專利名稱：中型多核苷酸擴增裝置的制作方法
本申請是1994年9月19日提交的美國申請號08/308,199的部分繼續，而后者又是1992年5月1日提交的美國申請號07/877,662的繼續申請，它的公開內容在此引入作為參考，本申請還與普遍認可的美國申請號[Attorney Dockct No.H-1203/1222]同時提交，后者是以下三個申請的部分繼續，美國申請號07/877,702(1992年5月1日提交)，08/196,021(1994年2月14日提交)，08/250,100(1994年5月26日提交)的部分繼續，以上三者的公開內容都在此引入作為參考。發明背景概括地說，本發明涉及對多核苷酸進行擴增和做各種分析的方法和裝置。更具體的說，本發明涉及一些典型的，任意使用的微型組件的設計和構建，這些微型組件是用于包括多核苷酸擴增反應如聚合酶鏈式反應(PCR)的多種分析。
近幾十年來，本領域涌現出大量實驗方案，檢測試劑盒及藥盒，它們為各種診斷和監測目的進行生物樣品分析。免疫測定法，免疫度量測定法，凝集反應測定法以及以多聚核苷酸擴增反應(如聚合酶鏈式反應)為基礎的各種分析，或基于各種配體-受體相互作用及/或基于復合樣品中各組合的不同遷移而進行的分析，所有這些都常用來鑒定各種生物化合物或污染物的存在或濃度，或用來鑒定特定細胞的存在。
近些年來已陸續發明了一些用于處理生物樣品和進行某些臨床試驗的小而可任意使用的裝置。Shoji等曾報道過很薄的硅片上造成的微型血的氣體分析儀的使用，Shoji et al.，Sensors and actuators，15101-107(1988)。Sato等報告過用微型機加工的硅裝置進行細胞融合的技術。Sato et al.，Sensors and actuators，A21-A23948-953(1990)。Ciba Corning Diagnostics Corp.(USA)曾制造了一臺用于診斷血凝塊的微型計算機控制的激光光度計。
使用了諸如硅物質的微型機加工技術使得微操縱裝置的制作有很小的結構元件，從上十個微米(生物細胞的大小)到幾個納米(僅相當于一些生物大分子的大小)。Angell et al.，Scientific American，24844-55(1983)。Wise et al.，Science，2541335-42(1991)和Kricka et al.，J.Int.Fed.Clin.Chem.，654-59(1994)。大多數包含這種大小的結構的實驗與微觀力學有關，即機械運動和流動特征。這些結構的潛在用途在生命科學領域還沒有被充分開發。
Brunette(Exper.Cell Res.，167203-217(1986)和16411-26(1986)研究了存在于涂覆有硅，鈦等多聚物等凹槽中的成纖維細胞和表皮細胞的行為。McCartney等(Cancer Res.，413046-3051(1981))檢測了在塑料凹槽中腫瘤細胞的形為。LaCelle(BloodCells，12179-189(1986))觀察了白細胞和紅細胞在微毛細血管中的流動，試圖獲取關于微循環的信息。Hung和Weissman報道過在微型機加工的管道中流體動力學的研究，但沒有得出與分析裝置有關聯的數據，Hung et al.，Med. and Biol.Engineering，9237-245(1971)；和Weissman et al.，Am.Inst.Chem.Eng.J.，1725-30(1971)，Columbus等在實驗性的多頻道測試裝置中使用了一個三明治式的裝置，這個裝置包含兩塊互相垂直并有V-型槽浮凸的板，這兩塊板又被用于控制生物流體向獨立的有離子選擇性的電極的毛細管式流動。Columbus et al.，Clin.Chem.，331531-1537(1987)。Masuda等人和Washizu等曾報道過用液流小室進行細胞操作(如細胞融合)。Masuda et al.，Proceedings IEEE/IAS Meeting，pp.1549-15539(1987)；和Washizu et al.，Proceedings IEEE/IAS Meeting pp.1735-1740(1988)。硅物質可用來發展一些微型裝置如pH計和生物傳感器。McConnell et al.，Science，2571906-12(1992)；和Erickson et al.，Clin.Chem.，39283-7(1993)。但用這種裝置進行生物流體分析的潛力至今沒有很好地開發。
