專利名稱：乙醇生產的制作方法
技術領域：
本發明涉及乙醇作為細菌發酵產物的生產，特別是涉及一種建立在同源重組基礎上的基因失活和基因表達的新方法。
許多細菌有天然的代謝能力，通過糖酵解途徑將單糖轉變為酸性和中性發酵產物的混合物。糖酵解是一系列酶促反應，六碳葡萄糖在此過程中降解，經多種中間產物變成兩分子三碳化合物丙酮酸。許多細菌的糖酵解途徑都產生丙酮酸作為普遍的中間產物，接著，丙酮酸代謝生成凈產物NADH和ATP以及通常被認為是發酵產物的副產物。在有氧條件下，大約95％由糖酵解產生的丙酮酸在許多短的代謝途徑中被消耗，同時NAD+經氧化反應再生。在此過程中，NADH被氧化，經一系列的步驟供給氫同劑量的氧以生成水，維持糖酵解的持續進行和ATP的產生。
在無氧條件下，大部分的ATP通過糖酵解形成，其余的ATP也可以在產生有機酸例如乙酸的過程中再生。NAD+是在有機物例如丙酮酸或乙酰CoA的還原過程中由NADH再生的。所以，糖酵解和丙酮酸代謝的發酵產物包括乳酸、甲酸、乙酸等有機酸以及中性產物例如乙醇。
大多數兼性厭氧菌無論在有氧還是無氧條件下都不能大量產生乙醇。它們在丙酮酸脫氫酶(PDH)的作用下經三羧酸循環(TCA)無氧代謝丙酮酸。在無氧條件下，丙酮酸主要的能量代謝途徑是通過丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)途徑提供甲酸和乙酰CoA，然后乙酰CoA經磷酸轉乙酰酶(PTA)和乙酸激酶(AK)作用轉化成乙酸并同時產生ATP，或者，經乙醛脫氫酶(AcDH)和醇脫氫酶(ADH)催化還原為乙醇。為維持反應的計量平衡，糖酵解產生的過量NADH在丙酮酸還原成乳酸時被乳酸脫氫酶(LDH)重新氧化成NAD+。NADH也可以在乙酰CoA還原為乙醇時被AcDH和ADH重新氧化，但當細胞中有功能性LDH存在時，后者就是次要反應。為了促使ATP再生，大部分乙酰CoA轉變成了乙酸，而且糖酵解產生的過量NADH也被LDH氧化，因此，乙醇的理論產量就很低。
產乙醇的微生物，例如Zymomonas mobilis和酵母，有第二種無氧發酵的方式，通常被稱為乙醇發酵。在這種途徑中丙酮酸被丙酮酸脫羧酶(PDC)代謝成乙醛和CO2。然后，乙醛被ADH還原為乙醇同時NAD+再生。乙醇發酵的結果是1分子葡萄糖轉變為2分子乙醇和2分子的CO2。編碼Z.mobilis菌體內這兩種酶的DNA已經被分離、克隆，并且可以在通過以上的合成途徑大量產生乙醇的宿主菌中表達。例如專利US5,000,000和Ingram等人(1997)Biotechnology andBioengineering 58，Nos.2和3已經報道了編碼來源于Z.mobilis的PDC(pdc)和ADH(adh)基因可以摻入到“pet”操縱子，它可用來轉化Escherichia Coli菌株形成共同表達Z.mobilis pdc和adh兩種基因的E.coli重組子。這樣的結果是無論在有氧還是無氧條件下，在E.coli的生長過程中產生了從丙酮酸到乙醇為中心代謝的合成途徑。專利US5554520也有類似報道，來源于Z.mobilis的pdc和adh均可以使用“pet”操縱子整合產生革蘭氏陰性重組宿主菌，包括Erwina.Klebsiella和Xanthomonas品系。這些品系表達Z.mobilis外源基因，通過由丙酮酸到乙醇的合成途徑大量產生乙醇。
專利US5482846報道了用編碼PDC和ADH酶的異源基因同時轉化中溫(mesophilic)革蘭氏陽性菌Bacillus sp，這樣，轉化菌就可以產生乙醇作為它的初級發酵產物，并無報道提及采用pdc基因單獨轉化的細菌能產生乙醇。
EP-A-0761815介紹了一種同源重組的方法，通過這一方法，一個芽胞形成基因被插入到Bcillus thurengiensis中。
EP-A-0603416介紹了一種同源重組的方法，通過這一方法，任意一種基因可被插入到Lactobecillus delbrueckii中。
EP-A-0415297介紹了一種方法，得到可表達一種突變蛋白水解酶的Bacillus菌株。
Biwas等人(J Bacteriol.，175，3628-3635，1993)介紹了一種同源重組的方法，通過這一方法，Lactococcus Lactis的一個染色體基因被攜帶修飾拷貝的質粒所取代。這個方法使用了溫敏性的質粒，所以不能用來轉化嗜熱菌。
生物催化劑催化生產乙醇時，采用耐熱的微生物并在高溫下操作取得了重大進步，糖類轉化為乙醇的速率大大加快。例如在嗜熱Bacillus中的生產乙醇的能力比用傳統的酵母30℃下發酵工藝的能力大10倍。所以，生產能力在一定體積時所需的工廠規模可以減少，工廠的構建費用也相應降低。在高溫下，發酵罐中其它微生物對產物產生污染的可能性減小了，后續操作的時間相應減少，生產能力提高，對原料滅菌時所消耗的能量也降低了。而且，不再要求發酵冷卻，進一步降低了操作費用。發酵產生的熱量有助于乙醇的蒸發，降低了高度的乙醇對菌體的生長抑制，而這是存在于細菌發酵生產的普遍問題。發酵罐上部的乙醇蒸汽也有利于產物回收。
本發明人所用的菌株來自于一種野生型的分離菌，具有天然堆肥能力，比傳統的中溫微生物更適合將農業原料中的糖類轉化為乙醇。這種基礎菌株擁有全部轉化遺傳機器，可把己糖、戊糖以及纖維二糖轉化為乙醇；本發明人只是簡單地阻斷了LDH途徑來提高乙醇產量。這個過程被稱為自我克隆并不涉及外源基因的表達，故符合遺傳修飾有機體(GMO)的安全使用準則。
相反，傳統的生物催化劑要么是不能利用戊糖的良好的乙醇生產催化劑，要么是可以利用戊糖的較差的乙醇生產催化劑。這些有機體已經用復雜的遺傳學技術在遺傳上進行了修飾，這樣它們可以將已糖和戊糖都轉化為乙醇。然而，這些重組有機體的穩定性以及安全性受到懷疑，因為這些有機體達不到GMO的安全準則。此外，重組中溫菌對營養的要求較高，對高鹽濃度和原種抑制物也較敏感。
由代謝反應引起的乳酸的形成(LDH途徑)已經被體內化學誘變所阻斷，因此得到的TN菌株是不產乳酸的，但能大量產生乙醇。然而，這種突變的菌株并不穩定，且會自發回復為產乳酸的野生型。在低pH和高糖環境下，回復突變體比突變體生長快，在連續培養時快速“取代”突變體。隨著“取代”的進行，主要的發酵產物由乙醇變成了乳酸。
本發明人首創了一種分子生物學的方法來解決穩定性問題，并且了解了與乙醇生成有關的遺傳體系。本發明人首選開發了遺傳學技術對有機體進行特異性的操作，連續培養后得到了芽胞形成缺陷型突變體。接著，本發明人對幾個關鍵的代謝基因乳酸脫氫酶(ldh)，乳糖酶通透酶(lp)，醇脫氫酶(adh)和一個新的定位于ldh基因內的插入序列進行測序。來源于化學突變菌株的ldh基因的DNA序列分析結果顯示在編碼區插入一個自發的插入序列元件(IE，也被稱為IS元件)之后使基因失活。轉座入/出ldh基因以及接下來的基因失活本身都是不穩定的，其結果就是產生回復。
本發明人確證ldh基因內的IE序列給同源重組提供了很大的區域，由此推測ldh突變的穩定性是可以提高的，只要將質粒DNA整合到TN菌株ldh基因的IE序列中。
通過質粒和ldh基因插入序列兩者間的特異性同源重組，ldh基因突變的穩定性得到了提高。得到的菌株為芽胞形成缺陷型、兼性厭氧和革蘭氏陽性的Bacillus菌株，在連續培養過程中顯示其生產乙醇能力的提高。以上結果表明新的突變型相當穩定，而且，較之于由體內化學誘變形成的第一代突變型有著更為優越的生長特性和乙醇生產能力。
通過基于同源重組的基因整合的新方法，菌株的質量得到了提高，整合的位點以及用于重組的質粒同樣可以用來整合并過量表達天然的或異源的基因。
Southern雜交分析顯示了有3個拷貝的轉位插入序列元件(IE)存在于Bacillus LLD-R菌株的染色體上。該插入序列長3.2Kb并包含三個可以被翻譯成蛋白質的開放性的閱讀框序列(ORF’s)。ORF1與國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的任何蛋白都無同源性，而istA和istB與一個已知的轉座酶家族有高度的同源性。由LLD-R經體內化學誘變得到Bacillus TN菌株(圖9A和9B)，在結構基因ldh中發現一個拷貝的插入序列，正是這個插入序列使得ldh基因失活，從而得到乳酸陰性的表型，主要的發酵代謝產物也因此由乳酸變成了乙醇。在

圖1中列出了來源于Bacillus TN菌株的ldh基因和IE序列(劃線)的DNA序列，在圖11中列出了L-LDH的氨基酸序列。然而，這種插入并不穩定，TN突變株會自發回復突變成帶有功能性ldh基因的TN-R菌株，主要的發酵代謝產物由乙醇變成了乳酸，如圖2所示。這也表明Bacillus TN突變株在遺傳上的不穩定性。
經PCR擴增，IE序列從TN染色體DNA上獲得，PCR引物選自位于插入序列兩側的ldh基因序列。上游引物加入一個HindIII限制性酶切位點。下游引物加入一個XbaI限制性酶切位點，加入的限制性酶切位點便于下一步克隆到pUBUC質粒中，一個長3.2kb的含有插入序列的PCR片段經HindIII和XbaI限制性內切酶切割后克隆到pUBUC質粒中，得到了pUBUC-IE質粒(圖5)。
