿。離心20分鐘(2000-3000rpm)。仔細收集上清。I型膠原檢測1.標準品的稀釋在包被有兔I型膠原抗體的酶標包被板上設標準品孔10孔，先在第一、第二孔中各取出標準品100μ1，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μ1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μ1分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μ1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1棄掉，再各取50μ1分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50μ1，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μ1分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ1，混勻后從第七、第八孔中分別取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標準品稀釋液50μ1，混勻后從第九、第十孔中各取50μ1棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μ1，濃度分別為30μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L)。2.加樣分別設空白對照孔、待測樣品孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟操作同待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μ1，然后再加待測樣品10μ1(樣品最終稀釋濃度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育用封版膜封版后置37°C溫育30分鐘。4.配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5.洗滌小心揭掉封版膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6.加酶每孔加入兔I型膠原酶標試劑50μ1，空白對照孔除外。7.溫育操作同3。8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑A50μ1，再加入顯色劑B50μ1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘。10.終止每孔加終止液50μ1，終止反應(此時藍色轉變為黃色)。11.測定以空白對照孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。結果見圖5。兔MMPl和TGF-β1的測定方法如上，僅將標準品和酶標試劑換為相應的標準品和酶標試劑。結果見圖6和圖7。實驗結果表明，連續用藥28天，齊敦果酸劑量依賴地顯著降低兔耳瘢痕組織I型膠原含量和TGF-β1水平，升高MMPl水平。權利要求齊墩果酸在制備治療皮膚瘢痕藥物中的應用。全文摘要本發明涉及醫藥
技術領域：
，是齊墩果酸用于制備治療皮膚瘢痕藥物的新用途。經體外人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞凋亡實驗和兔耳增生性瘢痕的抑制實驗，齊墩果酸能顯著抑制皮膚瘢痕細胞增殖和誘導其凋亡，并能減小瘢痕增生指數，因此，可用于制備治療皮膚瘢痕的藥物。齊墩果酸來源廣泛、制備方法簡便，價格低廉，本發明為皮膚瘢痕的治療提供了新的藥物來源。文檔編號A61K31/56GK101797256SQ20101011034公開日2010年8月11日申請日期2010年2月10日優先權日2010年2月10日發明者吳建國,張宏,張巧艷,杜漸,秦路平,韓婷,魏艷潔,黃寶康申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學