用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段的方法學已很成熟了。(參見Mainatis et al.，Molecular CloningA Labaratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989， pp.14.1-14.35.)PCR擴增反應以DNA鏈為模板進行，并且要有熱穩定的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶(Chien et al.，J.Bacteriol.，1271550(1976))，三磷酸核苷和兩段序列不同的寡核苷酸(“引物”)，它們分別與模板DNA鏈兩端的序列互補且位于待擴增的DNA序列的側面。反應在高溫和低溫之間反復循環，高溫(如94℃)使雙鏈模板DNA變性(“熔解”)隨后低溫(如40-60℃使引物退火，如70-75℃進行聚合)。這種在變性退火和聚合溫度間進行的重復循環反應可以使模板DNA幾乎呈指數擴增。比如，長達2kb，起始含量僅10-6μg的DNA片段經30-35次擴增循環可以得到高達1μg的目的DNA片段。用熱循環器進行自動PCR擴增反應的機器是可以購得的(Perkin ElmerCorp.)。
多聚核苷酸擴增反應已用于遺傳疾病的診斷(Engelke et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85544(1988)，臨床樣品中病原有機體核酸序列的檢測(Ou et al.，Science，239295(1988))，法庭上樣品如精子遺傳特征的鑒定(Li et al.，Nature，335414(1988))，活性癌基因的突變分析(Farr et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.851629(1988))以及許多分子克隆方面的應用(Oste，Biotechniques，6162(1988))。多核苷酸擴增反應還可以有更廣泛的用途，如擴增已克隆雙鏈DNA中特定序列作為探針，通過選擇性擴增cDNA的特定片段獲得沒有克隆過基因的特異性的探針，從小量mRNA制備cDNA文庫，獲得大量DNA用以測序和作突變分析。
通過循環方法進行多核苷酸擴增反應領域中，已記述了很多種裝置和系統。Templeton，Diag.Mol.Path.，158-72(1993)；Lizardi etal.，Biotechnology，61197-1202(1988)；Backman et al.，Eur.Patent No.320308(1989)；和Panaccio et al.，Biotechniques，14238-243(1993)這些裝置采用一系列轉換的設計原則，如水浴，空氣浴和干物質的塊料如鋁。Haff et al.，Biotechniques，10102-112(1991)；Findlay et al.，Clin.Chem.，391927-33(1993)；Witter et al.，Nucl.Acids Res.，74353-7(1989)。在小反應體積中進行PCR反應也曾有描述。Wittwer et al.，Anal.Biochem.，186328-31(1990)；和Witt et al.，Clin.Chem.，39804-9(1993)。從硅制作成的多核苷酸擴增裝置也有介紹。Northrup et al.，inDigestof Technical PapersTransducers，1993(Proc.7th InternationalConference on Solid State Sensors and Actuators)Institute ofElectrical and Electronic Engineers，New York，NY，pp.924-6；和Northrup et al.，PCT WO 94/05414(1994)。
