一種基于酵母微囊的口服靶向載體系統及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基于酵母微囊的口服靶向載體系統的制備方法，即通過酵母微囊與表面帶正電荷的納米粒之間的靜電作用構建口服藥物靶向遞送系統與口服靶向成像系統的方法。
【背景技術】
[0002]口服給藥因其良好的安全性、便捷性與患者依從性是目前臨床藥物治療中使用最為廣泛的給藥方式。然而，由于胃腸道獨有的解剖學特點和生理屏障的限制，口服后大多數藥物吸收較差，導致其生物利用度低，進而影響正常療效的發揮。近年來，納米技術、材料學、高分子化學及藥學等學科交叉研究的深入發展，大大推動了口服藥物遞送系統的研究進程。現有的口服藥物微粒遞送系統在增強藥物口服吸收、提高藥物口服生物利用度、腸道粘附釋放、結直腸局部靶向釋放及腸道藥物轉運等方面已取得了諸多的進展，為大量難溶性藥物的口服給藥提供了較為理想的載體系統。比如，利用脂質體、固體脂質納米粒、聚合物納米粒、聚合物膠束等微粒系統，可以顯著增加抗腫瘤藥物的口服吸收、并提高其生物利用度。而通過調控這些微粒系統的理化特性(包括粒徑大小、載體材料組成、表面親疏水性、表面電位等)，或在微粒表面引入靶向單元，可以進一步改善其吸收的速度和程度。不過，當前廣泛研究的口服遞送系統仍大多局限于以增加藥物吸收和提高生物利用度為目的的消化道靶向(如腸道粘附系統、PH響應性結腸靶向遞送系統等)或淋巴系統靶向。由于口服后吸收轉運途徑的復雜環境，迄今為止，針對胃腸道以外病灶部位的口服靶向藥物遞送系統的開發依然面臨巨大挑戰。
[0003]另一方面，有關新型靶向藥物遞送系統的大量研究已清楚地表明靶向釋藥在提高藥物療效的同時，可顯著降低藥物的非靶效應引起的不良反應和毒副作用。然而，與靜脈給藥的靶向藥物遞送系統的快速發展相比，口服靶向藥物遞送系統的研究相對滯后。因此，亟需新的策略來構建新型口服遞送系統，以實現口服后非胃腸道病灶部位的靶向。大量研究表明，沙門氏桿菌、酵母真菌等微生物可經胃腸道感染，大量分布于體內巨噬細胞。而單核/巨噬細胞與炎癥、動脈粥樣硬化及腫瘤等多種疾病的發生發展密切相關。通過單核/巨噬細胞實現病灶部位的靶向是近年來新興的藥物靶向策略，并可基于單核/巨噬細胞在病灶局部的募集效應實現相應疾病的靶向治療。
[0004]1996年，法國學者Le Pape首次采用具有巨噬細胞靶向特性的乙酰化1，3_葡聚糖經放射性元素锝標記，實現了關節炎的成像，從而開啟了單核/巨噬細胞靶向遞送系統研究的先河。隨著材料學、仿生學及分子藥劑學的發展，基于單核/巨噬細胞靶向已成為新型藥物靶向遞送系統中的重要組成部分，并因其廣泛的疾病相關性而備受關注，其在炎癥相關疾病的靶向治療與成像診斷方面表現出巨大的應用潛力。
[0005]通過模擬沙門氏桿菌、酵母真菌等微生物胃腸道感染行為，有望實現口服后藥物的單核/巨噬細胞靶向遞送，進而實現炎癥、動脈粥樣硬化、腫瘤等單核/巨噬細胞相關疾病的靶向治療。近年來的諸多研究表明，分布于酵母等真菌細胞壁表面的i3-l，3_D-葡聚糖是其經消化道系統感染進入體內單核/巨噬細胞過程中機體識別的重要抗原。更具突破性的研究表明，酵母來源的β -1, 3-D-葡聚糖顆粒可通過沙門氏桿菌、酵母真菌等微生物胃腸道感染的途徑，由集合淋巴濾泡(Peyer’s patch)部位的M細胞(Microfold cell)轉運至腸相關淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue)，通過單核/巨.細胞及樹突狀細胞表面Dectin-1受體對β -1, 3-D-葡聚糖的識別作用吞噬并轉運至機體單核/巨噬細胞。

【發明內容】

