一種豬胃腸道內容物代謝組學提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于代謝組學技術領域。具體設及一種豬胃腸道內容物代謝組學提取方 法。
【背景技術】
[0002] 應激與斷奶綜合癥等因素引起的仔豬腸道健康問題是導致仔豬死亡和養豬生產 效益下降的重要原因。仔豬消化不良會引起腹瀉和細菌感染，并引起免疫力下降，發病率增 加，甚至死亡。由于飼料到達腸道后首先會經過腸道菌群的作用，所W腸道菌群在飼料消 化、吸收和代謝W及菌群代謝物在影響宿主代謝中均扮演著重要角色。腸道菌群作為定植 在腸道中的特殊群落和腸黏膜細胞一起參與日糧碳水化合物、氨基酸、脂質等營養物質的 代謝，對飼料營養物質的代謝和利用產生深遠的影響。比如，腸道微生物對腸腔內尿素的水 解和對日糧氨基酸的脫氨基作用會導致用于體蛋白質合成和沉積的日糧氨基酸分解和損 失，特別是必需氨基酸。豬腸道微生物與黏膜對氨基酸的競爭利用并共代謝，腸道微生物和 腸黏膜的蛋白質周轉迅速且量大。受日糧因素和腸黏膜分泌物的刺激，腸道微生物可通過 調節自身的基因表達和蛋白分泌，W適應腸道內環境2。腸道微生物可W代謝氨基酸產生氨 和其他氨基酸等代謝物，也能利用氨態氮合成氨基酸。因此，腸道微生物不僅對碳水化合物 代謝具有影響，而且可W調節宿主的氨基酸池和氮周轉。
[0003] 隨著代謝組學研究的不斷深入和研究領域的不斷拓展，腸道內容物代謝組學研究 也成為了目前代謝組學的熱點應用領域之一。腸道內容物代謝組的研究方法，主要可W分 為菌群代謝足跡和代謝指紋的研究方法，菌群代謝足跡是對其微生物體外代謝產物的表征 和變化規律的研究，而代謝指紋是對其微生物體內所有代謝物的定性和定量研究，其關系 見圖1所示。通過代謝指紋的表征可W得到微生物代謝的最直接證據，實時的反映其代謝 的過程和行為，而通過代謝足跡則可W得知其代謝的結果，而且往往代謝足跡有蓄積的作 用，該樣就可W放大代謝指紋的結果，更加利于檢測和表征。
[0004] 目前關于腸道內容物代謝組的研究剛剛起步，尚有許多方法學的問題有待解決。 一方面，不同腸段的抑值變化非常大，成年豬胃內容物的抑值在2. 0-3. 5之間、空腸和回 腸抑值在6. 0-7. 5、盲腸抑值在4. 5-6. 0之間、結腸和直腸抑值在5. 0-8. 0之間。內容物 從胃到直腸被排出體外，抑值也從2變化到8左右。該主要與內容物中酸性和堿性物質組 成和比例相關。此外，pH值還會隨著攝入食物的組成和胃腸道狀態而出現變化。所W，胃 腸道內容物的抑值可能存在從2到8的一段較大的動態范圍。而內容物中的不同成分，對 抑值的反應也會不同，該對內容物中化合物的提取造成了較大影響。并且基于NMR的代謝 組學分析方法中，NMR檢測對抑值有著嚴格要求，因為抑值對化學物質的化學位移有著大 的影響。所從對于基于NMR的代謝組學研究中，找到針對于胃腸道內容物合適的抑值是 十分必要的。其次，胃腸道內容物組成研究中，最為普遍的方法是氨基酸和短鏈脂肪酸的檢 測方法。由于進行氨基酸檢測時，需要高溫mere)和強酸條件下消解6,無法保留腸道內 容物的原貌，特別是短鏈脂肪酸。而短鏈脂肪酸的檢測方法也不能檢測氨基酸等其他的化 合物。腸道菌群除了產生甲酸、己酸、丙酸和了酸等短鏈脂肪酸外，還會產生其他重要的代 謝物。比如，采用氯仿、甲醇和水提取法提取到枯草桿菌包括糖酵解和=駿酸循環代謝物的 上百種物質。
[0005] 因此，由于代謝組學分析需要保持代謝物的原貌而且力圖檢測到盡量多的代謝 物，該就需要對目前存在的提取方法進行篩選和優化，避免溫度過高、操作過于繁瑣和提取 效率較低的提取方法，進而找到適合于胃腸道內容物代謝組學分析的提取方法。