已知道硅顆粒可以與核酸結合，并已用于PCR分析之前的核酸的分離。Zeillinger et al.，BioTechniques，14202-3(1993)。當在這個領域中報導用硅和其它微型通道和小室進行各種分析時，但很少將注意力集中到通過對微型機加工中的硅或其它表面進行改良的方法上，從而降低由表面的結合或其它表面特性而引起抑制反應，如在裝置中進行的多核苷酸擴增反應。Northrup等曾描述過對硅底座中深0.5mm的PCR反應小室進行化學的硅烷化修飾。Northrup et al.，inDigeest ofTechnical PapersTransducers.1993(Proc.7th InternationalConference on Solid State Sensors and Actuators)Institute ofElectrical and Electronic Engineers，New York，NY，pp.924-6；和Northrup et al.，PCT WO 94/05414(1994)。但是Northrup等的參考文獻(inDigest of Technical PapersTransducers，1993)公開，未進行硅烷化，反應小室中未處理的硅表面對PCR反應也無抑制的影響。
需要有一個方便，快速的多核苷酸擴增的分析體系以使它能在臨床上以臨床檢測方法在有潛在應用的廣大范圍中應用，如父子判別檢測，遺傳及感染性疾病的檢測，還有在環境和生命科學中的各種各樣其他檢測等。需要發展以硅等物質制造的微型裝置，以達到物質表面對進行多核苷酸擴增反應沒有干擾效應，而使有高產率。
本發明的目標之一是提供多核苷酸擴增反應的小型分析裝置，并使擴增有好的反應環境，能夠檢測很低濃度的多核苷酸并迅速得出分析結果。另一個目標是提供易于大量制備，一次性使用，小的(比如，體積小于1cc)裝置，它包含一些功能元件，能在應用范圍中，對事先選定的全細胞或無細胞體系樣品進行快速的，自動的多核苷酸擴增分析。本發明進一步的目標是提供用于裝在實心底座如硅中的微型反應室的試劑以減少底座表面對多核苷酸擴增反應的潛在抑制效應。本發明另一個進一步目標是提供將試劑或樣品液體送到建造在實心底座如硅上的多核苷酸擴增小室和從中取出試劑和液樣的裝置，并提供在擴增反應時封閉反應小室的組件。本發明還有一個進一步的目標是提供可用于進行一系列快速臨床檢測的組件，如，檢測病毒、細菌感染、檢測細胞培養污染物、檢測細胞中某基因或重組DNA的存在，等等。
本發明的這些以及其它一些目標和特征在下面的說明書、附圖和權利要求書中會明顯體現出來。發明概述本發明提供一批小的，大量生產的，典型的一次性使用的裝置(這里有時叫做“chips”)，使樣品中多聚核苷酸進行快速擴增。在一個實施方案中，這個裝置包括一個制造有包括中型多核苷酸擴增小室的實心底座。本裝置也包括蓋子，如置于底座上方的透明蓋子，在進行多核苷酸擴增反應時，至少能蓋住反應小室的一部分。本裝置還包括一個與反應小室進行液體交換的開口，用以將樣品導入反應室(這里有時稱為“進樣口”或“進口”)。此裝置也可以包含一個或多個流體通道，從各個開口伸展到反應小室，和/或連接兩個或多個反應室。本裝置也可包含一個或多個附加的口以與反應室進行液體交換用作進口，進樣/出樣口和/或出口。裝置的一個或多個開口和/或流體通道可以制造在蓋上或制造在底座上。在這個裝置內，為反應小室提供某種組合物，以減少反應室內壁對多核苷酸聚合反應的阻抑作用。這個裝置還包括對反應小室的內容物進行溫度循環的方法以使樣品多核苷酸進行擴增。
