同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫檢測技術領域，特別涉及同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒及 其制備方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，越來越多的證據證明了炎癥反應在抑郁癥疾病發生、發展過程中的作用， 很多的炎性因子和相應的可溶性受體、趨化分子、粘附分子、急性期蛋白等會在抑郁癥患者 的外周血、腦脊液中顯著上升，抑郁癥的個別癥狀如疲勞、認知障礙及睡眠障礙等與炎性因 子之間的關系也被不斷報道。該些抑郁癥相關的生物標志物可W用于輔助臨床診斷及預后 評價，將為抑郁癥的客觀診斷提供生物學證據。進一步經過我們應用600多份血清樣本對 文獻報道的抑郁癥相關因子進行了大樣本量篩選驗證，初步確定了腦源性神經營養因子、 皮質醇、表皮生長因子、髓過氧化物酶、催乳素、抵抗素、可溶性腫瘤壞死因子a受體II型 作為抑郁癥輔助診斷的生物標志物。
[0003]目前市場上有很多檢測相關因子的傳統的單項化ISA技術，其成熟度高，特 異性好，操作簡便。但通常的酶聯免疫吸附化ISA檢測樣本時，每個檢測孔一般需要 100-200 y 1，樣本用量較大，另外抑郁癥的生物標志物不止一個，需要多個因子的聯合監 測來進行診斷，在該樣的情況下若仍依賴于單項化ISA檢測，則樣本用量過大；對每個因子 單獨檢測來輔助抑郁癥的診斷顯然費時費力，且診斷成本高昂，患者一般難W承受。
[0004] 放射免疫分析方法RIA技術，它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量 的高靈敏度，但存在放射線福射和污染等問題，而且對檢測人員的健康也構成威脅，并且， 操作相對于化ISA復雜，一次檢驗只能測一個指標，還需要提供專口的放射性實驗場所，投 資局，危害大。
[0005] 蛋白芯片雖然能實現多個因子同時檢測的功能，但由于它是把抗體包被在用于制 備蛋白質芯片的基底玻片、微球或膜上，并且基底玻片和膜在使用前要經過酵基化或多聚 賴氨酸等預處理，導致生產成本增加，并且后續實驗操作繁瑣，，重復性差，難于推廣。
[0006]因此，免疫檢測技術領域急需一種基于化學發光的工藝簡單、便于操作、靈敏度 高，能同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒及其制備方法。

【發明內容】

[0007] 本發明提供了同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒及其制備方法，技術方案如 下：
[0008] 同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒，其特征在于，包括：
[0009] 試劑盒、并且該試劑盒內含有用腦源性神經營養因子抓NF、表皮生長因子EGF、髓 過氧化物酶MP0、和催乳素Prolactin四種抗原及相應抗體W矩形陣列排布包被的表面經 過等離子化且四壁經過鍛膜處理的酶標板、稀釋液、一份陽性血清對照樣本、一份陰性血清 對照樣本、洗涂劑、生物素化的檢測抗體、酶SA-HRP、發光液。
[0010] 同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0011] 第一步，制備抗體包被的酶標板；
[0012] 配制含有腦源性神經營養因子抓NF、表皮生長因子EGF、髓過氧化物酶MP0、和催 乳素 Prolactin 為 ng/mL 于 0. 01-0. lmol/1 的磯酸鹽緩沖溶液中；
[0013] 進一步地，用全自動點樣儀提取lO-lOOnl的上述含有四種特異性因子的磯酸鹽 緩沖溶液，點樣于用等離子處理過的酶標板的孔中；
[0014] 進一步地，將點樣好的酶標板置于2-8C的溫度下包被16-24小時；
[0015] 第二步，對第一步中酶標板分別進行德注、封閉、洗涂、瞭干后，再保存起來待用；
[0016] 首先，向PH值為7. 4 + 0. 2的磯酸鹽緩沖液中，依次加入0-0. 05%的聚氧己帰山梨 醇單月桂酸單脂Tween20和3%的牛血清白蛋白BSA，攬拌均勻后，向第一步中的酶標板中德 注；或向PH值為7. 4 + 0. 2的磯酸鹽緩沖液中，依次加入0-0. 05%的聚氧己帰山梨醇單月桂 酸單脂Tween20和5-10%的脫脂奶粉，攬拌均勻后，向第一步中的酶標板中德注；
[0017] 進一步地，將該德注好的酶標板放在2-8C的溫度下封閉放置16-24小時或者放 在37C下封閉放置2 + 0. 5小時，或者室溫封閉3 + 0. 5小時；