質粒DNA經轉化后在攜帶pMETH質粒的E.coli TOP10細胞中擴增并純化，轉化Bacillus sp之后對其進行體內甲基化以防止限制性酶切。甲基化的pUBUC-IE用于轉化Bacillus TN菌株。轉化子首先在52℃下用TGP瓊脂平板(卡那霉素)上分離，再用PCR擴增ldh基因進行篩選。用LDH引物未得到目的PCR產物(在設定的PCR條件下大于10kb)說明至少一個拷貝的質粒已經被整合到染色體中。
新菌株TN-T9在pH穩定且不含卡那霉素選擇的條件下進行連續培養以檢查此菌株的穩定性。采用發酵培養基中含有殘余糖類的亞理想的發酵培養條件和偏向于回復突變的條件，證實了TN-T9菌株的穩定性。750小時的連續發酵除了培養基中殘余的糖類、丙酮酸分泌物和許多與設定條件有所偏離的情況外，沒有任何跡象表明有乳酸產生。在整個發酵過程中，乙醇大量地產生(圖4)，表明在規定的實驗條件下連續培養，TN-T9菌株的ldh基因突變是穩定的。
本發明人對Bacillus TN-T9菌株的細胞生長和乙醇生產選擇了最優化的發酵條件。
總而言之，本發明人發明了一個雙重體系，在此體系中使用pdc/adh操縱子選擇性地表達pdc和adh基因，提高了ldh突變株的穩定性。本發明人分離并測序了一個新的ldh基因和插入序列元件，以及新的乳酸通透酶和乙醇脫氫酶基因。此外，本發明人開發了新的技術，用于質粒DNA與染色體的整合以及篩選重組的Bacillus sp，同時，建立了一系列細菌發酵生產乙醇的最佳化條件。
因此，本發明首要的一個方面是涉及到一種重組的嗜熱革蘭氏陽性細菌，這種菌株通過同源重組的方法轉化使基因突變更加穩定，也有利于可表達基因的插入。
本發明同時詳細介紹了一種重組的嗜熱革蘭氏陽性細菌，它經過質粒和細菌染色體DNA間的同源重組使ldh突變的穩定性得到了提高，形成了一種以產生乙醇作為細菌發酵產物的新菌株。
革蘭氏陽性菌優先是B.thermoglucosidasius菌株。
更可取地，革蘭氏陽性菌已經被攜帶如圖1所示的IE序列或其功能性部分或變體的質粒轉化，并且如圖1所示的IE序列或其功能性部分或變體通過同源重組被穩定地整合到重組菌的染色體中。
更可取地，IE序列整合到重組菌的染色體中會造成天然ldh基因的失活。
更可取地，革蘭氏陽性菌為Bacillus TN-T9菌株(NCINB保藏編號NCIMB 41075，按照布達佩斯條約的條款于2000年9月8日保藏)。更可取地，革蘭氏陽性菌也可選用Bacillus TN-TK菌株(NCINB保藏編號NCIMB 41115，按照布達佩斯條約的條款于2001年9月27日保藏)。
本發明也涉及到一種革蘭氏陽性菌，通過對卡那霉素敏感的TN-T9菌株的突變體篩選獲得。獲得這種菌株的方法在所附的例子中有詳細描述。
更可取地，革蘭氏陽性菌為芽胞形成缺陷型。
本發明的第二個方面是提供一種革蘭氏陽性菌，它的天然ldh基因因同源重組而失活，一個或更多的可表達基因被插入到菌體染色體DNA中。此外，質粒可以單拷貝或多拷貝的方式從多個插入位點整合到插入序列中，由此基因的拷貝數增加，基因表達也得到提高。一個或多個可表達的基因可能被插入到菌體染色體DNA中的一個或多個IE序列中，例如在TN-T9和TN-TK兩種菌株的染色體上有三個IE序列。
表達的基因對Bacillus而言可能是天然存在的，例如乙醇脫氫酶，或者是外源的(即異源的)，例如來源于Z.mobilis的丙酮酸脫羧酶和來源于B.stearothemophilus的α-淀粉酶，這些基因在相同的轉錄控制下被重排到一個操縱子中，基因表達可以通過增加基因的拷貝數和使用不同的轉錄啟動子序列調控。
一個或多個基因優先是pdc和/或adh。
adh的氨基酸序列如圖12所示。
本發明的第三個方面是提供一種方法，通過同源重組使天然1dh基因失活，同時一個或多個可表達基因插入到菌體的染色體中。
細菌優先是嗜熱革蘭氏陽性菌。
更可取地，失活基因為天然的ldh基因，一個或多個可表達基因為pdc基因和adh基因。
更可取地，pdc基因和adh基因形成PDC操縱子的一部分，PDC操縱子與圖1所示的IE序列在同一個質粒上連接。
更可取地，pdc基因是與細胞異源。
更可取地，圖1所示的IE序列和PDC操縱子或其一部分被穩定地整合到菌體的染色體上。
更有利地，基因失活和表達的方法包括使用一個穿梭載體，如圖5所示，它能夠在高達54℃的溫度下在E.coli和Bacillus sp菌株中復制。
本發明的第四個方面是提供一個穿梭載體，它能夠在高達54℃的溫度下在E.coli和Bacillus sp菌株中復制，它有氨芐青霉素和卡那霉素抗性并攜帶來源于Bacillus TN菌株的如圖1所示的IE序列或其一部分。
穿梭載體優先是pUBUC-IE質粒，如圖5所示。
更可取地，穿梭載體包含一個PDC操縱子，PDC操縱子包含一個pdc基因和一個adh基因，受ldh啟動子的控制，與圖1所示的IE序列連接。
本發明的第五個方面是提供一種在高溫下篩選Bacillus sp重組子的方法，包括質粒DNA經同源重組穩定地整合到重組子細菌的ldh基因中，以及用PCR篩選不含天然ldh基因和IE序列的重組子。
更可取地，來源于重組菌ldh基因的PCR擴增失敗，顯示了插入序列成功地整合到ldh基因中。
本發明也提供一個或多個多肽，它們由如圖1所示的從第652個核苷酸到第3800個核苷酸序列，或其功能性變體或其一部分編碼，這些多肽都有轉座酶的生物活性。
這些多肽無論是單獨存在還是與其余多肽結合都有轉座酶的生物活性。
更可取地，這些多肽的氨基酸序列可如圖13，圖14或圖15所示，或者為其功能性的一部分或為其變體。
功能性的部分或變體至少保留如圖13，圖14或圖15所示多肽的轉座酶功能部分，且至少含20個氨基酸，更好至少含50個。此外，比較好地其變體與如圖13，圖14或圖15所示的多肽至少有80％的同源性，90％的同源性更好，95％的同源性最好。同源性是優先用BLAST程序檢測。
本發明的第六個方面提供如圖6所示的一段DNA序列或其功能性變體，這段序列編碼一個具有乳酸脫氫酶生物活性的多肽。
本發明的第七個方面提供如圖7B所示的一段DNA序列或其功能性變體，這段序列編碼一個具有乳酸通透酶生物活性的多肽。
本發明的第八個方面提供如圖8所示的一段DNA序列或其功能性變體，這段序列編碼一個具有乙醇脫氫酶生物活性的多肽。
在本說明書中，功能性變體含有序列增加、刪除或替代得到的DNA序列，或含有遺傳密碼子簡并性、雜交和/或編碼一個有乳酸脫氫酶、乳酸通透酶或乙醇脫氫酶活性多肽的DNA序列。更可取地，這些變體與如圖所示的序列至少有80％的同源性，90％的同源性更好，95％的同源性最好。同源性是優先用BLAST程序檢測。
本發明的第九個方面是提供一種提高ldh突變體穩定性的方法，包括使用pdc/adh操縱子表達基因。
本發明的第十個方面涉及與本發明相關的重組Bacillus sp的整合和篩選的技術。
本發明最后的第十一個方面，是提供用革蘭氏陽性菌發酵生產乙醇的工藝方法，包括細胞生長和乙醇生產的pH值、溫度、氧還值和特異稀釋率等發酵條件的最佳化選擇。發酵條件優先選用5.5-5.7的pH范圍，40-75℃的溫度范圍，-360--400mV的氧還值以及0.3-0.8h-1的稀釋率。
附圖的簡單說明按照本發明重組菌的生產將僅以舉例的方式描述，參考的附圖如下圖1含有一個插入元件(IE)的DNA序列的核苷酸序列，其中IE序列用下劃線標明；圖2遺傳學不穩定的TN菌株的示意圖；圖3 Bacillus TN突變菌內經單交換重組使LDH基因失活的方法示意圖；圖4 Bacilluc TN-T9突變株750小時連續培養穩定性的線圖；圖5穿梭載體pUBUC-IE的示意圖；圖6一種新的來源于Bacillus LN菌株乳酸脫氫酶的DNA序列及氨基酸序列；圖7A一種新的來源于Bacillus LN菌株乳酸通透酶的部分DNA序列及氨基酸序列；圖7B一種新的來源于Bacillus LN菌株乳酸通透酶的完整DNA序列及氨基酸序列；圖8一種新的來源于Bacillus LN菌株乙醇脫氫酶(劃線)的DNA序列；圖9(A)Bacillus TN-T9菌株的獲得的示意圖；(B)Bacillus TN-T9和TN-TK菌株的獲得的示意圖；圖10人工PDC操縱子結構示意圖；圖11來源于TN菌株的L-乳酸脫氫酶(ldh)氨基酸序列；圖12來源于TN菌株的乙醇脫氫酶(adh)氨基酸序列；圖13 IE序列編碼的轉座酶的氨基酸序列；圖14 IE序列編碼的轉座酶的氨基酸序列；圖15 IE序列編碼的轉座酶的氨基酸序列。
實施例材料和方法pUBUC質粒結構用于E.coli和發明人的嗜熱Bacillus菌株間DNA轉移的穿梭載體由質粒pUC18和pUB110融合得到。質粒pUB110是一種從Staphyloccocus aureus分離得到的廣泛使用的載體，它有卡那霉素的抗性，并且可以在高達54℃的溫度下在B.stearothermophilus中復制(Narumi et al.，1992 Biotechnology Techniques 6.No.1)。質粒pUB110和pUC18在EcoRI和BamHI的作用下線性化并連接在一起形成pUBUC質粒(6.4kb)。質粒pUBUC有一個溫敏型復制子，當溫度超過54℃時，由于發生了較高溫度下的同源重組，質粒不能復制，而在54℃時，卻是一個用于基因整合的理想宿主。
