專利名稱：產前診斷早產、胎兒感染和胎兒損傷的診斷劑及含有它們的診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種產前診斷早產、胎兒感染和胎兒損傷的診斷劑體系，和一種利用該試劑的診斷試劑盒，更具體地，涉及羊水基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)濃度作為早產、胎兒感染和胎兒損傷的產前診斷標記的應用。
背景技術：
在醫學界很久以來就公認對早產或胎膜早熟破裂的預防比其出生后的治療更有意義。然而，目前已知很多因素引起早產或胎膜早熟破裂，使得難以預防這種不希望的事件。傳統預防早產的方法是鑒定高危群的婦女，基于產科學和婦產科學、人口統計學和各種綜合征的知識，應對她們特別關注(Main等，Am.J.Obstet.Gynecol.，151892-898，1985)。然而，該方法具有既不靈敏又不特異的問題。為防止該問題，大量的研究針對于尋找生化標記來預測即將發生的早產和胎膜早熟破裂，使得血漿雌二醇-17β，孕酮，C-反應性蛋白成為有前途的候選物。然而，發現這些候選物的精確度很差。
除了這類生化預測標記外，如對胎膜早熟破裂的研究所揭示，基于絨膜由纖維結締組織組成和纖維結締組織抗張強度由它的膠原含量確定的事實，已有效關注膠原的生化作用。基于他們的發現，即與正常膜相比，早熟破裂的胎膜具有低的膠原含量，一些科學家推斷胎膜的早熟破裂歸因于比正常胎膜低的抗張強度(Obstet.Gynecol.，57487-89，1981)。根據另一項研究，報道了在早熟破裂的胎膜和早產中膠原酶的血清活性是高的(Obstet.Gynecol.，7584-88，1990)。然而，尚未闡明這種生化變化的精確機制(FEBBS Letters，244(2)315-318，1989)。
在統計學上，估計妊娠37周前早產的頻率為約8-10％。在韓國，每年約50,000個嬰兒早產。早產通常引起一系列的新生兒并發癥，包括膿毒癥，呼吸窘迫綜合征，肺炎，支氣管肺發育異常，腦室內出血，壞死性小腸結腸炎和大腦性麻痹。越早早產，這種后遺癥的頻率就越高，嚴重性就越大。
因此，如果能防止早產，則可能顯著降低被這類疾病致殘的早產兒的誕生。
近來的報道揭示至少30-40％的早產與子宮內感染有關(Butler NR.，Bonham DG.，Prenatal mortality.The first report of the British perinatalmortality survey，Edinburgh，Churchill Livingstone，115-145，1963；RomeroR.，Avila C.，Sepulveda W.，Preterm birth.Cause，prevention，andmanagement.，McGrow-Hill Company，97-136，1993；Romero R.，Mazor M.，Clin.Obstet.Gynecol.，31553，1990；Gibbs RS.，Romero R.，Hiller SL.，等，Am.J.Obstet.Gynecol.，1661515，1992)。
子宮內感染可通過下述過程對胎兒造成傷害。子宮內感染活化了母體和胎兒的免疫系統，以分泌炎性介質，如來自淋巴細胞的細胞因子和來自中性粒細胞的MMP(基質-金屬蛋白酶)。當炎性介質達到一定水平時，促進子宮收縮的前列腺素就產生了，其引起導致早產的主動分娩。另外，升高的炎性介質水平導致胎兒受到胎兒炎性反應綜合征(FIRS)的侵襲。由于成年人的自身免疫性疾病，炎性介質引起膿毒癥或急性呼吸窘迫綜合征或損害器官，同樣，胎兒的全身器官被炎性介質傷害，導致腦白質損傷和支氣管發育異常。因此，炎性介質的產前診斷對于預防早產和胎兒損傷是必需的。
通常，當前使用的子宮內胎兒感染的產前診斷方法是cordocentesis-即測量胎兒的血細胞因子水平，和臍帶的組織檢查以鑒定臍帶炎(funisitis)。然而，由于它的侵襲力，cordocentesis的應用受到限制，并且臍帶炎僅能在分娩后診斷(Yoon BH.，Romero R.，Park JS.，Kim CJ.，ChoiJH.，Han TR.，Am.J.Obstet.Gynecol.，182675-81，2000；Yoon BH.，Romero R.，Kim KS.，Park JS.，Ki SH.，Kim BI.，Jun JK.，Am.J.Obstet.Gynecol.，181773-9，1999；Romero R.，Gomez R.，Ghezzi F.，Yoon BH.，Mazor M.，Edwin SS.，Berry SM.，Am.J.Obstet.Gynecol.，179186-93，1998)。
