專利名稱：一種檢測血小板微粒的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測血小板微粒的方法。
背景技術：
血液細胞微粒(Microparticles, MP)是一類存在于血液中，由多種細胞(如血小板、白細胞、淋巴細胞、紅細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞等)受刺激活化或凋亡而脫落的超微膜性囊泡。其中，血小板微粒(Platelet Microparticle, PMP)約占血液中MP總量的70% 90%。血小板微粒(PMP)膜上攜帶有靜息狀態下血小板膜上的多數活性成分，因此像血小板一樣具有促進止血和加速凝血的功能；此外，PMP膜也攜帶活化血小板膜上的標記物，不僅具有很強的促凝活性，也具有一定的抗凝活性，在人體血栓與止血過程中發揮重要作用，因此對PMP形成機制的研究具有重要意義。由于多數PMP的直徑小于O. 5 μ m，常規方法的靈敏度和分辨率不夠，不能用普通顯微鏡觀察到其形態，不能用包括血小板計數儀在 內的常規方法來檢測。許多早期的學者，通過測定含血小板微粒懸液中無機磷的含量，來推算磷脂的量，進而推算出血小板微粒的量。這種方法非常不準確，而且十分繁瑣。目前通用的PMP檢測方法為電鏡和流式細胞術。但電鏡需要對PMP進行固化和噴金處理以實現PMP的導電性，因此檢測樣品制備繁瑣、困難，且難以定量。流式細胞術利用PMP大小與表面抗原特性來研究PMP的形成時，一般將直徑小于O. 5 μ m的顆粒均視為PMP，但是這一范圍內的顆粒很可能是其他血細胞碎片或雜質顆粒，因此需利用多種血小板特異性熒光抗體對PMP做進一步的識別，然而過多的熒光抗體不僅價格昂貴，而且干擾因素較多，造成PMP檢測結果出現偏差。因此很有必要建立一種靈敏、精確、定量的PMP檢測方法。近年來SICM技術通過改進定位及掃描控制技術實現了在生理液態培養條件下實時、非接觸式地對活體生物樣品表面三維微觀結構的探測。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種先通過SICM高分辨直觀地定性研究血小板活化后血小板微粒的形成，再利用流式細胞術定量分析這些血小板微粒數量的檢測血小板微粒的方法。本發明的技術方案概述如下一種檢測血小板微粒的方法，包括如下步驟( I)血小板樣品的制備取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入
I.5-2mLPBS緩沖液后備用；(2)取200 μ L細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板微粒的數量；
(3)將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極；(4)用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖；(5)向細胞培養皿中加入激活劑，作用60分鐘，通過計算機繪制得到加入所述激活劑60分鐘后血小板表面形貌的三維拓撲結構圖，并定性地觀測血小板微粒的形成；
(6)取200 μ L加入了激活劑的細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的數量。所述激活劑為凝血酶或ADP,所述凝血酶的加入量是使凝血酶的終濃度為2U/mL,所述ADP的加入量是使ADP的終濃度為5 μ M0本發明的方法排除了其它血細胞碎片和污染顆粒對血小板微粒(PMP)檢測的影響，定性定量地檢測了 ΡΜΡ，無需染色及任何特殊處理，節省了血小板特異性抗體用量，提高了 PMP形成檢測的準確性。
圖I為本發明所涉利用探針跳躍式SICM顯微鏡技術進行非接觸式、高分辨率實時檢測5 μ M ADP血小板活化后三維形態變化及PMP的形成過程。(圖IA為加入ADP前SICM掃描圖；圖IB為加入ADP 60分鐘后SICM掃描圖)。圖2為本發明所涉利用流式細胞儀得到的在加入激活劑ADP前(Α)、后(B)培養皿上清液中PMP數量的變化圖。
具體實施例方式實施例I一種檢測血小板微粒的方法，包括如下步驟( I)血小板樣品的制備取健康人2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，150Xg離心15分鐘得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL人纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入I. 5mL PBS緩沖液后備用；(2)取200 μ L細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板微粒的數量(見圖2Α)；(3)將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極；(4)用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的恒定距離(即探測電極與血小板不發生任何物理接觸)，記錄下所述探測電極的位置(記錄下在掃描范圍內達到距血小板表面設定距離時探測電極的位置)，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖(見圖1A，20 X 20 μ m)；(5)向細胞培養皿中加入激活劑ADP，使其終濃度為5 μ M，作用60分鐘，通過計算機繪制得到加入所述激活劑60分鐘 后血小板表面形貌進行觀測，并定性地觀測到PMP的形成(見圖 1Β,20Χ20μπι)。(6)取200 μ L加入了激活劑的細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的數量(見圖2Β)。