質粒pMETH的結構以Haemophilus aeygptius染色體DNA為模板經PCR擴增得到一段長1.1kb含有met基因的片段，并經過DNA測序的檢驗。met基因被BamHI和XbaI酶切，然后再被亞克隆到已用BamHI和XbaI線性化的表達質粒pCL1920中。所形成的質粒pMETH轉化到E.coli TOP10細胞中，攜帶pMETH的E.coli TOP10細胞被增殖，收集培養物用于下一步轉化，并在體內甲基化，所用方法見Tang et al(1994)Nuc.Acid Res.22(14)。感受態細胞在轉化前于-70℃下分裝保存。
PCR擴增以TN染色體DNA為模板經PCR擴增獲得IE序列，所用引物為LDH7和LDH8，采用ExpandTM高保真性PCR系統(RocheDiagnostics)推薦的反應物濃度及PCR程序。凍干細胞的PCR擴增在Genius thermocycler(Techne.Ltd.Cambridge)上進行，30個循環即可。上游引物LDH7為5’-AAGCTTGAT GAA ATC CGG ATT TGA TGG-3’，下游引物LDH8序列為5’-TCTAGAGCT AAA TTT CCA AGT AGC-3’。這些引物選自位于插入序列兩側的ldh基因序列。上游引物加入一個HindIII限制性位點，下游引物加入一個XbaI限制性位點，為下一步克隆建立適當的酶切位點(加入的位點有下劃線表明)。
質粒pUBUC-IE的結構E.coli質粒DNA的操作、轉化和分離根據標準程序(Maniatis)進行。長3.2kb含有插入序列的PCR片段用HindIII和XbaI酶切并克隆到質粒pUBUC中。得到了被稱為pUBUC-IE(圖5)的穿梭質粒，它可以在高達54℃的溫度下在E.coli和Bacillus菌株中復制，有氨芐青霉素和卡那霉素抗性，并攜帶來源于Bacillus TN菌株的IE序列。
PDC操縱子的結構通過PFL或者PDH途徑Bacillus TN菌株將細胞內代謝物丙酮酸轉變為乙酰CoA。乙酰CoA由AcDH或ADH催化，分別還原為乙醛和乙醇。外源PDC酶的導入給細胞提供了另一種生產乙醇的途徑，就是使丙酮酸經PDC催化脫羧形成乙醛，再經天然ADH酶催化還原為乙醇。PDC和ADH都參與了丙酮酸到乙醇的轉變。
我們的結果已經顯示了來源于質粒pZP-1的Z.mobilis pdc的表達促進了細胞的生長，提高了TN突變株的穩定性。然而，乙醇生成并無顯著增加。所以我們決定增加pdc基因的表達并共表達來源于Bacillus TN菌株的天然adh基因。
在質粒pZP-1中，pdc基因被置于來源于B.stearothermophilusNCA1503的ldh啟動子序列的控制之下。我們決定用來源于Bacillus LN的ldh啟動子替換原啟動子(結構1)。然后將來源于Bacillus TN菌株的adh基因置于ldh啟動子的控制下(結構2)。最后，pdc(來源于Z.mobilis)和adh(來源于Bacillus LN)都被置于ldh啟動子的控制下(結構3)。所有來源于Z.mobilis(pdc)和Bacillus LN菌株(ldh啟動子和pdc)的基因經PCR擴增，用適當的限制性酶切，連接在一起并克隆到E.coli質粒載體中。三個載體被克隆到復制型穿梭載體pUBUC，pFC1或整合型穿梭載體pUBUC-1E中用于染色體整合。
實施例1TN的轉化質粒pUBUC-1E經轉化，在攜帶質粒pMETH的E.coli TOP10細胞中增殖并純化，之后在體內甲基化。然后，用甲基化的pUBUC-1E轉化Bacillus TN菌株。Bacillus菌株細胞于65℃時在50ml TGP培養基中生長直至600nm(A600)處光吸收值達到0.5-0.6，培養物置于冰上預冷15-30min。細胞經離心收集用10ml冷的TH緩沖液(272mM海藻糖和8mM HEPES，KOH調pH至7.5)洗一次，再用5ml冷的TH緩沖液冼二次。細胞沉淀用400μl TH緩沖液重懸，在電穿孔前于4℃保存。用甲基化的質粒DNA電轉化TN菌株，詳細步驟見Narumi et al(1992)Biotechnology Techniques 6(1)。感受態細胞90μl等量分裝，分別與2μl甲基化的質粒DNA(250ng/μl)混合。混合物轉到冷的電轉杯(0.2cm電極缺口)，冰上孵育5分鐘，然后，細胞懸液置于由25μF電容提供的2.5kV電場中，脈沖通過EquiBio EasyJect電穿孔儀控制在201ohms(時間恒定，τ＝5ms)。細胞快速轉入5ml預熱的TGP中，于52℃孵育1小時，鋪于TGP瓊脂板(10μg/ml卡那霉素)上。平板于52℃孵育24-48小時。
重組子的篩選下面的方法用于篩選溫敏型質粒pUBUC-1E的染色體經同源重組整合得到的重組子1、轉化子于52℃在5ml TGP(卡那霉素)培養基中生長24小時。
2、50ml新鮮TGP(卡那霉素)培養基用1ml上述培養物接種，于52℃振蕩水浴中溫育直至OD600達到0.5左右。
3、15ml上述培養物于5℃，4100rpm離心5分鐘，沉淀用150μl TGP(10μg/ml卡那霉素)培養基重懸，鋪于TGP(卡那霉素)平板上。
4、平板在68℃溫育16小時。
5、挑選單菌落，用PCR分析質粒整合到插入序列的位點。
TN整合體的篩選TN整合體在68℃時分離，對TN整合體用LDH引物經PCR擴增無法得到產物，說明至少有一個拷貝的質粒pUBUC-1E已經被整合到染色體中，整合的結果是，新的TN-T9菌株比親本的TN菌株對ldh回復突變和“取代”更加穩定。
TN-T9菌株的穩定性發酵在亞優化條件下進行，即培養基中含殘余的糖類，有利于回復突變的條件。連續發酵750多小時，除了培養基中殘余的糖類、丙酮酸分泌物和許多與設定條件有所偏離的情況外，沒有任何跡象表明有乳酸產生。整個發酵過程中乙醇產量相當大，且未用卡那霉素來選擇整合體。以上結果顯示，TN-T9菌株在實驗條件下(pH7.0，65℃，含2％糖類)連續培養，其ldh基因突變是穩定的。
乙醇產量和生產能力以葡萄糖、木糖和葡萄糖/木糖為原料生產乙醇的發酵條件已經最優化選擇培養類型連續溫度65℃pH 6.8加料糖濃度 2-10％噴射氣體空氣氧還值 大于-350mV(通過空氣流速控制)稀釋率 0.36-0.6h-1在這樣的條件下，乙醇產量為0.4-0.5g/g糖。采用0.5h-1的稀釋率，2％和4％糖濃度加料分別可以得到大約4和8g乙醇/升/小時的乙醇生產能力。
實施例2卡那霉素敏感的TN-TK菌株的篩選Bacillus TN-TK是一種卡那霉素敏感的TN-T9衍生菌株。它對ldh突變相當穩定，對以卡那霉素作為選擇標記的質粒表達是一個理想的宿主。
TN-T9首先于68℃在5ml補加卡那霉素(10μg/ml)的TGP培養基中生長24小時，大約100ml培養物鋪于兩塊TGP(km)瓊脂板上，68℃孵育過夜。得到幾百個菌落，將其中100個菌落用無菌牙簽轉移到新鮮的TGP(km)平板，68℃過夜生長之后，菌落(通過影印鋪板)轉移到新鮮的TGP平板和TGP(km)平板，68℃過夜培養。
在TGP平板而非相應的TGP(Km)平板上得到兩個卡那霉素敏感的菌落。來自于這兩個菌落的ldh區域經PCR擴增，其大小與來源于TN-T9(親本菌株)的被打斷的ldh基因相當。用PCR證明菌株已經失去了卡那霉素抗性的基因。篩選出來一個稱為TN-TK的衍生菌株用于進一步生長實驗。以上的實驗證實了卡那霉素敏感性和ldh突變都是相當穩定的。
序列表<110>穆罕默德·賈維德法伊奧納·庫斯丁保羅·邁爾納愛德華·格林<120>乙醇生產<130>P101090PCT<140>PCT/GB 01/04434<141>2001-10-05<150>US 60/247,017<151>2000-11-13<150>UK 0024554.8<151>2000-10-06<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4913<212>DNA<213>Bacillus TN菌株<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(4913)<223>n＝A，T，C or G<400>1agggcaatct gaaaggaagg gaaaattcct ttcggattgt ccttttagtt atttttatgg60ggagtgaata ttatataggc attacggaaa tgataatggc agagtttttt catttattag120actgcttgat gtaattggat gtgatgatac aaaaataatg ttgtgtaaac aaaatgttaa180caaaaaagac aaatttcatt catagttgat acttgataaa gattgtgaaa taatgcacaa240tatatcaatg tatgagcagt ttcacaaatt cattttttgg aaaggatgac agacagcgat300gaaacaacaa ggcatgaatc gagtagcact tataggaacg gggttcgttg gggccagcta360tgcatttgcc cttatgaacc aaggaatagc agatgagtta gtattgattg atgtaaataa420gaataaggca