當感染或羊膜腔發炎時，羊水中的白細胞數增加。羊水中的中性粒細胞被認為是來源于胎兒的(Knauper V.，Kramer S.，Reinke H.，TschescheH.，Eur.J.Biochem.，189295-300，1990；Blaser J.，Triebel S.，Massjosthusmann U.，Romisch J.，Krahl-Mateblowski U.，Freudenberg W.，Fricke R.，Tschesche H.，Clinic.Chim.Acta.，24417-33，1996；Segura-ValdezL.，Pardo A.，Gaxiola M.，Uhal BD.，Becerril C.，Selman M.，Chest..，117684-94，2000；RomanelliR.，Mancini S.，Laschinger C.，Overall CM.，Sodex J.，MaCulloch CA.，Infect.Immun.，672319-26，1999；Maymon E.，Romero R.，Pacora P.，Gomez R.，Athayde N.，Edwin S.，Yoon BH.，Am.J.Obstet.Gynecol.，18394-9，2000)。因此，推定羊水中中性粒細胞的分泌產物可能反映了胎兒炎性反應。在本發明中，關注羊水中MMP-8的水平。羊水中MMP-8的測定可以是胎兒炎性反應綜合征的標記，該綜合征目前可通過分娩后臍帶的組織學檢查或用cordocentesis測定胎兒血細胞因子來診斷。
MMP(基質金屬蛋白酶)系列，也全體被稱為matrixin，是依賴鋅的內肽酶，它們負責降解胞外基質蛋白。這些蛋白酶組成一個大且增長的蛋白家族，這些蛋白具有相似的結構和酶性質。MMP被廣泛分為五組。連同MMP-1和MMP-13一起，MMP-8屬于間質膠原酶組。MMP-8在大小上與其它間質膠原酶相似，但在很大程度上被糖基化。當完全糖基化時，MMP-8的酶原形式具有85kDa的分子量。酶原去掉15-25kDa片段轉化成60-70kDa的活性形式。原MMP-8在體外被各種蛋白酶激活，包括胰島素，胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G。同樣發現有機汞制劑化合物也激活原MMP-8。尚未完全闡明MMP-8的體內活化機制。
涉及MMP-8的現有技術存在于美國專利號5,736,341中，其公開了基于對MMP-8的單克隆抗體，能敏感且特異地診斷牙周疾病的方法和測試試劑盒。在該專利中描述了在口腔中MMP-8水平的測量能定點特異診斷牙周炎，因為MMP-8與牙周炎發展過程中牙周結締組織的破壞直接相關，并且通過含齦縫液的齦袋擴散到口腔中。為了特異且敏感地生化檢測發展中的牙周疾病，這些方法測量MMP-8的原形式到活性形式的轉換，這是因為所述轉換發生在牙周感染過程中。沒有提及MMP-8關于早產和胎兒感染和損傷的應用。
美國專利號5,641,636引用了一種基于另一種基質膠原酶MMP-9的活性，預測胎膜破裂的方法，所述MMP-9與MMP-8屬于不同的組別。MMP-9是92-kDaIV型膠原酶/明膠酶或MMP中具有最大分子量的明膠酶B。關于活化，MMP-9的酶原形式即原MMP-9最初被切割成約83kDa的中間活性形式，伴隨9kDa的非活性切割片段產物。該中間活性形式被進一步蛋白裂解處理成67kDa MMP-9的活性形式(J.Biol.Chem.，267(30)21712-21719，1992)。MMP-9的活性形式表示轉換成83kDa的中間活性形式或具有明膠降解活性的67kDa的完全活性形式。該專利測量了MMP-9降解變性的膠原如明膠的水解活性，以診斷胎膜的過早破裂。然而，由于在分娩前，MMP-9已存在于羊水中，該方法在預測胎膜早熟破裂方面具有有限的價值。