[0006] 現有尹富貴等采用的腸道內容物氨基酸提取方法：稱取凍干回腸末端內容物 0. 5g置于安培瓶中，加入6mol/L鹽酸10ml后混勻，密封。110°C消化2化，定容至100ml， 吸取2ml經0. 25m微孔濾膜過濾，用k8800型全自動氨基酸分析儀測定15種氨基酸（Phe、 Tyr、Leu、116、￥31、413、617、43口、6111、切3、化3、1^73、4巧、1'虹和561')的含量，然后乘!^稀 釋倍數換算成內容物中氨基酸的含量。其缺點是采用濃硫酸和硝酸高溫消解腸道內容物蛋 白質和氨基酸，具有耗時，環境污染大等缺點。
[0007] 現有腸道內容物短鏈脂肪酸提取方法：高增兵等取盲腸內容物3g，用蒸饋水進行 稀釋（質量體積比1 ;1)，振蕩混勻至無明顯結塊的懸浮狀。500Xg離屯、lOmin，取上清 液2血至新EP管中，12000Xg離屯、lOmin，取上清液1血，加入25 %的偏磯酸0. 2血，充分 混勻，靜置30min后12000Xg離屯、lOmin，取上清液100^以加入甲醇100^以充分混勻 并12000Xg離屯、lOmin，收集上清液于EP管中，-20°C冰箱保存待測。采用氣相色譜儀 (VARIANCP-3800,美國）測定己酸、丙酸、了酸濃度進行。其缺點是采用偏磯酸和甲醇提取 短鏈脂肪酸，操作較為繁瑣，具有耗時較長，環境污染大等缺點。而且只能檢測到3種短鏈 脂肪酸。
[000引另外，李春慧等稱量解凍的盲腸內容物2g，加入蒸饋水10血，4°C浸泡4她；然后 4°C，500化/min離屯、lOmin，取上清液1血，加入25 %的偏磯酸去蛋白溶液0. 2血，混勻，冰浴 30minW上；冰浴后，立即4°C，lOOOOr/min離屯、lOmin，取上清液備用。用微量移液槍吸取 0. 6UL待測液進樣，采用氣相色譜測定己酸、丙酸、了酸、異了酸、戊酸、異戊酸和總VFA的 含量。其缺點是提取程序耗時較長。雖然可W同時測定己酸、丙酸、了酸、異了酸、戊酸、異 戊酸的濃度，但由于僅僅針對性檢測短鏈脂肪酸，不能同時檢測氨基酸W及其他的化合物。

【發明內容】

[0009] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種豬胃腸道內容物代謝組學提取方法。
[0010] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0011] 所述豬胃腸道內容物代謝組學提取方法包括如下步驟：
[0012] (1)用1M化OH溶液和1M肥1溶液將解凍的豬胃腸道內容物的抑值調整到2.0- 12.0,優選為8.0;
[0013] (2)取豬胃腸道內容物加入0. 1M或1M的磯酸鹽緩沖液中，豬胃腸道內容物與磯酸 鹽緩沖液的質量體積比為1:20至1:2,優選為1:10,質量體積比的單位為g/mU經液氮速凍 后，于水浴鍋中超聲解凍，然后置于組織破碎儀中破碎；將破碎后的豬胃腸道內容物再重復 液氮速凍、超聲解凍、破碎儀破碎處理2-3次，優選2次；
[0014] 做將經步驟似處理后的豬胃腸道內容物于4°C、12000巧m離心取上清液，取上 清液0.6血加入5mm核磁管待檢，上清液即為豬胃腸道內容物的提取物。
[001引優選地，內容物提取過程于冰上（0-4°C)或室溫（25°C)條件下操作。
[0016] 優選地，用水配制步驟（2)所述的磯酸鹽緩沖液，所用的水中重水含量為10-100%，優選100%，所用TSP內標濃度為0.005-0. 1%，優選0.01%，配制后的磯酸鹽緩沖 液的抑值為7.0-8.0,優選8.0。
[0017] 優選地，用甲醇和水混合溶液配制步驟（2)所述的磯酸鹽緩沖液，所用TSP內標濃 度為0. 005-0. 1 %，優選0. 01 %，配制后的磯酸鹽緩沖液的抑值為7. 0-8. 0,優選8. 0。