[0006]為實現口服后藥物和造影劑的靶向遞送，本發明基于仿生學原理，通過模仿微生物經消化道系統性感染的途徑，利用酵母微囊(Yeast capsule)表面的β _1，3_D_葡聚糖來構建可高效負載納米粒的新型口服靶向遞送系統，并基于單核/巨噬細胞的募集作用成功實現炎癥、腫瘤部位等疾病的口服靶向成像與靶向治療。該方面的工作目前未見于國內外文獻報道中。鑒于此，本發明的目的是提供一種基于酵母微囊的口服靶向載體系統及其制備方法。
[0007]本發明所述的基于酵母微囊的口服靶向載體系統由酵母空微囊和表面帶正電荷的納米粒組成，其中正電荷納米粒分布于酵母微囊內部；所述酵母空微囊與表面帶正電荷的納米粒的質量比在10:0.1到10:20之間。
[0008]所述酵母空微囊為酵母菌經酸、堿及有機溶劑處理后得到的主要由β -1, 3-D-葡聚糖組成的微囊結構，其中酵母菌包括但不限于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁有抱漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)、季也蒙有抱漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)、畢赤克魯維酵母(Pichiakluyver)、膜撲畢赤酵母(Pichia membranefaciens)、美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、紅冬抱酵母(Rhodosporidium mucilaginos)和假絲酵母(Candidazemplinina)。
[0009]具體地，所述表面帶正電荷的納米粒選自表面帶正電荷的量子點、表面帶正電荷的氧化鐵納米粒、表面帶正電荷的載藥納米粒、以及表面帶正電荷的納米膠束，其表面電位在1mV至70mV之間，粒徑在5nm至400nm之間。所述表面帶正電荷的載藥納米粒包括但不限于負載了疏水藥物吲哚美辛、舒林酸、甲氨喋呤、維甲酸、吉非貝齊、阿伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、紫杉醇、多西紫杉醇、長春新堿、雷帕霉素、坦羅莫司、依維莫司、地磷莫司、阿霉素或輕喜樹堿的正電荷納米粒。
[0010]制備時，首先稱取一定量的酵母空微囊，并加入一定體積的去離子水或緩沖液中，超聲至均勻分散后恒溫孵育一定時間；待酵母空微囊完全溶脹后，加入表面帶正電荷的納米粒溶液，分散均勻后恒溫孵育0.5?72小時，然后離心、并水洗，干燥后即得到內部負載了表面帶正電荷納米粒的酵母微囊。
[0011]上述制備方法中，所述恒溫孵育的溫度在4°C到80°C之間。
[0012]所述恒溫培養的時間在0.5小時到72小時之間。
[0013]所述酵母空微囊混懸液濃度在lmg/mL到100mg/mL之間。
[0014]所述正電荷納米粒溶液濃度在0.05mg/mL到100mg/mL之間。
[0015]本發明的優點如下:
[0016]1.本發明所使用的酵母菌為商品化的食品添加劑，價格相對低廉，安全性較高；
[0017]2.本發明所采用的酵母微囊的制備方法簡單，重復性好，易于實現相應制劑的規模化生產；
[0018]3.本發明在負載納米粒的酵母微囊系統的制備過程中未使用有機試劑，保證了最終負載系統的安全性，且符合制藥領域綠色環保的宗旨；
[0019]4.本發明所制備的酵母微囊載體系統可高效負載不同的正電荷納米粒；
[0020]5.負載量子點和氧化鐵等具有造影功能的酵母微囊載體系統，可通過單核巨噬細胞的募集作用，靶向至關節炎、腫瘤和動脈粥樣硬化斑塊部位，實現口服后對應不同疾病的造影;
[0021]6.本發明所制備的酵母微囊系統中負載的正電荷載藥納米粒可以靶向至關節炎、腫瘤和動脈粥樣硬化斑塊部位，有效提高病灶局部藥物的濃度，實現靶向治療的目的。
【附圖說明】
[0022]圖1為由釀酒酵母菌制備獲得的未負載正電荷納米粒的酵母空微囊的透射電鏡圖片，標尺大小為Iym;