gagggcgatg tgatggattt aatcacggaa aagtattcgc gccgaagccg480atgaatattt ggtttggaga ttatcaagat tgccaagacg ccgatttggt ggtgatttgt540gcaggggcta accaaaagcc gggagaaaca agactggatc ttgttgacaa aaatattaat600atcttcaaaa cgattgtcga ttctgtgatg aaatccggat ttgatggcgt tangtcttgt660tgtaaattat cactttattt ccgcacaaaa aagactcttt tttgcacatt ccttcggaat720atccctctcc ccctttccga aagaatgtgc taaatttttt gtgaattatt tcggaatggg780acatgggtga tttccagagg ggggacgagg acgtgattcg gtttcatgac tttcaggtcg840atgtccagac atatgcccag cggggaaaac aaaacgactt tccccttctt aagcggtgcc900ctcattgcca ggcaaaacgc cctctttatc gccatgggta ctacgaacga aatgccgtga960cgtcgcatca gtcttatcgc atttggatcg ctcggtatcg ctgcccggag tgcaggagga1020cggtggccgt gttgccttca tttcttctcc cttattttca gtatacgttg cccaccacat1080ggagagtggt gaaagaacgg ttgggcctga ctccgaaacg ggggatggag gaggctccac1140tccttcctac ggatgaaggg gttttatttt atgtcccgac gtttattccg aaatttgaac1200caccttcatt ggttttttgc ggagcgctgg gagaaaaatt ggtcctgcca tcgcccaagc1260cgagagaacg agccctatgg tggatccaga cgatggagga gatcggcctc tttttcgtca1320tccaagagat atgggagcac cgatcgacgc atctttttgc acgtacattc agttcctgat1380ttacttatat ccccttatat ggaatcattt atagattccc aaacctttcc tctcgacggt1440cgggggaatg atccgatagg atagagacag gatggaccga taaggtccta gaatgggatg1500aacgaaggag gagatcgaaa tgaatgagtc gatgagacag gagatcgctt tatttcggta1560tggattgatc gctccattgg tgaatggaca agtcgatcca aaaacgtact tgaaggaagt1620agcggaacgg atccatcaag ttccccacca tggagagaaa cgcatcgccg ccaaaacgat1680
cctcgactgg tgcacgcagt acaaaaaagg gggctttgag gcgctgaagc cgaaacgacg1740gtcggaccgt ggccattccc ggaggctgtc acctgaagaa gaggatcaca ttttagccct1800gagaaaaaaa cacccccaca tgcccgtgac ggtgttttac caacacctta tcgagcaggg1860ggaaatccaa tccatctctt atttcactat ataccgactt ttaaaaaaat acaacctcgt1920ggggaaagaa attttaccga ttcctgaacg aaaacgattc gcgtacgatc aggtcaatga1980gctctggcaa ggtgatttgt cccatggccc gttgattcgc gtgaatggca aaacgcaaaa2040aacgtttttg attgcctata tcgatgactg ctcgcgggtc gtgccgtacg ctcagttttt2100ctcttccgag aaatttgacg ggttgcggat cgtaaccaag gaagcgctgc ttcgatacgg2160aaagccgaag cgaatttact cggataacgg caagatttat cgggcggaac ccttgcagta2220cgcctgcgcg gagttaggga tcaccttgat ccatacccag ccgtacgatc cgcaaagcaa2280agggaaaatc gaacgatttt tccgcaccgt acagacgcgg ttttacccgt tgctcgaaat2340gaattcaccg aagtcgctcg aagagctaaa cgagcgattt tggaagtggt tggaggaaga2400ttaccatcga aaaccgcatg cctcgttgaa cgggaagacg ccacatgaag tgtttcaatc2460gcaagtccat ttggtgtcgt tcgtcgagga ttcggattgg ctcgactcga tctttttgaa2520acgcgaatac cgtaaagtga aggccgatgg tacggtcacg ttgaacaagc agctgtatga2580agttccgccc cggttcatcg gacaatcgat cgaactccgt tatgatgaac aaggcgtgta2640tgtgtacgaa gacggtcaac gggtcgccga agcggtcctt gttcgcttcg aggacaatgc2700ctatgtgaaa cgccatcggt caccgtttgc ggcggttccg gtagagggag gcgaaaacga2760tgtataaaac gttttattcc ctttcccgag agccgttttc gaaggagacg aatccaccag2820aggcttatca aggggcctcg tatcaagagg ccctcgccgc tttggactac gtgaaacgaa2880caagagggat cgggctattg atcggtgaac caggggccgg caagacattc gcccttcggg2940cgtttaagga atccctgaat ccgtcactgt atcacgtcgt ttattttcca ttgtcaacgg3000gaagcgtgat ggacttttat cgcggccttg ccttcgggct cggggaagag ccgaaatacc3060gcaaggtcga cttgttttat caaatccaac aagggatcga gcgcttgtat catgaacaac3120gggtaacgtc agtgttcatc ctcgatgaaa tgcatttagc gaaggatgcc tttctgcagg3180atatcgcgat cctgttcaac tttcacatgg actcaacaaa tccgtttgtc ttgattttgg3240cggggctgcc ccatttacag gcaaaactac ggttgaaatc aacaccgtcc gcttcaccaa3300cgaatcatca tgcgatacca gatggggcct cttgataagg aagaagtggt aggatatatc3360gaacaccgct gaaacaggcg ggggcgaaac acccgatttt taccccagct gccttagaag3420cgatcgccct gcagtcgcag gggtggccgc ggatcatcaa caacctcgcc accacttgcc3480tgttatacgg cgctcaatta aaaaaacata tgattgacga agacattgtg cgtatggcag3540ccgaagaaat ggggtactga cacagcaggg gctgatcggc ccctgttatg tttcatcccg3600atccatcctc attctagtta atcatccgaa ataatgtgca aatgttcgga aataatctgc3660aaaacctgga ataattcgca aagattttgc acattatttc cgaatccgtc cgaaataatt3720tgaaaaaggg attctgaaat aatgtgctaa tttacatttc ttgtggcaac gaacccagtg3780gatattttaa cgtatgctac ttggaaattt agcgggttac cgaaagagcg ggtaatcggc3840tcaggaacga ttcttgatac agcaagattc