“中型”這個詞用在這里指的是那些反應小室或流通通道，其中至少有一個它的截面中至少有一截面部分大小約為0.1μm～1000μm。導向反應室的流通通道的優選寬度和深度應在約2.0～500μm數量級。位于底座中進行擴增反應的小室可以有一種或多種更大的尺寸，如寬度和/或長度約1～20mm。而反應小室的優選寬度和長度大約5-15mm數量級。反應小室深度從0.1到最大1,000μm。典型的反應室可制作成深度為小于500μm，比如為小于300μm，也可挑選小于80μm。深度淺的如小于300μm的反應小室有利于向小室內容物轉移熱量，比如，通過底座可以使需要熱循環的擴增反應進行有效的熱循環。但是在一些實施例中制作成反應室的深度大約在500-1000μm之間。整個裝置的厚度尺寸取決于所采用的制作材料，是從微米級到幾個毫米，長度和寬度大約為0.2-5.0厘米。
當微量樣品從進樣孔，如穿過底座或頂蓋的交換孔，引入到流通系統，本裝置就可對其進行擴增和/或分析。典型的中型流通系統體積小于50μl，反應室體積常小于20μl，比如10μl或更少。在另一個實施方案中，個別通道和反應室的體積可小于1μl，如處于納升和皮升級。很低濃度的多核苷酸(如，納克級的含量)可以被快速擴增(如，不到10分鐘)并檢測。當多核苷酸擴增測定結束后，這個裝置即可丟棄或清洗后再用。
在一個實施方案中，環繞反應室各內壁的總表面積與反應室的體積比可做成大于3mm2/μl。反應室甚至也可做成更高的表面積/體積比，如5mm2/μl甚至選擇大于10mm2/μl。當表面積和體積的比增大時，熱通過底座傳到反應室內容物或從內容物中傳出都會容易，這樣反應的熱循環就變的更為有效，反應產率也會增加。但另外，當表面積與體積之比增大時，底座表面對多核苷酸擴增反應的潛在阻抑效應也相應增加。中型通道和反應室內壁表面干擾多核苷酸擴增反應，如，通過多核苷酸樣品或擴增試劑與表面材料的相互結合作用則取決于制作這裝置的材料。
本發明提供了一整套組合物以用于反應小室內表面，如硅表面，使減少對反應的潛在阻抑效應。在表面積與體積比大于3mm2/μl或5mm2/μl的反應室，或者在另外的實施方案中該比例超過10mm2/μl的反應室中，這些組合物就特別有用。此裝置也可包括位于反應室上面，在擴增反應中用以封閉反應室的蓋。這個蓋也可以包含如玻璃或硅、或塑料物的一類材料。應用按置在反應室上的蓋可以增加與反應室內流體的接觸表面面積的總數。面向反應室的蓋的那一面也可用這里公開的那些組合物處理，以減少蓋表面材料對擴增反應的潛在阻抑效應。
用在反應室中以減少反應室內壁對擴增反應潛在抑制效應的組合物可以是共價或非共價方式粘附到反應室內壁，也可在擴增反應中以溶液形式加在反應小室中。在一個實施方案中，裝置的一個或多個反應室和/或通道的內壁表面可以使用硅烷，用硅烷化試劑如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷涂覆(可從諸如Pierce，Rockford，IL等公司購得)。另外的方法，反應室和/或液流通道的內壁表面，例如用硅元素類的物質做成，也可以使用一層相對惰性的涂層，例如，使用一些硅化試劑，象AquasilTM或SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(Sigma Chenical Co.，St.Louis，MO)。從商業生產商如Pierce(Rockford，IL)或Sigma Chemical Co.，(St.Louis，MO)處購得的硅化試劑是包含一個可水解基團的有機硅烷，它能在溶液中水解形成硅烷醇，硅烷醇能多聚化并在反應室的內表面形成一層涂層，并能與小室表面的羥基作用，這樣就使膜緊緊結合在整個表面。這些硅涂層還可進一步包括與硅膜以共價或非共價締合的一種大分子(在這里有時被稱作“封閉劑”)，使進一步減少反應室內壁對擴增反應的阻抑效應。較有用的大分子包括氨基酸多聚物，或其它一些多聚物如聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸和聚順丁烯二酰亞胺。
