一種磺胺類的檢測方法及其檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種抗生素殘留的免疫化學快速檢測技術，具體設及橫胺類的檢測方 法及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 橫胺類（Sul化namides，SAs)是具有對氨基苯橫酸苯橫酷結構的合成抗菌素的總 稱，是乳品中主要的藥物殘留之一。人體中長期存在橫胺藥物會導致許多細菌對橫胺藥物 產生耐藥性，且有潛在的致癌性。歐盟規定牛奶和肉類食品橫胺類藥物總量《100 yg/kg。 美國規定牛奶中橫胺類藥物的MRLs為10 y g/L。我國農業部2002年12月發布的《動物性 食品中獸藥最高殘留限量》規定牛奶中橫胺類藥物的最高殘留限量為0.1 mg/L。
[0003] 目前，針對橫胺類獸藥殘留的檢測方法有薄層色譜、高效液相色譜法、液質聯用、 氣相色譜、氣質聯用；酶聯免疫吸附巧LISA)、膠體金免疫技術等。該些方法都各有優缺點， 傳統的液相色譜分析方法，一次只能檢測一個樣，且只能檢測單種橫胺類藥物，如橫胺喀 晚、橫胺二甲基喀晚等，由于其前處理過程復雜、儀器化程度高、操作繁瑣，所W-般只在經 費比較多的檢測機構作確證試驗。而在普通政府質檢機構、企業等大眾基層實驗室，應用最 多的是化ISA方法。ELISA方法經過多次洗脫過程，標記物酶易失活，底物見光易分解，環境 干擾因素復雜等缺點。膠體金層析法可W滿足現場快速的要求，但是只能定性檢測無法得 到定量結果。
[0004] 現有一些橫胺類定量檢測試劑盒，如已公開專利CN 202649209 U橫胺類藥物 ELISA檢測試劑盒、CN 102079788 A -種檢測橫胺藥物的方法及其專用酶聯免疫試劑盒，公 開的試劑盒均采用是酶聯免疫分析方法。酶聯免疫分析方法是采用固相吸附分離的方法， 需要固相材料吸附捕獲抗體-待檢抗原-標記抗體，由于標記抗體為過量，所W檢測前均需 要洗漆去除未參加反應的標記抗體。此時，通過檢測與待測抗原結合的標記抗體，才能與待 測抗原呈正比例關系。
[0005] 固相吸附分離方法有兩個重要環節；包被和洗漆。固相吸附分離方法設計巧妙，操 作簡單，故應用非常廣泛。但是，此種非均相反應模式因包被和洗漆環節的存在，給標記免 疫分析造成很大缺陷，主要表現在W下兩個方面：
[0006] 1.在包被過程，無論物理吸附還是化學連接，包被于固相材料表面的抗體分子其 構象不同于處于液相中的抗體分子，與抗原分子結合能力因空間位阻效應將受到一定限 審IJ;無論采用微球還是微孔板作為固相材料，由于包被面積有限，捕獲抗體分子不能最大限 度滿足大量待測抗原的需要，由此將影響檢測范圍。
[0007] 2."洗板"或"洗球"是非均相免疫分析中的重要環節且多次出現。洗漆過程增加 檢測程序的復雜性，增加檢測時間并給實現自動化帶來障礙。此外，由于洗漆過程特別是酶 免疫分析，難于實現標準化，每個測試孔之間洗漆效果不同，在一定程度上影響檢測的精密 度，出現批間、批內差異。

【發明內容】

[000引本發明的目的在于提供一種橫胺類的檢測方法及檢測試劑盒，W解決現有檢測方 法中試劑種類多，其方法操作繁瑣，檢測靈敏度低的問題。
[0009] 為實現本發明的目的，采用W下技術方案。
[0010] 一種橫胺類的檢測方法，包括如下步驟：
[0011] 1)配置具有濃度梯度的橫胺二甲基喀晚作為標準品；
[0012] 2)反應板每孔加入包被有橫胺二甲基喀晚抗體的受體微球，生物素化橫胺二甲基 喀晚；之后，分別在各孔加入待測樣品、步驟1)制備的標準品；
[001引扣振蕩，室溫或37 °C避光解育；
[0014] 4)每孔加入包被鏈霉親和素的供體微球，振蕩條件下室溫或37°C避光解育；
[0015] 5)結果讀取；將反應板置于均相免疫檢測儀上讀數；
[0016] 6)檢測結果分析：根據標準品檢測的結果繪制標準曲線，將樣品的檢測結果對應 標準曲線，即可獲得檢測樣品中橫胺類的含量。