約30-40％的早產(preterm labour)或胎膜早熟破裂的患者經歷了早產(preterm delivery)。在這種情形下，已知各種物質在羊水中以增加的水平存在，所述物質包括白細胞介素-6，白細胞介素-8，TNF-α，白細胞介素-1β，GROα，RANTES，白細胞，MIP-1α，MCP-1，葡萄糖，PGE2，和血管生成素。然而，這些物質很少用于預測早產，因為它們的水平保持不變或在無早產臨床信號的孕婦羊水中檢測不到，并且僅在早產發作或過早胎膜破裂后才增加。
因此，本發明的一個目的是提供一種在具有或不具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號的孕婦中產前診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷的方法和試劑盒，從而可預防新生兒疾病和一系列并發癥或后遺癥，如腦性麻痹。
作為本發明的一個要素，提供了一種通過測量在具有或不具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號的孕婦羊水中MMP-8的水平來產前診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷的方法。
作為本發明的另一個要素，提供了一種產前診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷的診斷劑體系和試劑盒。
圖2表示接收器運行特征曲線，其中靈敏度對特異性繪制曲線，以選擇在鑒定自發早產過程中羊水MMP-8的邊界值(cutoffvalue)。
圖3表示在具有和不具有臍帶炎的患者中羊水MMP-8濃度的分布。
圖4表示接收器運行特征曲線，其中靈敏度對特異性繪制曲線，以選擇在鑒定臍帶炎過程中MMP-8的邊界值。
圖5表示在具有或不具有產前發育的腦性麻痹的患者中羊水MMP-8濃度的分布。
圖6表示接收器運行特征曲線，其中靈敏度對特異性繪制曲線，以選擇在鑒定產前發育的腦性麻痹過程中MMP-8的邊界值。
發明詳述在一個實施方案中，本發明涉及測定羊水中MMP-8的活性，從而產前診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷。
由于降解胞外基質蛋白的活性，MMP-8是依賴鋅的內肽酶。屬于間質膠原酶組，MMP-8可以酶原形式(原MMP-8)從嗜中性白細胞中純化。原MMP-8分子量約85kDa，被高度糖基化。依賴于活化的形式，酶原的活化通過切割酶原分子來實現，這產生了分子量在60-70kDa變化的活性膠原酶。體內活化的機制可能涉及反應性氧和氧化劑如羥基。當去除了原膠原酶的N-末端片段時，產生并暴露了酶的活性位點。
MMP-8以酶原形式(原MMP-8)由嗜中性白細胞產生。原MMP-8以便于貯藏的顆粒形式存在，并且響應于刺激而被分泌。分泌的原MMP-8在胞外間質組織中被活化并降解I，II和III型膠原，其對I型膠原具有高度的特異性。已知作為炎癥相關的組織損傷的一種重要介質，在由炎性疾病引起的組織損傷中涉及該酶，所述炎性疾病如牙周炎，慢性阻塞性肺疾病，類風濕性關節炎等。另外，已知MMP-8通過引起子宮頸的消失和擴張而在分娩過程中被涉及。
基于這個發現，即在具有和不具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號的婦女中，升高的MMP-8中期-三個月期羊水濃度高度預示著早產，本發明人開發了一種早產、胎兒感染和胎兒損傷的產前診斷方法。
根據本發明的一個實施方案，提供了一種早產、胎兒感染和胎兒損傷的產前診斷方法，其包含下述步驟1)取孕婦的羊水樣品；和2)定量測量羊水樣品中的MMP-8。
不僅能對具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號的婦女，而且能對不具有這類臨床信號的婦女進行早產診斷。
通過在超聲波掃描指導下經腹壁羊膜穿刺或用其它取樣方法可獲得羊水樣品。為了定量測定羊水中MMP-8水平，如果基于抗原-抗體偶聯，可使用任何分析方法，優選ELISA(酶聯免疫吸附試驗)。
為確定是否MMP-8是預測懷孕中期早產的有效臨床指示劑，在患者中比較MMP-8與另一種炎癥的有效指示劑IL-6的羊水濃度，所述患者不具有任何即將早產的臨床信號在妊娠32周前自發早產或中期-三個月期(mid-trimester)羊膜穿刺后足月產。在那些早產患者中，MMP-8和IL-6的羊水濃度明顯較高。如