[0018] 進一步地，用含有非離子型表面活性劑Tween20的PBS溶液對封閉好的酶標板進 行洗涂、瞭干后，置于2-8C的溫度下保存待用；
[0019] 第H步，上樣，并將酶標板放入賠育振蕩器中賠育；
[0020] 首先，取多份病人的血清樣本、1份經篩查過的正常人的陰性對照樣本和1份陽性 對照樣本；
[0021] 進一步地用PH值為7. 4 + 0. 2的含有1%BSA、0. 05%Tween的PBS樣本稀釋液進行 樣本稀釋；再將稀釋好的待測樣本加入相應于第二步中處理的酶標板孔中；
[0022] 進一步地，將加好溶液的酶標板放入賠育振蕩器中，在18-25C的室溫條件下反應 1小時；
[0023] 第四步，加入檢測抗體并賠育；
[0024] 用含有Tween的PBS作為洗液，對第H步中反應后的酶標板洗涂后，再分別向酶標 板的每個孔中加入檢測抗體；放入賠育振蕩器反應；
[00巧]第五步，加入酶SA-HRP中并賠育；
[0026] 用含有Tween的PBS作為洗液，對第四步中反應后的酶標板洗涂4次，再對試劑盒 中SA-HRP進行稀釋后，分別向酶標板的每個孔中加入稀釋后的溶液，放入賠育振蕩器中反 應；
[0027]第六步，用CCD成像儀拍攝成像，并結合圖像分析軟件計算出圖像的IDV值，根據 IDV值繪制標準曲線，并且計算出樣本濃度結果；
[0028] 首先，將穩定的過氧化物酶溶液與含增強劑的魯米諾底物溶液W 1:1混合配制成 發光液；
[0029] 進一步地，用含有Tween的PBS作為洗液，對第五步中反應后的酶標板洗涂4次， 向酶標板每個孔中加入配制好的發光液，在1-10分鐘內用CCD成像儀拍照成像；
[0030] 進一步地，由與CCD成像儀配套的圖象分析軟件將拍攝的圖像處理成IDV值；
[0031] 進一步地，根據IDV值繪制標準曲線，并且計算出樣本濃度結果；
[0032] 第走步，運用softMax回歸模型和Excel表格對樣本濃度結果進行計算和統計學 分析，經綜合分析，對該多份病人血清樣本的檢測結果為100%陽性，即敏感性為100%。
[0033] 如上所述的同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒的制備方法，其中，第一步中，用 全自動點樣儀點樣，是將四種抗體點置在化ISA孔板內的距離板孔中也等距離矩形的四個 邊緣交叉點上，形成矩形陣列化的捕獲表面。，
[0034] 如上所述的同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒的制備方法，其中，第一步中的 酶標板的表面經過等離子化且四壁經過鍛膜處理。
[00巧]本發明的有益效果是：
[003引1.本發明實現了多因子的同時檢測，提高了檢測效率，節約了檢測成本，使患者易 于接受，并且節省了樣本用量，避免了因樣本量不足無法完成多次單項檢測的弊端。
[0037] 2.本發明對于四種特異性因子的定量檢測，檢測限能夠達到0.Ipg/ml，從而具有 更高的檢測靈敏度，能夠定量的檢測低豐度和下調表達的生物標志物。
[0038] 3.本發明將線性范圍從現有的2-311og提高到了 4-511og，從而具有更寬的線性 范圍，寬的線性范圍能夠定量的檢測上調和下調兩種情況下的因子，能夠更好的評價效率。
[0039] 4.本發明率先將矩形陣列運用到抑郁癥的生物標志物檢測中，將抗體探針點置在 ELISA孔板內的矩形圈頂點上，形成矩形陣列化的捕獲表面，從而獲得一致性好的抗體陣 列，促使了反應更加均勻、穩定，數據重復性好。
[0040] 5.本發明通過通過矩形陣列設計與板處理技術，使不同的探針位點之間具有非常 高的一致性，該兩種技術的結合使產品的檢測數據具有非常高的重復性，能夠提高診斷的 準確程度。
[0041] 6.本發明的四種抑郁癥標志物結合在經過等離子處理的酶標板上，能增強與抗體 蛋白的有效結合，并且四壁是通過鍛膜處理的，使其不會結合蛋白，從而降低非特異結合對 背景的影響，提高靈敏性。
【附圖說明】
[0042] 下面結合附圖和【具體實施方式】來詳細說明本發明：
[0043] 圖1是本發明BDMP根據IDV值繪制的標準曲線。
[0044] 圖2是本發明EGF根據IDV值繪制的標準曲線。
[004引圖3是本發明MP0根據IDV值繪制的標準曲線。
[0046] 圖4是本發明Prolactin根據IDV值繪制的標準曲線。
【具體實施方式】
[0047] 為了使本發明的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具 體圖示，進一步闡述本發明。
[0048] 本發明提供了同時檢測四種抑郁癥標志物的試劑盒，包括：
[0049] 試劑盒、并且該試劑盒內含有用腦源性神經營養因子抓NF、表皮生長因子EGF、髓 過氧化物酶MP0、和催乳素Prolactin四種抗原及相應抗體W矩形陣