[0017] 如上所述的檢測方法，優選地，所述受體微球的濃度為10 y g/血~30 y g/mu所 述供體微球的濃度為10 y g/mL~30 y 3/1111^，所述生物素化橫胺二甲基喀晚濃度為3 y g/ ml ~10 y g/mL。
[001引如上所述的檢測方法，優選地，所述受體微球的緩沖溶液為含有質量百分比為 0. 2% BSA，體積百分比為0. 02% Proclin-300的PBS溶液，所述生物素化橫胺二甲基喀晚 的緩沖液為PBS溶液，所述供體微球的緩沖溶液為終濃度為25mM 4-哲己基嗽嗦己橫酸 化E陽巧，lOOmM 化CI0.0 5% Proclin-300,抑7. 4 的溶液。
[0019] 對樣品進行前處理，采用樣品稀釋液進行處理，所述樣本稀釋液為含有體積比為 0. 1% txiton X-100 的 PBS 溶液。
[0020] 如上所述的檢測方法，優選地，采用76 y L反應體系，所述受體微球的加入量為 25 y以所述生物素化橫胺類抗原的加入量為8 y以所述樣品或標準品的加入量為35 y以 所述供體微球的加入量為8 y L。
[0021] 如上所述的檢測方法，優選地，所述步驟（3)中37°C避光解育的時間為5min~ lOmin，所述步驟（4)中37°C避光解育的時間為5min~lOmin。
[0022] 如上所述的檢測方法，更優選地，所述步驟（3)中37°C避光解育的時間為5min，所 述步驟（4)中37°C避光解育的時間為lOmin。
[0023] 如上所述的檢測方法，優選地，所述步驟（6)檢測結果分析包括：
[0024] a.用所獲得的每個濃度的標準品溶液的巧光計數值除W橫胺二甲基喀晚濃度為 0的巧光計數值再乘W 100%，得到百分巧光計數值；W橫胺二甲基喀晚標準品濃度的半對 數值為X軸，百分巧光計數值為Y軸，繪制標準曲線圖；
[0025] b.按步驟a所述的百分巧光計數值計算方法，計算所述待測樣品的百分巧光計數 值，相對應該待測樣品的百分巧光計數值，則可從標準曲線上讀出所述待測樣品中橫胺類 的含量。
[0026] 一種橫胺類的檢測試劑盒，其特征在于，其包括：受體微球、供體微球、生物素化橫 胺二甲基喀晚和橫胺二甲基喀晚標準品；
[0027] 其中，所述受體微球包被有橫胺二甲基喀晚抗體，所述供體微球包被有鏈霉親和 素。
[002引如上所述的檢測試劑盒，優選地，該試劑盒還包括所述樣本稀釋液，所述樣本稀釋 液為含有體積比為0. 1% txiton X-100的PBS溶液。
[0029]本發明提供的橫胺類的檢測試劑盒，通過特異性的抗原抗體反應將納米微珠對極 大的拉近，級聯化學發光反應將信號放大，有效的提高橫胺類檢測的精度。該檢測試劑盒 中的檢測試劑穩定，靈敏、準確，具備適用面廣、檢測范圍寬、靈敏度高、特異性強、檢測通量 大、線性范圍較寬等優點。
[0030]采用本發明提供的橫胺類檢測方法，進行橫胺類的檢測時，操作簡單、混合后即可 測定，避免了傳統免疫分析中洗脫、分離等繁瑣過程，一方面，有效降低了非特異性反應的 可能性W及背景噪音的影響，顯著提高了分析效率和檢測靈敏度；另一方面大大縮短檢測 時間，并可在現場快速檢測乳品中的橫胺類殘留，檢測全過程控制在20min之內，檢測限符 合中國及歐盟的限量標準。
[0031]利用本發明提供的橫胺類的檢測試劑盒，進行橫胺類檢測的靈敏度為0. 94 y g/l， 檢測范圍為0. 94-1000 y g/l，高出現有技術化ISA的檢測靈敏度。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明一優選實施例檢測橫胺類的標準曲線。
【具體實施方式】
[003引本發明的橫胺類檢測的原理，采用抑制法免疫均相檢測待測樣品中的橫胺類。當 樣品中沒有橫胺類時，反應液中的生物素化橫胺二甲基喀晚，與偶聯有橫胺二甲基喀晚抗 體的受體微球結合，再加入偶聯有鏈霉親和素的供體微球，由于生物素與鏈霉親和素結合， 就會形成受體微球-橫胺二甲基喀晚抗體-橫胺二甲基喀晚-生物素-鏈霉親和素-供體 微球的聚合物。在激光（波長680nm)的照射下，供體微球上的光敏劑將周圍環境中的氧氣 轉化為更為