圖1所示，羊水MMP-8濃度高于23ng/ml的患者89％自發分娩。另外，統計學比較證實在預測早產的靈敏度和特異性方面MMP-8優于IL-6。考慮到靈敏度、特異性和總體優勢率，選擇23ng/ml的羊水MMP-8水平作為適于預測早產的邊界值。
高于邊界值的升高的中期-三個月羊水MMP--8濃度表示妊娠32周前非常容易早產。因此，當在懷孕中期進行遺傳羊膜穿刺時，定量羊水MMP-8水平有助于鑒定可能早產的患者。
為證明MMP-8作為胎兒感染和胎兒損傷的臨床預測劑的有效性，用采自連續患者的羊水培養需氧和厭氧菌和支原體，所述患者在羊膜穿刺72小時內分娩早產的單胎嬰兒(妊娠期＜36周)，并用ELISA確定羊水MMP-8濃度。分娩后進行血漿的組織學檢測。觀察到陽性羊水培養物的患者MMP-8濃度明顯高于陰性羊水培養物患者MMP-8濃度。同樣，存在組織絨膜羊膜炎的血漿具有明顯高于缺乏組織絨膜羊膜炎的血漿的羊水MMP-8水平(參見表1-4的數據)。
從這些結果，可以推斷微生物感染羊水導致羊水MMP-8水平明顯增加，對它的定量可診斷子宮內的感染。關于組織絨膜羊膜炎，它還導致羊水MMP-8水平的顯著增加，使得羊水MMP-8水平的測定可反應子宮內感染。結果，MMP-8可用作子宮內感染和炎癥以及早產的產前診斷的有效臨床預測劑。尤其是，羊水MMP-8水平的定量可以較高的特異性和陽性預測值來診斷子宮內炎癥。
為了直接診斷胎兒感染，根據存在或不存在臍帶炎來比較MMP-8的羊水濃度。
胎兒炎性反應綜合征(FIRS)是與即將的早產和不利的新生兒結果相關的多系統疾病。被看作是FIRS的組織學對應物，臍帶炎(funisitis)已與腦性麻痹發展的增加的風險相關。在羊膜腔中的中性粒細胞是來源于胎兒的。基于這些發現，推測中性粒細胞的分泌產物可能是FIRS的指數。為檢驗這種推測，研究羊水基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)與臍帶炎的關系。在存在臍帶炎的情況下，觀察到MMP-8濃度明顯高于不具有臍帶炎的情況。在鑒定臍帶炎過程中MMP-8的診斷指數在靈敏度、特異性和陰性預測值方面是高的(參見表5和6，圖3和4)。
從這些結果，發現在羊水MMP-8濃度和胎兒炎癥(臍帶炎)之間有強烈的相關性。因此，本發明建議對羊水MMP-8濃度的評估可有助于診斷胎兒感染，而不需常規的侵襲性的胎血取樣。
由于羊水MMP-8濃度和胎兒感染之間的相關性，本發明人研究了羊水MMP-8濃度和新生兒疾病之間的關系，所述疾病包括新生兒膿毒癥，呼吸窘迫綜合征，肺炎，支氣管肺發育異常，壞死性小腸結腸炎，和心室內出血。在發病的新生兒中MMP-8濃度明顯高于非發病的新生兒(參見表7)。在新生兒疾病鑒定過程中MMP-8的診斷指數在特異性、陽性和陰性預測值方面是優異的(參見表7和8)。另外，分娩患有新生兒膿毒癥的嬰兒的患者羊水MMP-8濃度明顯高于分娩不患有新生兒膿毒癥的嬰兒的患者(P＜0.05)(參見表9)。
綜合的數據證實羊水MMP-8濃度在預測新生兒膿毒癥和圍生期疾病中可用作診斷標記。
在腦性麻痹的病因學中涉及子宮內感染或炎癥。認為FIRS在足月和早產兒出生過程中引起胎兒大腦損傷。在感染的情況下，中性粒細胞是最頻繁補充到羊水中的細胞，并且認為它們是來源于胎兒的。如在下述實施例2和3中所證實，發現在子宮內感染和/或炎癥情況下，MMP-8，一種由活化的中性粒細胞分泌的酶，其羊水水平明顯較高。基于這個背景，進行一種檢驗以確定是否在羊水中增加濃度的基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)與三歲時腦性麻痹的發展有關。
與新生兒患腦性麻痹的患者相比，從新生兒患腦性麻痹的患者中采樣的羊水中，觀察到明顯較高水平的MMP-8(參見圖5)，證實MMP-8作為預測腦性麻痹的診斷標記是很有用的(參見圖5和6，表11)。
我們可以看出升高的羊水MM-8濃度與高于6倍幾率患腦性麻痹相關。即，羊水MMP-8濃度可用作預測腦性麻痹的產前診斷標記。
廣泛的研究后，選擇了鑒定早產、胎兒感染和胎兒損傷的羊水MMP-8的邊界值。在這點上，當羊水MMP-8的邊界值高于5-100ng/ml，優選高于10-50ng/時，該孕婦被鑒定為處于早產，新生兒疾病，胎兒感染(臍帶炎)和腦性麻痹的危險中。