cgcttcttgc taagtgaata ttttcaagtg3900gctccgacca atgtacatgc gtatattatt ggcgagcatg gggatacaga gctgcctgtt3960tggagccatg cggaaattgg aagcattcca gttgagcaaa tattgatgca aaacgataac4020tatagaaaag aggatttaga caatatcttt gttaatgttc gtgatgcggc atatcaaatc4080attgagaaaa aaggggcaac gtattacggc attgcaatgg gattagtccg tatcactcgt4140gctattttgc acaatgaaaa tgccatctta accgtttctg ctcatttgga cggccaatat4200ggcgaacgaa atgtttatat tggcgtgcct gccattatca accgaaacgg tattcgtgaa4260gtgatggaat tgacgctaaa tgaaacagaa caacaacaat tccatcatag tgtaactgta4320ttaaaagaca ttctttcccg ttattttgat gatgtaaaat aatactgact ttgaatacaa4380caaggtgaac atcgtgtgga tacaacatta caatcccttg cataacacat atctttcggc4440atttattgcg gcgtttccga tcgttttatt tctattatgc ttaactgtgt ttaggatgag4500gggagtaaaa gccgcttttc tcattctttg ttttggttta gtaacagctg ttttgttttt4560ccatatgtcg atttcaaagg cgattgctgc gtccgtctat ggaatcgcaa acggtttatg4620gccgattggc tatattgtga ttatggccgt ctggctgtat aaaattgctg tgaaaacggg4680gaaatttgat attatccgca gcagtattgc aaacatttcg gaggatcagc ggcttcaact4740gctgctcatc ggctttagct ttaatgcttt tttagaagga gctgcaggat tcggtgttcc4800gattgccatt tcggctgctt tgctttcaga actaggattt catccattaa aagcggccgc4860gctttgctta attgccaatg ctgcctctgg cgcgtttgga gcgataggaa ttc 4913<210>2<211>1255<212>DNA<213>Bacillus LN<400>2agggcaatct gaaaggaagg gaaaattcct ttcggattgt ccttttagtt atttttatgg60ggagtgaata ttatataggc attacggaaa tgataatggc agagtttttt catttattag120actgcttgat gtaattggat gtgatgatac aaaaataatg ttgtgtaaac aaaatgttaa180caaaaaagac aaatttcatt catagttgat acttgataaa gattgtgaaa taatgcacaa240tatatcaatg tatgagcagt ttcacaaatt cattttttgg aaaggatgac agacagcgat300
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<212>DNA<213>Bacillus LN<400>4gtgaacatcg tgtggataca acattacaat cccttgcata acacatatct ttcggcattt60attgcggcgt ttccgatcgt tttatttcta ttatgcttaa ctgtgtttag gatgagggga120gtaaaagccg cttttctcat tctttgtttt ggtttagtaa cagctgtttt gtttttccat180atgccgattt caaaggcgat tgctgcgtcc gtctatggaa tcgcaaacgg tttatggccg240attggctata ttgtgattat ggccgtctgg ctgtataaaa ttgctgtgaa aacggggaaa300tttgatatta tccgcagcag tattgcaaac atttcggagg atcagcggct tcaactgctg360ctcatcggct ttagctttaa tgctttttta gaaggagctg caggattcgg tgttccgatt420gccatttcgg ctgctttgct ttcagaacta ggatttcatc cattaaaagc ggccgcgctt480tgcttaattg ccaatgctgc ctctggcgcg tttggagcga taggaatt 528<210>5<211>176<212>PRT<213>Bacillus LN<400>5Val Asn Ile Val Trp Ile Gln His Tyr Asn Pro Leu His Asn Thr Tyr1 5 10 15Leu Ser Ala Phe Ile Ala Ala Phe Pro Ile Val Leu Phe Leu Leu Cys20 25 30Leu Thr Val Phe Arg Met Arg Gly Val Lys Ala Ala Phe Leu Ile Leu35 40 45Cys Phe Gly Leu Val Thr Ala Val Leu Phe Phe His Met Pro Ile Ser50 55 60Lys Ala Ile Ala Ala Ser Val Tyr Gly Ile Ala Asn Gly Leu Trp Pro65 70 75 80Ile Gly Tyr Ile Val Ile Met Ala Val Trp Leu Tyr Lys Ile Ala Val85 90 95Lys Thr Gly Lys Phe Asp Ile Ile Arg Ser Ser Ile Ala Asn Ile Ser100 105 110Glu Asp Gln Arg Leu Gln Leu Leu Leu Ile Gly Phe Ser Phe Asn Ala115 120 125Phe Leu Glu Gly Ala Ala Gly Phe Gly Val Pro Ile Ala Ile Ser Ala130 135 140Ala Leu Leu Ser Glu Leu Gly Phe His Pro Leu Lys Ala Ala Ala Leu145 150 155 160Cys Leu Ile Ala Asn Ala Ala Ser Gly Ala Phe Gly Ala Ile Gly Ile165 170 175<210>6<211>1704<212>DNA<213>Bacillus LN<400>6gtgaacatcg tgtggataca acattacaat cccttgcata acacatatct ttcggcattt60attgcggcgt ttccgatcgt tttatttcta ttatgcttaa ctgtgtttag gatgagggga120gtaaaagccg cttttctcat tctttgtttt ggtttagtaa cagctgtttt gtttttccat180atgccgattt caaaggcgat tgctgcgtcc gtctatggaa tcgcaaacgg tttatggccg240attggctata ttgtgattat ggccgtctgg ctgcataaaa ttgctgtgaa aacggggaaa300tttgatatta tccgcagcag tattgcaaac atttcggagg atcagcggct tcaactgctg360ctcatcggct ttagctttaa tgctttttta gaaggagctg caggattcgg tgttccgatt420gccatttcgg ctgctttgct ttcagaacta ggatttcatc cattaaaagc ggccgcgctt480tgcttaattg ccaatgctgc ctctggcgcg tttggagcga taggaattcc ggttattgtc540ggagcgcaaa tgggggattt aacgccgatt gagttatccc gtacgcttgc ttggattttg600ccgtttatct cgtttctcat tccattctta ttagtgtttg tcttggataa gtggaagggt660attaaagaaa cattgcctgc tcttttcgtg gtaagcggaa gttacaccat tgtccaaaca720ttgacgatca ttgtgcttgg tcctgagctg gccaacattt tagcggcgct tgtcagcatg780ggggcactgg ctcttttctt gagaaaatgg cagccttcaa atatatatcg agtgaatccg840gatgaaaaag gcggagaaaa atgcaaatac agcttgaaag acatcatcag tgcgtggtcc900ccgttttata ttttaacggt gctcgttatt atatggagtc tgcctggttt taaagctctg960tttgccgagg gaggcgcact gcagcgaacg acgcttttgt ttaaggtgcc atttttgcat1020