[0023]圖2為采用鈣熒光白染料對酵母空微囊表面β-1, 3-葡聚糖染色后的的激光共聚焦圖片，標尺大小為5 μ?? ;
[0024]圖3為負載有發射波長分別為620nm、540nm、525nm和450nm量子點的酵母微囊的激光共聚焦圖片，標尺大小為5 μπι ;
[0025]圖4為負載有氧化鐵納米粒的酵母微囊的透射電鏡圖片，標尺大小為500nm;
[0026]圖5為負載有表面帶正電荷的吲哚美辛/聚乙烯亞胺聚合物納米粒的酵母微囊的透射電鏡照片，箭頭所指為吲哚美辛/聚乙烯亞胺聚合物納米粒，標尺大小為I μπι。
[0027]圖6為負載了發射波長為620nm的量子點的酵母微囊(QD620/YC) 口服后在急性炎癥模型小鼠足趾腫脹部位聚集的活體熒光成像圖。
[0028]圖7為負載了氧化鐵納米粒的酵母微囊(10NP/YC) 口服后在急性炎癥模型大鼠足趾腫脹部位聚集的核磁共振圖。
[0029]圖8為負載了氧化鐵納米粒的酵母微囊(10NP/YC) 口服后在荷Walker 256異位瘤的大鼠體內的腫瘤部位聚集的核磁共振圖。
[0030]圖9為負載吲哚美辛(IND)/聚乙烯亞胺納米粒的酵母微囊口服后在急性炎癥局部，即小鼠足趾腫脹部位聚集。
[0031]圖10為負載了紫杉醇/熊去氧膽酸/聚乙烯亞胺納米粒(PTX-UDCA NP)的酵母微囊口服后在荷B16F10黑色素瘤小鼠腫瘤局部的靶向富集。
【具體實施方式】
[0032]盡管有文獻報道將酵母微囊用于負載核酸類藥物，以靶向巨噬細胞，從而實現系統炎癥的治療或介導機體免疫應答。但將其用于納米粒的負載和遞送面臨諸多限制。首先，目前文獻報道的方法僅僅將不同納米粒吸附于酵母微囊表面，該方法的負載效率低，且在生理條件下易于解吸附，口服后無法實現預期效果。同時，納米粒在酵母微囊表面吸附時，其對納米粒理化性能的依賴性也不明確。其次，國內外尚無研究證明完整的納米粒(包括無機和貴金屬納米粒、自組裝納米粒、聚合物膠束等)可以擴散進入酵母微囊內部。本發明創新性地提出基于酵母微囊與正電荷納米粒之間的靜電作用，通過正電荷納米粒的自發沉積過程來制備納米粒負載型酵母微囊系統；其中除核后酵母微囊內部殘留的部分物質帶有負電荷，而待負載的納米粒(包括納米造影劑和載藥納米粒)表面帶有正電荷；通過簡單的孵育即可將正電荷納米粒負載于酵母微囊內部，進而實現口服靶向造影劑或口服靶向給藥系統。
[0033]更具體地說，本發明采取的措施如下:首先稱取一定量的酵母空微囊，將其加入一定體積的去離子水或PH在5.0到11.0之間的緩沖液中，超聲至均勻分散，得到酵母空微囊濃度在lmg/mL到100mg/mL之間的混懸液，于4°C到80°C孵育一定時間；待酵母空微囊完全溶脹后，加入濃度在0.05mg/mL到100mg/mL之間的表面帶正電荷的納米粒溶液，分散均勻后于4°C到80°C孵育0.5?72小時，然后離心、并水洗，干燥后即得到內部負載了正電荷納米粒的酵母微囊系統。
[0034]下面結合非限定性的實施例對本發明做詳細說明。
[0035]實施例1
[0036]首先，取Ig釀酒酵母分散于15mL濃度為IM的氫氧化鈉溶液中，于80°C恒溫孵育I小時后轉速3000rpm離心10分鐘，棄上清，雙蒸水洗滌2次后，加入15mL雙蒸水分散均勻；再用濃度為2.5M的鹽酸溶液調節pH至4-5，60°C恒溫孵育I小時后轉速3000rpm離心水洗2次，去上清，再加入10mL異丙醇洗滌4次后，用10mL丙酮洗2次，離心棄上清，真空干燥后即得釀酒酵母空微囊。
[0037]然后，將釀酒酵母空微囊分散于100 yL的pH 6.0的磷酸緩沖液中制得濃度為lmg/mL的空微囊混懸液，200C下恒溫孵育0.5小時，再加入50 μ L濃度為0.05mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化銨表面修飾的最大發射波長在450