基于羊水MMP-8濃度作為鑒定早產、胎兒感染和胎兒損傷的診斷標記的有用性，可開發診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷的試劑體系。
因此，在本發明的另一個實施方案中，提供了一種鑒定早產，胎兒感染和胎兒損傷的診斷劑體系，這基于羊水MMP-8濃度的定量。詳細地說，診斷劑體系利用包含下述步驟的分析機制1)在基質上吸附初級MMP-8抗體，2)在存在羊水的條件下孵育吸附到基質上的MMP-8抗體，并洗滌基質以去除未結合的抗原，3)將次級產色素的酶-或熒光-連接的抗體與結合到初級抗體上的MMP-8相偶聯，其中所述初級抗體吸附到基質上，和4)通過使用著色劑在基質上進行顯色反應，定量分析結合抗體的MMP-8的量。
用于步驟1的基質的實例包括硝酸纖維素膜，96-孔聚乙烯樹脂培養板，96-孔聚苯乙烯樹脂培養板和載玻片。
為了定量分析，將與結合到初級抗體的MMP-8偶聯的次級抗體連接一種產色素酶，如過氧化物酶、堿性磷酸酶、和生物素，或一種熒光劑如FITC(異硫氰酸熒光素)和TRITC。
著色劑可選自4CN(4-氯-1-萘酚)，DAB(二氨基聯苯胺)，AEC(氨乙基咔唑)，ABTS(2，2’-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))，OPD(鄰-苯二胺)和TMB(N-四甲基聯苯胺)。
原則上，診斷是基于羊水MMP-8濃度的量化，它利用MMP-8與它的抗體的反應。在這個關系中，單克隆或多克隆抗-MMP-8抗體被固定在固體基質上并與樣品中的MMP-8反應，然后洗滌基質以去除未結合的抗體和MMP-8。然后，連接了酶或熒光劑的次級抗體或多克隆抗體與固定的MMP-8結合。辣根過氧化物酶多克隆抗體，或生物素化的兔多克隆或單克隆抗體通常用作次級抗體。在存在過氧化物和著色劑的條件下進行顯色反應以目視顯色。加入酸終止顯色反應，然后在450nm測量吸光度。
基于這個診斷機制，可建立使用相同診斷劑體系的診斷試劑盒。
因此，在本發明的另一個實施方案中，提供了鑒定和預測早產、胎兒感染和胎兒損傷的診斷試劑盒。借助于診斷試劑盒，可方便地在數量上或在質量上評估早產或胎膜早熟破裂。為了分析MMP-8抗原，通過使金或膠體顆粒與抗MMP-8抗體偶聯制備標記抗體。MMP-8的標記抗體與MMP-8結合以形成免疫復合物。該免疫復合物再與MMP-8抗體反應，然后加入通常由尿素等組成的過量標記抗體的洗液。當MMP-8濃度超過一定水平時，肉眼可見陽性結果。這種診斷試劑盒可包含抗-MMP-8抗體，標準MMP-8，基質，分析緩沖劑，產色素酶-或熒光標記的次級抗體，和粘著平板覆蓋物。
備選地，本發明的診斷試劑盒可采用利用生物微芯片的自動分析方法。例如，可建立一個診斷試劑盒以進行利用抗MMP-8抗體包被的載玻片的免疫印跡。這個診斷試劑盒可包含生物微芯片，在其表面固定了抗MMP-8抗體，適當的緩沖劑，標準MMP-8和次級抗體。
因此，用保存的羊水設計一個病例對照研究，所述羊水獲自在中期-三個月期遺傳羊膜穿刺的婦女。在19位妊娠32周前自發早產的患者中和95位足月分娩正常嬰兒的對照病例中用ELISA確定MMP-8和IL-6的羊水水平。在本分析中排除具有異常胎兒核型和嚴重畸形的病例。
自發早產的中值羊水MMP-8濃度為3.1
ng/ml，而在對照病例中水平為1.3[＜0.3-45.2]ng/ml。自發早產的患者中值羊水IL-6濃度為0.32
ng/ml，而對照病例中水平為0.18
ng/ml。采自自發早產患者懷孕中期羊水的MMP-8和IL-6濃度明顯高于足月分娩的對照病例(p＜0.01)，如圖1所示。
評估了患者和對照病例MMP-8濃度后，當懷孕中期羊水MMP-8濃度高于23ng/ml，則89％的調查病例自發早產。
另外，如圖2所示，在遺傳羊膜穿刺后，鑒定早產患者過程中，懷孕中期23ng/ml的羊水MMP-8邊界值表現42％(8/19)的靈敏度和99％(94/95)的特異性，而0.6ng/ml的IL-6邊界值表現42％(8/19)的靈敏度和92％(87/95)的特異性。因此，在鑒定和預測早產的靈敏度、特異性和優勢率方面MMP-8優于IL-6。結果，選擇23ng/ml的羊水MMP-8濃度作為鑒定早產的邊界值。實施例2MMP-8的羊水濃度與子宮內感染和炎癥之間的關系在存在或不存在子宮內感染和炎癥的情況下，檢查MMP-8的羊水濃度，以確定是否羊水MMP-8濃度可用作鑒定子宮內感染和胎兒損傷的診斷標記。