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370 375 380Asn Ile Thr Phe Ala Glu Gly Ile Gln Ser Leu Lys Glu Thr Cys Lys385 390 395 400Glu Leu Phe Ile Pro Val Leu Thr Ile Cys Phe Ile Met Gly Phe Ala405 410 415Asn Leu Ala Asp Tyr Ala Gly Leu Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ala Leu420 425 430Ala Glu Thr Gly Asp Ala Phe Pro Phe Val Ser Pro Leu Leu Gly Trp435 440 445Leu Gly Val Phe Ile Thr Gly Ser Val Val Ser Asn Asn Ala Leu Phe450 455 460Gly His Leu Gln Ala Val Thr Gly Ala Gln Ile Gly Thr Ser Ser Ser465 470 475 480Leu Leu Leu Ala Ala Asn Thr Ser Gly Gly Val Met Gly Lys Leu Ile485 490 495Ser Pro Gln Ser Ile Ala Ile Ala Thr Ala Ala Val Lys Glu Thr Gly500 505 510Lys Glu Ser His Leu Phe Lys Met Thr Ile Tyr ryr Ser Leu Ile Leu515 520 525Leu Leu Phe Val Gly Val Trp Thr Tyr Phe Leu Ser Thr Ala Gly Met530 535 540Ile Ile Met Val Cys Tyr Ser Val Arg His Arg Val Met Lys Lys Asp545 550 555 560Val Phe Cys Gly Leu Phe565<210>8<211>1573<212>DNA<213>Bacillus LN<400>8gtggctccaa gctatgtatt tttagcaagc gaagaggcat cctatattac ggggcaaatg60atacatgtga atggcggaaa gattgtcaat ggatagaaag cggcggaaaa cggaacgttc120ttcatgactg cgcaaatttt atgtaatatt ttctgacata gttgttgtgc ggtctgtata180tcaccgttat gataaaaata catgctattt cttatccatg ttcctcaacc ttttgtatgg240attgcaaaag gcatcctctc ttccttcact tgcaacaatt tattgcaagt ttttgtgtat300ttaggaatat tatatgccgc atcaacggac aggcaatgtg aacaaagctg ctccaaacat360aacatattat tgatatttct tgaaatatta ctaatatttt gattaaatgt ttttgtttgc420actgcagctt ttacaaaagt agaatatttt atggtgttta tccgaagaat atcatcatga480taccctatgg gagggaattg tgatgaaagc tgcagtagta gagcaattta aggaaccatt540aaaaattaaa gaagtggaaa agccatccat ttcatatggc gaagtattag tccgcattaa600agcatgcggt gtatgccata cggacttgca tgccgctcac ggcgattggc cagtaaaacc660aaaacttcct ttaatccctg gccatgaagg agtcggaatt gttgaagaag tcggtccggg720ggtaacccat ttaaaagtgg gagaccgcgt tggaattcct tggttatatt ctgcttgcgg780ccattgcgaa tattgtttaa gcggacaaga gacattatgt gaacatcaag aaaacgccgg840ctactcagtc gacggggggt atgcagaata ttgcagagct gcggcagact atgtggtgaa900aattcctgac aacttgtcgt ttgaagaagc tgctcctatt ttctgcgccg gagttactac960ttataaagcg ttaaaagtca caggtacaaa accgggagaa tgggtagcga tctatggcat1020cggtggcctt ggacatgttg ccgtccagta tgcgaaagcg atggggcttc atgttgttgc1080agtggatatc ggcgatgaga aactggaact tgcaaaagag cttggcgccg atcttgttgt1140aaatcctgca aaagaaaatg cggcacaatt tatgaaagag aaagtcggcg gagtacacgc1200ggctgttgtg acagctgtat ctaaacctgc ttttcaatct gcgtacaatt ctgtccgcag1260aggcggcacg tgcgtgcttg tcggattacc gccggaagaa atgcctattc caatctttga1320tacggtatta aacggaatta aaattatcgg ttccattgtc ggcacgcgga aagacttgca1380agaagcgctt cagttcgctg cagaaggtaa agtaaaaacc attattgaag tgcaacctct1440tgaaaaaatt aacgaagtat ttgacagaat gctaaaagga gaaattaacg gacgggttgt1500tttaacgtta gaaaataata attaacgtca acaacacaat gttgacaacc cggcattcta1560gggctgtctc atc 1573<210>9<211>319<212>PRT<213>Bacillus TN菌株<400>9
Met Lys Gln Gln Gly Met Asn Arg Val Ala Leu Ile Gly Thr Gly Phe1 5 10 15Val Gly Ala Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Met Asn Gln Gly Ile Ala Asp20 25 30Glu Leu Val Leu Ile Asp Val Asn Lys Asn Lys Ala Glu Gly Asp Val35 40 45Met Asp Leu Asn His Gly Lys Val Phe Ala Pro Lys Pro Met Asn Ile50 55 60Trp Phe Gly Asp Tyr Gln Asp Cys Gln Asp Ala Asp Leu Val Val Ile65 70 75 80Cys Ala Gly Ala Asn Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val85 90 95Asp Lys Asn Ile Asn Ile Phe Lys Thr Ile Val Asp Ser Val Met Lys100 105 110Ser Gly Phe Asp Gly Val Phe Leu Val Ala Thr Asn Pro Val Asp Ile115 120 125Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Leu Pro Lys Glu Arg Val130 135 140Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Phe