利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構建的用于檢測dna堿基的生物傳感器的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于DNA堿基檢測技術領域，具體涉及一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾電極構建的生物傳感器檢測DNA堿基的新方法。
【背景技術】
[0002]堿基是核酸分子的主要組成部分，核酸分析在生物化學和分子生物學研究中有著極為重要的意義，廣泛應用于傳染病、流行病、腫瘤和遺傳性疾病的臨床檢測、環境監控等方面。電化學因其操作簡便、快速、靈敏等特性而受到國內外科研人士的廣泛認可，運用電化學的方法進行核酸分析更是成為國內外研究的熱點。
[0003]核酸分子中的腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在儲存遺傳信息和蛋白質的生物合成中扮演著重要角色。在DNA雙螺旋結構中嘌呤與嘧啶的比值介于0.8 -1.0之間，比值異常和癌癥、衰老等一些疾病密切聯系。此外，一些肉類尤其是牛肉，新鮮的海洋食物和豆科植物中富含嘌呤體。然而，大量的肉類物質攝入會增加痛風、高尿血癥等一些疾病的發病率。依據Watson-Crick的堿基互補配對原則，DNA中嘌呤和嘧啶濃度是相匹配的，由此看來，簡單有效測定DNA樣品中堿基濃度是十分必要的。

【發明內容】

[0004]本發明目的在于克服現有技術缺陷，提供一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構建的用于檢測DNA堿基的生物傳感器。
[0005]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構建的用于檢測DNA堿基的生物傳感器，該生物傳感器包括工作電極、輔助電極和參比電極，其中，所述工作電極為哌嗪修飾的還原性氧化石墨稀修飾的玻碳電極，其經下述步驟獲得:
1)將殼聚糖溶液和哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯溶液等體積混合后，超聲分散0.5-lh，然后靜置1 一 3h獲得復合材料，再次超聲震蕩、漩渦分散均勻后，滴加到潔凈的玻碳電極表面，晾干成膜；
2)在步驟1)所得玻碳電極的膜表面滴加全氟磺酸溶液，晾干成膜，即得。
[0006]具體的，步驟1)中，所述殼聚糖溶液濃度為0.5wt%，呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀溶液濃度為4mg/ml。
[0007]目前為止，有很多用于測定堿基的方法，如高性能液相色譜法、離子對高效液相色譜法、毛細管電泳法、流動注射化學發光光譜法等，這些方法均存在費時、成本高、靈敏度低、預處理過程復雜等缺點。電化學分析方法提供了方便、快捷的方式來檢測堿基且價格低廉，靈敏度高。DNA的氧化性損傷一般發生在嘌呤堿基上，其中鳥嘌呤因具有最低氧化電位而最容易被氧化。結合納米材料及一些生物大分子成功構建出了生物傳感器，實現了不同堿基的電化學氧化過程;通過電化學測定:不同堿基都有其相對應的氧化電位，不同濃度堿基所檢測到的電流存在差異，這就是本發明DNA樣品中堿基測定的主線。
[0008]哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯是一種功能化納米材料，因其具有高的熱導率、良好的機械強度、高比表面積等優點而受到科研人員的關注。本發明選取哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯為主導材料修飾的電化學工作電極，從而實現DNA堿基在電極上的電化學氧化，達到堿基測定的目的。
[0009]和現有技術相比，本發明的有益效果:
本發明是以納米材料呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀(rGO-NH)為基體修飾工作電極構建了一種新型的納米生物傳感器，實現了脫氧核糖核酸堿基的電化學檢測。其中，工作電極的構建是通過哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯與殼聚糖(CHI)特定條件下自組裝修飾并用全氟磺酸(Naf1n)修飾加以牢固而獲得。本發明成功構建出了穩定且高效的新型生物傳感器，結合堿基的電化學氧化過程可以實現對脫氧核糖核酸堿基進行單獨或同時檢測，并且具有較寬的線性檢測范圍、較低的檢測限、較高的靈敏度、且干擾反應少、反應條件溫和，還能夠實現實際樣品中堿基的檢測。
【附圖說明】
[0010]圖1為實施例1中哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾的玻碳電極的構建示意圖；
圖2為固定鳥嘌呤(G)濃度25μΜ，胸腺嘧啶(T)濃度250μΜ，腺嘌呤(A)濃度從0 — 400μΜ的差分脈沖伏安測定結果；
圖3為固定腺嘌呤(Α)濃度20μΜ，胸腺嘧啶(Τ)濃度200μΜ，鳥嘌呤(G)濃度從0 — 200μΜ的差分脈沖測定結果；
圖4為固定腺嘌呤(Α)濃度25μΜ，鳥嘌呤(G)濃度25μΜ，胸腺嘧啶(Τ)濃度從0 — 2000μΜ的差分脈沖測定結果；
圖5為小牛胸腺DNA和鯡魚精子DNA的測定結果。
【具體實施方式】
[0011]以下結合實施例對本發明的技術方案作進一步地詳細介紹，但本發明的保護范圍并不局限于此。
[0012]下述實施例中，殼聚糖購自生工生物(上海)股份有限公司。哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯購自南京先豐納米材料科技有限公司(rGO-NH)。全氟磺酸溶液(Naf1n溶液)，也稱作全氟磺酸原液，購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。
[0013]0.5%殼聚糖溶液的配制:稱取50mg殼聚糖粉末加入到10ml含1￥%醋酸的雙蒸水溶液中，攪拌至完全溶解，用微量大濃度氫氧化鈉溶液調節其pH至5?6，分裝備用。
[0014 ] 4m g /m 1呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀溶液的配制:稱取4m g呢嘆修飾的還原性氧化石墨烯超聲分散于lml雙蒸水中，可采用超聲與漩渦震蕩混合進行，以保證其充分分散。
[0015]玻碳電極的清潔處理:分別使用粒徑為lμm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁對玻碳電極表面進行打磨，打磨至呈鏡面，依次在75V%Z醇溶液、雙蒸水中進行震蕩清洗，取出。利用電化學工作站三電極體系(輔助電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極為玻碳電極)觀察其循環伏安曲線。具體為:將初步清洗過的玻碳電極置于含100mM、pH 7.0的PBS緩沖液(即磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)中，連接三電極，打開CHI 650C電化學工作站，選取循環伏安法(設定參數:電壓范圍為-ο.1V?1.8V，掃描速度為50mV/s，四個循環)開始循環伏安掃描，觀察其循環伏安圖譜，若無雜峰說明清洗干凈，取出，雙蒸水沖洗后放入干燥皿中備用。
[0016]實施例1
如圖1所示，一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構建的用于檢測DNA堿基的生物傳感器，該生物傳感器包括工作電極、輔助電極(鉑電極)和參比電極(Ag/AgCl電極)，其中，所述工作電極為呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀修飾的玻碳電極，其經下述步驟獲得:
1)將0.5%殼聚糖溶液和4mg/ml哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯溶液等體積(5yL)混合后，超聲分散約0