在這點上，在漢城國立大學醫院(Seoul National University Hospital)(漢城，韓國)對255位連續的患者進行檢查，所述患者在羊膜穿刺72小時內分娩早產單胎嬰兒(妊娠期＜36周)。羊水用來測量MMP-8水平，以及用來培養需氧和厭氧菌和支原體。另外，進行胎盤的組織學檢查。在超聲波掃描指導下，通過經腹壁羊膜穿刺重新獲得羊水。2-1羊水培養通過經腹壁羊膜穿刺重新獲得羊水后，立即將羊水置于帶蓋的無菌塑料管中，并保存于此直至在厭氧性或需氧性培養基中培養。培養需氧或厭氧菌使用的是血瓊脂，McConkey的瓊脂，Bactec 6A管瓶，巰基乙酸培養基，布魯氏菌血瓊脂，鮮肉提取物和補充以馬血清、青霉素、多粘菌素B和兩性霉素B的類胸膜肺炎微生物肉湯。Mycotrim GU用于培養支原體。2-2測量羊水MMP-8濃度于700×g離心羊水樣品10分鐘。上清液用于測量羊水MMP-8濃度，所述測量是用兩個結合非重疊表位的單克隆抗體的ELISA(AmershamPharmacia Biotech，英國)進行。2-3胎盤的組織學檢查分娩時胎盤完全取出后，將切離自臍帶的組織、絨毛膜板和胎盤膜在10％福爾馬林中固定，并包埋在石蠟中以制備載玻片。然后，為了在顯微鏡下清楚可見，用蘇木精和伊紅染色組織片段。將急性子宮內感染定義為在檢查胎膜、絨毛膜、蛻膜和絨毛膜板任一處時存在炎性變化。
在255位受試者中，發現45例具有陽性羊水培養物，這表示子宮內感染頻率為18％。在進行113位患者胎盤的組織學檢查時發現具有絨膜羊膜炎，這表示子宮內感染炎癥為44％。檢測到中值羊水MMP-8濃度在具有陽性細菌羊水培養物的患者中為191.4ng/ml水平，在那些具有陰性培養物的患者中為2.7ng/ml水平。因此，在子宮內感染患者中，中值羊水MMP-8濃度明顯高于那些不具有子宮內感染的患者(p＜0.001)。結果示于下表1中。表1根據羊水培養物結果，羊水MMP-8濃度
邊界值為23ng/ml，鑒定陽性羊水培養物的MMP-8診斷指數是優異的76％的靈敏度和93％的陰性預測值。結果示于下表2中。表2對于鑒定陽性羊水培養物，MMP-8的診斷指數
胎盤的組織學檢查揭示在存在絨膜羊膜炎的情況下，羊水MMP-8的中值濃度為160.9ng/ml，而不村子絨膜羊膜炎的情況下，為1.0ng/ml。具有絨膜羊膜炎的患者中羊水MMP-8濃度明顯高于那些不具有絨膜羊膜炎的患者(p＜0.001)。結果示于下表3中。表3根據子宮內炎癥，MMP-8濃度
邊界值為23ng/ml，鑒定子宮內炎癥(絨膜羊膜炎)的MMP-8診斷指數是優異的72％的靈敏度，89％的特異性，84％的陽性預測值，和80％的陰性預測值。結果示于下表4中。表4鑒定子宮內炎癥的診斷指數
實施例3通過利用MMP-8的羊水濃度診斷臍帶炎在存在或不存在臍帶炎的情況下，測量羊水MMP-8濃度，以確定是否羊水MMP-8濃度可用于直接診斷胎兒感染。
在漢城國立大學醫院(漢城，韓國)對255位連續的患者中檢查存在臍帶炎和MMP-8的羊水濃度之間的關系，所述患者在羊膜穿刺72小時內分娩早產單胎嬰兒(妊娠期＜36周)。如果存在中性粒細胞滲透到臍血管壁或沃頓膠(Wharton jelly)，則診斷為臍帶炎。以與實施例2相同的方式進行MMP-8濃度的定量。
在59例患者中診斷有臍帶炎(臍帶炎頻率23％)。中值羊水MMP-8濃度在具有臍帶炎的患者中為433.7ng/ml，在那些不具有臍帶炎的患者中為1.9ng/ml。因此，與那些不具有臍帶炎的患者相比，具有臍帶炎的患者具有明顯較高的中值羊水MMP-8濃度(p＜0.001)。結果示于下表5和圖3中。表5根據存在或不存在臍帶炎，MMP-8濃度
利用接收器運行特征曲線分析選擇臍帶炎診斷中羊水分析物的邊界值。結果，如圖4所示，考慮到診斷臍帶炎的靈敏度和陽性預測值，選擇23ng/ml作為MMP-8的邊界值。在鑒定臍帶炎過程中，MMP-8的診斷指數(邊界值23ng/ml)是優異的90％的靈敏度，78％的特異性，和96％的陰性預測值。結果歸納于下表6中。表6對于鑒定臍帶炎，MMP-8的診斷指數
實施例4通過利用羊水MMP-8濃度診斷新生兒疾病基于臍帶炎與增加的新生兒感染相關的并發癥的風險有關聯的假設，所述并發癥例如膿毒癥，肺炎，支氣管非發育異常，壞死性小腸結膜炎，和心室內出血，比較具有這類新生兒疾病的病例與那些正常病例中羊水MMP-8濃度。