Leu Leu145 150 155 160Ser Glu Tyr Phe Gln Val Ala Pro Thr Asn Val His Ala Tyr Ile Ile165 170 175Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser His Ala Glu Ile180 185 190Gly Ser Ile Pro Val Glu Gln Ile Leu Met Gln Asn Asp Asn Tyr Arg195 200 205Lys Glu Asp Leu Asp Asn Ile Phe Val Asn Val Arg Asp Ala Ala Tyr210 215 220Gln Ile Ile Glu Lys Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala Met Gly225 230 235 240Leu Val Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu His Asn Glu Asn Ala Ile Leu245 250 255Thr Val Ser Ala His Leu Asp Gly Gln Tyr Gly Glu Arg Asn Val Tyr260 265 270Ile Gly Val Pro Ala Ile Ile Asn Arg Asn Gly Ile Arg Glu Val Met275 280 285Glu Leu Thr Leu Asn Glu Thr Glu Gln Gln Gln Phe His His Ser Val290 295 300Thr Val Leu Lys Asp Ile Leu Ser Arg Tyr Phe Asp Asp Val Lys305 310 315<210>10<211>340<212>PRT<213>Bacillus TN菌株 TN<400>10Met Lys Ala Ala Val Val Glu Gln Phe Lys Glu Pro Leu Lys Ile Lys1 5 10 15Glu Val Glu Lys Pro Ser Ile Ser Tyr Gly Glu Val Leu Val Arg Ile20 25 30Lyg Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala His Gly Asp35 40 45Trp Pro Val Lys Pro Lys Leu Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Gly Val50 55 60Gly Ile Val Glu Glu Val Gly Pro Gly Val Thr His Leu Lys Val Gly65 70 75 80Asp Arg Val Gly Ile Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly His Cys Glu85 90 95Tyr Cys Leu Ser Gly Gln Glu Thr Leu Cys Glu His Gln Glu Asn Ala100 105 110Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Tyr Ala Glu Tyr Cys Arg Ala Ala Ala115 120 125Asp Tyr Val Val Lys Ile Pro Asp Asn Leu Ser Phe Glu Glu Ala Ala130 135 140Pro Ile Phe Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Val Thr
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<213>Bacillus<400>12Met Asn Glu Ser Met Arg Gln Glu Ile Ala Leu Phe Arg Tyr Gly Leu1 5 10 15Ile Ala Pro Leu Val Asn Gly Gln Val Asp Pro Lys Thr Tyr Leu Lys20 25 30Glu Val Ala Glu Arg Ile His Gln Val Pro His His Gly Glu Lys Arg35 40 45Ile Ala Ala Lys Thr Ile Leu Asp Trp Cys Thr Gln Tyr Lys Lys Gly50 55 60Gly Phe Glu Ala Leu Lys Pro Lys Arg Arg Ser Asp Arg Gly His Ser65 70 75 80Arg Arg Leu Ser Pro Glu Glu Glu Asp His Ile Leu Ala Leu Arg Lys85 90 95Lys His Pro His Met Pro Val Thr Val Phe Tyr Gln His Leu Ile Glu100 105 110Gln Gly Glu Ile Gln Ser Ile Ser Tyr Phe Thr Ile Tyr Arg Leu Leu115 120 125Lys Lys Tyr Asn Leu Val Gly Lys Glu Ile Leu Pro Ile Pro Glu Arg130 135 140Lys Arg Phe Ala Tyr Asp Gln Val Asn Glu Leu Trp Gln Gly Asp Leu145 150 155 160Ser His Gly Pro Leu Ile Arg Val Asn Gly Lys Thr Gln Lys Thr Phe165 170 175Leu Ile Ala Tyr Ile Asp Asp Cys Ser Arg Val Val Pro Tyr Ala Gln180 185 190Phe Phe Ser Ser Glu Lys Phe Asp Gly Leu Arg Ile Val Thr Lys Glu195 200 205Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Lys Pro Lys Arg Ile Tyr Ser Asp Asn Gly210 215 220Lys Ile Tyr Arg Ala Glu Pro Leu Gln Tyr Ala Cys Ala Glu Leu Gly225 230 235 240Ile Thr Leu Ile His Thr Gln Pro Tyr Asp Pro Gln Ser Lys Gly Lys245 250 255Ile Glu Arg Phe Phe Arg Thr Val Gln Thr Arg Phe Tyr Pro Leu Leu260 265 270Glu Met Asn Ser Pro Lys Ser Leu Glu Glu Leu Asn Glu Arg Phe Trp275 280 285Lys Trp Leu Glu Glu Asp Tyr His Arg Lys Pro His Ala Ser Leu Asn290 295 300Gly Lys Thr Pro His Glu Val Phe Gln Ser Gln Val His Leu Val Ser305 310 315 320Phe Val Glu Asp Ser Asp Trp Leu Asp Ser Ile Phe Leu Lys Arg Glu325 330 335Tyr Arg Lys Val Lys Ala Asp Gly Thr Val Thr Leu Asn Lys Gln Leu340 345 350Tyr Glu Val Pro Pro Arg Phe Ile Gly Gln Ser Ile Glu Leu Arg Tyr355 360 365Asp Glu Gln Gly Val Tyr Val Tyr Glu Asp Gly Gln Arg Val Ala Glu370 375 380Ala Val Leu Val Arg Phe Glu Asp Asn Ala Tyr Val Lys Arg His Arg385 390 395 400Ser Pro Phe Ala Ala Val Pro Val Glu Gly Gly Glu Asn Asp Val405 410 415<210>13<211>266<212>PRT<213>Bacillus<400>13Met Tyr Lys Thr Phe Tyr Ser Leu Ser Arg Glu Pro Phe Ser Lys Glu1 5 10 15Thr Asn Pro Pro Glu Ala Tyr Gln Gly Ala Ser Tyr Gln Glu Ala Leu20 25 30