實施例2一種檢測血小板微粒的方法，包括如下步驟( I)血小板樣品的制備取健康人2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，150 Xg離心15分鐘得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL人纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育20分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入2mL PBS緩沖液后備用；(2)取200 μ L細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板微粒的數量;(3)將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極；(4)用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的恒定距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖；(5)向細胞培養皿中加入激活劑凝血酶，使其終濃度為52U/mL，作用60分鐘，通過計算機繪制得到加入所述激活劑60分鐘后血小板表面形貌的三維拓撲結構圖，并定性地觀測到PMP的形成；(6)取200 μ L加入了激活劑凝血酶的細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的數量。實驗證明，選用腎上腺素或膠原作激活劑，也可以用于本發明。Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過PMP外側暴露的磷脂酰絲氨酸與PMP膜結合，利用Annexin V-APC藍色熒光的強弱反映血小板活化后形成PMP的多少。我們采用直徑為I μ m和O. 5 μ m兩種微球作為內參對照進行PMP尺寸定標并確定PMP的直徑閾值。在對血小板微粒的數量進行定量分析時，向200 μ L上清液中加Λ 200 μ L質量濃度為1%的多聚甲醛固定后，用Annexin V-APC標記ΡΜΡ，在室溫孵育后按流式細胞儀操作程序上機分析。以流式細胞儀所得激光的前向角散射(forward scatter)的對數散點圖來表示PMP的大小及數量，并進行定量分析，分析結果見圖2。上述所說的從血小板微觀形貌變化來探測PMP形成的設備由掃描離子電導顯微鏡，包括掃描離子電導顯微鏡掃描頭、掃描控制器及信號采集處理器、壓電陶瓷電源與驅動器等構成，用于實時記錄血小板在加入一定濃度激活劑前后微觀形貌的變化及PMP的形成。
上述所說的掃描離子電導顯微鏡采用英國ionscope公司掃描離子電導顯微鏡及圖像處理軟件。上述所說的體外生理液態掃描環境為PBS緩沖液。上述所說的納米吸管(硼硅酸鹽或石英微電極玻璃毛細管)均由微探針拉制儀拉制而成。 上述所說的流式細胞儀采用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀。
權利要求
1.一種檢測血小板微粒的方法，其特征是包括如下步驟 (1)血小板樣品的制備 取2毫升靜脈血放入檸檬酸鈉抗凝管中，離心后得到富血小板血漿；取200 μ L所述富血小板血漿放置于涂覆有200 μ L濃度為2mg/mL纖維蛋白原的35mm細胞培養皿中室溫下孵育20-30分鐘，用PBS緩沖液洗脫未粘附在所述細胞培養皿底部的血小板后，加入I. 5-2mLPBS緩沖液后備用； (2)取200μ L細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板微粒的數量； (3)將連接在掃描離子電導顯微鏡的Ag/AgCl參比電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中；將連接在掃描離子電導顯微鏡的探測電極放置在步驟(I)獲得的細胞培養皿中，所述探測電極是一設置在充灌有PBS緩沖液的納米吸管內的Ag/AgCl電極； (4)用掃描離子電導顯微鏡監控流入探測電極電流的變化，通過負反饋控制使得跳躍的探測電極與血小板間保持設定的距離，記錄下所述探測電極的位置，通過計算機繪制得到血小板表面形貌的三維拓撲結構圖； (5)向細胞培養皿中加入激活劑，作用60分鐘，通過計算機繪制得到加入所述激活劑60分鐘后血小板表面形貌的三維拓撲結構圖，并定性地觀測血小板微粒的形成； (6)取200μ L加入了激活劑的細胞培養皿中的上清液，利用流式細胞儀定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的數量。
2.根據權利要求I所述的一種檢測血小板微粒的方法，其特征是所述激活劑為凝血酶或ADP，所述凝血酶的加入量是使凝血酶的終濃度為2U/mL，所述ADP的加入量是使ADP的終濃度為5 μ M0
全文摘要
本發明公開了一種檢測血小板微粒的方法，包括如下步驟(1)血小板樣品的制備；(2)定量分析血小板微粒的數量；(3)將連接在掃描離子電導顯微鏡的參比電極和探測電極放置在培養皿中；(4)繪制血小板表面形貌的三維拓撲結構圖；(5)繪制加入激活劑60分鐘后血小板表面形貌的三維拓撲結構圖,并定性地觀測血小板微粒的形成；(6)取加入激活劑的細胞培養皿中的上清液，定量分析血小板在激活后形成的血小板微粒的數量。本發明的方法排除了其它血細胞碎片和污染顆粒對血小板微粒(PMP)檢測的影響，定性定量地檢測了PMP，無需染色及任何特殊處理，節省了血小板特異性抗體用量，提高了PMP形成檢測的準確性。
文檔編號G01N15/14GK102645398SQ20121015663
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者劉麗, 張建寧, 張彥軍, 董京飛 申請人:天津醫科大學總醫院