在漢城國立大學醫院(漢城，韓國)，對239位連續患者檢查存在這類新生兒疾病與MMP-8的羊水濃度之間的關系，所述患者在羊膜穿刺72小時內分娩早產單胎嬰兒(妊娠期＜36周)。新生兒疾病依據新生兒并發癥的發展所定義，所述并發癥例如膿毒癥，肺炎，支氣管肺發育異常，壞死性小腸結膜炎，和心室內出血。在分娩72小時內，在存在陽性血培養物的條件下診斷先天新生兒膿毒癥。新生兒呼吸窘迫綜合征的診斷需要存在呼吸呼嚕聲和回縮(retracting)，增加的氧需求(FiO2＞0.4)，和無呼吸疾病的其它病因的證據的診斷的放射照相和實驗檢查結果。在出生7日內，在存在明確的臨床和放射檢查結果，具有或不具有來自氣管吸出物或胸腔管樣品的陽性培養物的條件下診斷肺炎。用Bancalari等提議的標準診斷支氣管肺發育異常(1)在生命的第一周期間需要間歇性的正壓換氣，并需要最少3天；(2)慢性呼吸疾病發展的臨床信號，其特征在于呼吸急促，脈間和肋下縮回，和聽診有羅音，所有持續長于28天；(3)需要多于28天補充氧氣以維持PaO2超過50mmHg；(4)胸部X線照片顯示兩肺連續的實度股鏈，其與正常區域相交聯，或增加的透明度。在某些病例中，需要尸檢來診斷支氣管肺發育異常。根據McMenamin等建議的體系，將心室內出血劃分等級。在存在腹部膨脹和不耐進食至少24小時，以及X線照射發現腸壁滯留空氣、腸破裂，和胎糞阻塞綜合征，或通過手術或尸檢發現壞死性腸破裂的情況下診斷壞死性小腸結腸炎。以與實施例2相同的方式進行羊水MMP-8濃度的定量。
239位受試者的107個嬰兒(頻率45％)診斷患有新生兒疾病。在不存在嚴重新生兒疾病的情況下，中值羊水MMP-8濃度保持在2.35ng/ml水平，而在存在嚴重新生兒疾病的情況下，觀察到明顯較高的MMP-8濃度(160.9ng/ml)(p＜0.001)。詳細結果示于下表7中。表7根據存在或不存在新生兒疾病，MMP-8的濃度
利用接收器運行特征曲線選擇在診斷新生兒疾病中羊水分析物的邊界值。結果，考慮到診斷新生兒疾病的靈敏度和陽性預測值，選擇23ng/ml作為MMP-8的邊界值。鑒定新生兒疾病的MMP-8的診斷指數(邊界值23ng/ml)是優異的77％的特異性，63％的陽性預測值，65％的陰性預測值。結果歸納于下表8。表8對于鑒定新生兒疾病，MMP-8診斷指數
另外，與不存在膿毒癥相比(4.4ng/ml)，存在膿毒癥的情況下中值羊水MMP-8濃度明顯較高(208.95ng/ml)(p＜0.05)。詳細結果示于下表9中。表9根據存在或不存在新生兒膿毒癥，MMP-8的濃度
在鑒定新生兒膿毒癥過程中，MMP-8(邊界值23ng/ml)的診斷指數是優異的67％的靈敏度，66％的特異性，和99％的陰性預測值。結果歸納于下表10中。表10對于鑒定新生兒膿毒癥，MMP-8的診斷指數
實施例5通過利用羊水MMP-8濃度，診斷腦性麻痹在116位早產單胎嬰兒(出生時妊娠期＜35周)的母親中檢查MMP-8的羊水濃度與腦性麻痹的發展之間的關系，所述母親經歷了羊膜穿刺并被跟蹤觀察至少3年。在神經發育評估(發育重大事件的異常，依據Vojta方法的體位異常，和反射異常)方面肯定異常和持續肌緊張性異常的情況下，診斷腦性麻痹。
在嬰兒發展成腦性麻痹的母親中，其MMP-8的中值羊水濃度明顯高于嬰兒不發展成腦性麻痹的母親(中值153.9[范圍＜0.3-1535.9]ng/ml對中值6.4[范圍＜0.3-3836.8]ng/ml；p＜0.01)。發展成腦性麻痹的嬰兒比那些不發展成腦性麻痹的嬰兒在更早的妊娠期分娩。調整出生時的妊娠期和羊水培養物的結果后，升高濃度的羊水MMP-8顯著增加了發展成腦性麻痹的幾率(優勢率(odds ratio)，6.0；95％的置信區間，1.1-33.0；p＜0.05)。
利用接收器運行特征曲線選擇羊水分析物在診斷腦性麻痹中的邊界值。結果，考慮到診斷腦性麻痹的靈敏度和陽性預測值，選擇23ng/ml為MMP-8的邊界值，如圖6所示。在診斷腦性麻痹過程中，MMP-8的診斷指數是優異的85％的靈敏度，69％的特異性和97％的陰性預測值。結果歸納于下表11中。表11關于腦性麻痹，MMP-8的診斷指數