[0018] 優選地，用己膳和水混合溶液配制步驟（2)所述的磯酸鹽緩沖液，所用TSP內標濃 度為0. 005-0. 1 %，優選0. 01 %，配制后的磯酸鹽緩沖液的抑值為7. 0-8. 0,優選8. 0。
[0019] 本發明所述的提取方法是抑值校正后磯酸鹽緩沖液提取新方法，不僅保證了胃 腸道內容代謝物組成的原貌，將核磁譜峰漂移減小到最低程度，提高了核磁譜圖的質量，同 時簡化了提取工藝流程。通過對提取工藝流程的優化，方法如下；稱量解凍的胃腸道內容 物Ig采用1M化OH溶液和1M肥1溶液將抑值調整到8.0,然后稱取0.Ig混勻的內容物 (冰上操作，W保證在0-4°C)，加入0. 1M磯酸鹽緩沖液（抑值8. 0,0.01%TSP，100 %重 水）1.OmU液氮速凍后，水浴鍋中超聲并解凍后，置于組織破碎儀中（20化，30s)，如此反復 凍融、超聲和破碎處理3個循環。最后，4°C，12000巧m離屯、lOmin，取上清液0.6血加入5mm 核磁管備用。可檢測代謝物51種，其中氨基酸20種，短鏈脂肪酸7種，=駿酸循環代謝物 5種，其他代謝物19種，整個提取過程僅需化。譜峰漂移受抑值影響很小。因此，該提取 方法不僅提高了代謝物的提取率，提高了核磁譜圖的質量，而且簡化了提取流程，實現了內 容物中代謝物的全譜檢測。
[0020] 現有技術包括氨基酸提取工藝、短鏈脂肪酸提取工藝等，提取操作程序復雜，耗時 較長，由于使用大量有機溶劑，成本高，環境污染較大，也無法實現內容物所有組分的同時 檢測。為了在既保證豬胃腸道內容物提取率的前提下，又最大程度的簡化提取工藝，降低提 取成本。本發明直接采用磯酸鹽緩沖液提取法替代鹽酸消解和偏磯酸提取法，同時簡化提 取流程，盡量減少操作對實驗結果的影響，保持內容物代謝物組成的原貌。并在樣品提取前 對抑值進行校正，W保證核磁譜峰漂移最小，最終達到既保證水溶性代謝物的提取效率最 高，又能明顯改善核磁譜峰的質量，為胃腸道內容物代謝組學研究提供新的樣品提取方案。
【附圖說明】
[0021] 圖1為腸道菌群代謝指紋與代謝足跡的代謝組學研究方法示意圖；
[0022] 圖2為NMR譜積分后主成分分析的得分圖，箭頭代表樣品點在得分圖上的分布變 化，楠圓形框則代表出現2個明顯聚類，即抑值7. 0到抑值8. 5和抑值10. 0到抑值 12. 0 ;
[0023] 圖3為提取磯酸鹽緩沖液中重水含量為5%、10%、50%和100%的壓水峰核磁譜 圖（①為5 %重水，②為10 %重水，⑨為50 %重水，④為100 %重水）；
[0024] 圖4為提取緩沖液中TSP濃度0. 005、0. 01、0. 05到0. 1 %的TSP譜峰（①為 0. 005%，②為 0.01%，⑨為 0.05%，④為 0.1%);
[0025] 圖5為提取緩沖液中TSP濃度為0. 1 %的TSP譜峰；
[0026] 圖6為不同提取溫度NMR譜積分后主成分分析的得分圖（□表示在冰上（0-4°C) 提取樣品，▲代表在室溫（25°C)提取樣品）；
[0027] 圖7仔豬盲腸內容物NMR譜圖；檢測到代謝物包括；1，甲酸；2,己酸；3,丙酸；4， 了酸成a-酬甲基-正戊酸；6,酬異己酸；7,酬異己酸；8,異亮氨酸；9,亮氨酸；10,鄉 氨酸；11，丙氨酸；12,蘇氨酸；13,賴氨酸；14,脈氨酸；15,精氨酸；16,脯氨酸；17,谷氨 酸；18,谷氨酷胺；19,蛋氨酸；20,甘氨酸；21，天冬氨酸；22,天冬氨酷；23,酪氨酸；24， 色氨酸；25,苯丙氨酸；26,組氨酸；27,牛橫酸；28,S甲胺；29,肌酸；30,肌酢；31，膽堿； 32,甲醇；33,a-木糖；34,尿喀晚