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<221>misc_feature<222>(1)...(3149)<223>n＝A，T，C or G<400>16angtcttgtt gtaaattatc actttatttc cgcacaaaaa agactctttt ttgcacattc60cttcggaata tccctctccc cctttccgaa agaatgtgct aaattttttg tgaattattt120cggaatggga catgggtgat ttccagaggg gggacgagga cgtgattcgg tttcatgact180ttcaggtcga tgtccagaca tatgcccagc ggggaaaaca aaacgacttt ccccttctta240agcggtgccc tcattgccag gcaaaacgcc ctctttatcg ccatgggtac tacgaacgaa300atgccgtgac gtcgcatcag tcttatcgca tttggatcgc tcggtatcgc tgcccggagt360gcaggaggac ggtggccgtg ttgccttcat ttcttctccc ttattttcag tatacgttgc420ccaccatatg gagagtggtg aaagaacggt tgggcctgac tccgaaacgg gggatggagg480
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權利要求
1.一種革蘭氏陽性菌，其特征在于使用一種基于在天然ldh基因內，質粒和插入元件(IE)序列發生同源重組的質粒整合方法，使ldh突變更加穩定，由此，乙醇生產能力得到提高。
2.一種嗜熱革蘭氏陽性菌，其特征在于所述菌用同源重組的方法轉化使基因突變更加穩定，也有利于可表達基因的插入。
3.按權利要求1所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于所述菌是嗜熱菌。
4.按權利要求1、2或3中所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于所述菌是從B.stearothermophilus，B.calvodelox，B.caldotenax，B.thermoglucosidasius，B.coagulans，B.licheniformis，B.thermodenitrificans和B.caldolyticus中篩選得到的Bacillus sp。
5.按上述權利要求中任一項所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于Bacillus sp為B.thermoglucosidasius TN-T9菌株(NCIMB保藏編號NCIMB 41075)。
6.按權利要求1-4中任一項所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于Bacillus sp為B.thermoglucosidasius TN-TK菌株(NCIMB保藏編號NCIMB 41115)。
7.按權利要求1-6中任一項所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于所述菌用攜帶如圖1所示的IE序列或其功能性部分或變體的穿梭載體轉化。
8.按權利要求7中所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于IE序列，其功能性部分或變體經同源重組被穩定地整合到重組菌的染色體中。
9.按上述權利要求中任一項所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于天然ldh基因經同源重組失活。
10.按上述權利要求中任一項所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于所述菌為芽胞形成缺陷型。
11.按上述權利要求中任一項所述的革蘭氏陽性菌，其特征在于天然ldh基因失活并表達一個異源的pdc基因。
12.按權利要求9、10或11中任一項的革蘭氏陽性菌，其特征在于天然ldh基因不可逆失活。
13.一種天然ldh基因失活和一個或多個可表達基因插入包括同源重組的方法。
14.按權利要求13所述的方法，其特征在于其中一個或多個可表達基因為pdc基因和adh基因。
15.按權利要求14所述的方法，其特征在于所述pdc基因和adh基因形成PDC操縱子的一部分，PDC操縱子經操作連接到如圖1所示的IE序列上。
16.按權利要求13、14或15所述的方法，其特征在于所述異源pdc基因來源于Zymomonas sp。
17.按權利要求13-16中任一項所述的方法，其特征在于所述異源pdc基因來源于Zymomonas mobilis。
18.按權利要求14-17中任一項所述的方法，其特征在于所述adh基因來源于Bacillus TN菌株。
19.按權利要求13-18中任一項所述的方法，其特征在于插入序列和PDC操縱子或它們的部分，都被穩定地整合到重組菌的染色體中。
20.按權利要求13-14中任一項所述的方法，包括使用一種穿梭載體，如圖5所示，它能夠在E.coli和Bacillus菌株中復制。
21.一種穿梭載體攜帶如圖1所示的IE序列或其部分。
22.按權利要求21所述的穿梭載體，其特征在于所述穿梭載體攜帶pdc基因，經操作連接到如圖1所示的IE序列上。
23.按權利要求22所述的穿梭載體，其特征在于所述pdc基因構成PDC操縱子的一部分。
24.一種選擇攜帶ldh基因的重組菌的方法，在此方法中，質粒DNA通過同源重組穩定地整合到所述菌的ldh基因中，包括用PCR方法擴增ldh基因。
25.按權利要求23所述的方法，其特征在于對重組菌ldh基因PCR擴增的失敗表明如圖1所示的IE序列或其部分已被整合到重組菌的染色體中。
26.一種如圖6所示的DNA序列，其特征在于其編碼一個有乳酸脫氫酶生物活性的多肽。
27.一段DNA序列，其特征在于所述序列可以在嚴格的條件下與如圖6所示的DNA序列雜交，或者與如圖6所示的DNA序列具有簡并性，且編碼一個有乳酸脫氫酶活性的多肽。
28.一段如圖7B所示的DNA序列，其特征在于其編碼一個有乳酸通透酶生物活性的多肽。
29.一段DNA序列，其特征在于所述序列可以在嚴格的條件下與如圖7B所示的DNA序列雜交或者與如圖7B所示的DNA序列具有簡并性，且編碼一個有乳酸通透酶活性的多肽。
30.一段如圖8所示的DNA序列或其功能性變體，其特征在于其編碼一個有乙醇脫氫酶生物活性的多肽。
31.一段DNA序列，其特征在于所述序列可以在嚴格的條件下與如圖8所示的DNA序列雜交或者與如圖8所示的DNA序列具有簡并性，且編碼一個有乙醇脫氫酶活性的多肽。
32.一段如圖1所示的DNA序列或其部分或其功能性變體，其特征在于其編碼一個或多個有轉座酶生物活性的多肽，且被歸入插入序列一類。
33.按權利要求32所述的DNA序列，其特征在于所述序列來源于嗜熱Bacillus TN菌株。
34.由如圖1所示序列的第652到3800個殘基或其功能性變體編碼的一個或多個多肽，其特征在于所述一個或多個多肽具有轉座酶的生物活性。
35.按權利要求1-12中任一項所述涉及的用革蘭氏陽性菌發酵生產乙醇的工藝方法，包括應用最優化的發酵條件，其中發酵培養基的pH值在5.5-7.5的范圍內。
36.按權利要求35所述的工藝方法，其特征在于所述發酵培養基的pH值較佳為6.0-7.0。
37.按權利要求35或36所述的工藝方法，其特征在于所述發酵培養基的pH值較佳為6.4-6.9。
38.按權利要求1-12中任一項所述的用革蘭氏陽性菌發酵生產乙醇的工藝方法，包括應用最優化的發酵條件，其中發酵培養基的溫度是在40-75℃的范圍內。
39.按權利要求38所述的工藝方法，其特征在于所述發酵培養基的溫度較佳為52-70℃。
40.按權利要求38或39所述的工藝方法，其特征在于所述發酵培養基的溫度較佳為60-68℃。
41.一種細菌發酵生產乙醇的工藝方法，包括使用空氣噴射控制培養物的氧還值在-360和-400mV之間。
42.按權利要求41所述的工藝方法，其特征在于所述氧還值較佳是在-370和-380mV之間。
43.按權利要求40或41所述的工藝方法，其特征在于所述革蘭氏陽性菌是如權利要求1-12中任一項所述。
44.按權利要求1-12中任一項所述的用革蘭氏陽性菌發酵連續生產乙醇的工藝方法，其特征在于所述加料稀釋率在0.3-0.8h-1的范圍內。
45.按權利要求43所述的工藝方法，其特征在于所述加料稀釋率較佳為0.4-0.6h-1。
46.按權利要求35-44中任一項的工藝方法，其特征在于所述使用的菌種為Bacillus TN菌株。
全文摘要
本發明涉及乙醇作為細菌發酵產物的生產，特別是涉及一種建立在同源重組基礎上的基因失活和基因表達的新方法。
文檔編號C12N9/02GK1798846SQ01819566
公開日2006年7月5日 申請日期2001年10月5日 優先權日2000年10月6日
發明者穆罕默德·賈維德, 法伊奧納·庫斯丁, 保羅·邁爾納, 愛德華·格林 申請人:埃爾斯沃思生物技術有限公司