工業適用性如上文所述，基于羊水MMP-8濃度的量化，提供了診斷劑體系和診斷試劑盒來產前診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷。利用與色素形成相偶聯的抗原-抗體反應，本發明的診斷劑體系和診斷試劑盒特征在于包含一種或多種抗MMP-8抗體。本發明的診斷劑體系和試劑盒可用于不具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號的患者以及具有這類臨床信號的患者。由于在靈敏度和特異性方面優于測量胎血細胞因子水平的常規方法，本發明在早產、胎兒感染和胎兒損傷的產前診斷方面是非常有用的。
權利要求
1.一種產前診斷早產，胎兒感染和胎兒損傷的方法，其包含下述步驟1)取孕婦的羊水樣品；和2)測量羊水樣品中基質金屬蛋白酶-8的水平。
2.如權利要求1中所述的方法，其中所述孕婦具有或不具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號。
3.如權利要求1中所述的方法，其中產前診斷早產、胎兒感染和胎兒損傷的風險，包括圍生期疾病，所述圍生期疾病包含新生兒膿毒癥，呼吸窘迫綜合征，肺炎，支氣管肺發育異常，心室內出血，和壞死性小腸結腸炎，和腦性麻痹。
4.如權利要求1中所述的方法，其中當羊水基質金屬蛋白酶-8的邊界值高于5-100ng/ml時，將孕婦鑒定為處于早產，胎兒感染和胎兒損傷的危險中。
5.如權利要求1中所述的方法，其中當羊水基質金屬蛋白酶-8的邊界值高于10-50ng/ml時，將孕婦鑒定為處于早產的危險中。
6.如權利要求1中所述的方法，其中當羊水基質金屬蛋白酶-8的邊界值高于10-50ng/ml時，將孕婦鑒定為處于胎兒感染的危險中。
7.如權利要求1中所述的方法，其中當羊水基質金屬蛋白酶-8的邊界值高于10-50ng/ml時，將孕婦鑒定為處于發展成腦性麻痹的危險中。
8.如權利要求1中所述的方法，其中當羊水基質金屬蛋白酶-8的邊界值高于10-50ng/ml時，將孕婦鑒定為處于圍生期疾病的危險中。
9.一種利用權利要求1的方法的診斷劑體系，其包含一種或多種抗基質金屬蛋白酶-8的抗體。
10.如權利要求9中所述的診斷劑體系，其中診斷劑體系是基于包含下述步驟的分析機制1)在一個基質上吸附初級抗基質金屬蛋白酶-8抗體，2)在存在羊水的條件下，孵育吸附到所述基質上的抗基質金屬蛋白酶-8抗體，并洗滌所述基質以去除未結合的抗原，3)將次級產色素酶-或熒光連接的抗體與結合到初級抗體上的基質金屬蛋白酶-8相偶聯，其中所述初級抗體吸附到所述基質上，和4)通過加入著色劑進行顯色反應，以定量分析特異抗原-抗體反應。
11.如權利要求10中所述的診斷劑體系，其中抗基質金屬蛋白酶-8抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
12.如權利要求10中所述的診斷劑體系，其中基質選自硝酸纖維素膜，96-孔聚乙烯樹脂培養板，96-孔聚苯乙烯樹脂培養板和載玻片。
13.如權利要求10中所述的診斷劑體系，其中產色素酶選自過氧化物酶，堿性磷酸酶和生物素。
14.如權利要求10中所述的診斷劑體系，其中熒光劑選自FITC和TRITC。
15.如權利要求10中所述的診斷劑體系，其中著色劑選自4-氯-1-萘酚，二氨基聯苯胺，氨乙基咔唑，2，2’-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，鄰-苯二胺和N-四甲基聯苯胺。
16.一種診斷試劑盒，其包含權利要求9的診斷劑體系。
17.如權利要求16中所述的診斷試劑盒，其中試劑盒包含抗基質金屬蛋白酶-8抗體，標準的基質金屬蛋白酶-8，基質，分析緩沖劑，連接產色素酶-或熒光化合物的次級抗體，和粘著平板覆蓋物。
全文摘要
本發明涉及一種產前診斷早產、胎兒感染和胎兒損傷的方法，和診斷用的診斷劑體系和診斷試劑盒。方法、診斷劑體系和試劑盒是基于這個發現，即當孕婦處于早產、子宮內感染和胎兒損傷的危險中時，羊水中MMP－8的水平明顯較高。診斷劑體系和試劑盒可用于不具有以及具有早產或胎膜早熟破裂的臨床信號的患者。由于與測量胎血細胞因子水平的常規方法相比，在靈敏度和特異性方面的優勢以及它較小的侵襲力，該診斷劑體系和試劑盒在早產、胎兒感染和胎兒損傷的產前診斷方面是非常有用的。
文檔編號C12Q1/37GK1476537SQ01819269
公開日2004年2月18日 申請日期2001年8月1日 優先權日2000年11月21日
發明者尹保鉉 申請人:財團法人索爾大學校產學協力財團