硅底座內的反應室和/或通道內表面被以硅氧化膜也可以減少由壁表面引起的對擴增反應的阻抑效應。在氧存在的情況下硅底座被加熱，通過熱處理過程使形成硅氧化膜。另外也可利用等離子體加強的氧化作用或等離子體加強的化學蒸汽堆積過程。另外，反應室和/或通道內壁也可以用相對惰性的聚合物如聚氯乙烯涂布。
在反應室加入樣品多核苷酸和擴增試劑之前，可以先加入其它多核苷酸(這里有時稱作“封閉”多核苷酸)，如基因組DNA或多聚腺苷酸，其濃度最好要大于樣品多核苷酸的濃度。這樣，使封閉多核苷酸就占有反應室內壁表面上任何部位，這些部位可能潛在地與樣品多核苷酸結合并降低反應產率或分析準確性。因此，在一個實施方案中，通過在硅底座內的反應小室使用封閉多核苷酸，使它占據反應室內表面與多核苷酸結合的所有部位游離的羥基。為避免干擾擴增反應，封閉多核苷酸應含有與樣品多核苷酸無關的序列。其它可與反應室內表面結合的組合物如多聚鳥苷酸或各種多肽如酪蛋白或牛血清白蛋白也可用作封閉劑。此裝置可在反應室中進行多核苷酸擴增反應，如聚合酶鏈式反應(PCR)。反應室中可以加入用于PCR的試劑，包括樣品多核苷酸聚合酶，三磷酸核苷，可與樣品多核苷酸雜交的第一引物，及與樣品與多核苷酸有互補序列因而也可雜交的第二引物，這里第一引物和第二引物限定為多核苷酸擴增產物的端部序列。裝置也包括對擴增反應室內容物進行熱循環的方法，這樣在每次循環中，溫度受到控制以進行，1)雙鏈多核苷酸變性(“熔解”)，2)引物向單鏈多核苷酸退火，及3)在引物之間合成擴增的多核苷酸。本領域中其它有用的擴增方法也可以采用，包括但不僅限于(1)靶多核苷酸擴增法如自身-持續的序列復制(3SR)和鏈替換擴增(SDA)；(2)以貼附在靶DNA上的信號的擴增為基礎的方法，如“支鏈DNA”擴增法(Chiron Corp.)；(3)基于探針DNA擴增的方法如連接酶鏈式反應(LCR)和QB復制酶擴增(QBR)；(4)其它各種方法如連接激活轉錄(LAT)，依賴于核酸序列的擴增(NASBA)，鏈修復反應(RCR)和循環探針反應(CPR)(這些方法的綜述可參見pp.2-7，The Genesis Report，DVol，3，No.4，Fe5，1994；Genesis Group，Montclair，N.T.)。
反應室可以被制造成一個部分，可以在多核苷酸擴增反應所需的溫度和，如常規的PCR反應那樣要求溫度循環之間進行有序的溫度循環。另外，反應室也可包含兩個或多個部分，這幾個部分分別設在變性，退火和聚合所要求的不同溫度。在這種情況下，裝置還應包含將反應室內容物在進行反應的幾個部分進行傳送的設備。如用計算機控制的泵。反應室至少一部分要有置于底座上的蓋。此裝置也還可包括本文所公開的對擴增的多核苷酸進行檢測的方法。可用于完成各種自動，敏感，快速的多核苷酸分析的裝置，包括細胞和溶液中分析多核苷酸的存在，或用已知的特定多核苷酸作為參照標志以分析病毒或細胞類型。
由實心底座設計和制造的中型流動通道和反應室可采用已建立起來的微型機械方法如照相影印石版術、蝕刻和后處理技術、激光機械加工，LIGA過程(Becker et al.，Microelec Eng，.435-36，1986)和塑料模子等。裝置中的中型流通系統可以由做在底座表面的流通通道及一個或多個反應室以及然后用粘附或夾緊放在表面上的蓋構成。實心底座和/或蓋可包括以下材料如硅、多聚硅、硅石、玻璃、砷化鎵、多聚酰亞胺、氮化硅和二氧化硅。另外蓋和/或底座也可包含塑料材料，如丙烯、多聚碳酸鹽、聚苯乙烯或聚乙烯。可任意選擇的話，蓋和/或底座可包含一種透明材料。
為使用本裝置也可供給一種附件，它含有支撐裝置底座的套架，并且他可任意選擇與底座上的一個或多個進樣口以及與附件上一個或多個流通線相配對。當估計含有某一特定多核苷酸的生物流體樣品加到進樣口后，就將底座放于附件上，開動泵，如位于此附件上的泵，就被啟動，從而推動樣品通過流通系統。另外，樣品也可以用此附件注射進入底座(如，安裝在此附件上的注射器)。反應需要的試劑，如聚合酶，在注射入底座之前可以加到多核苷酸樣品中(以液體或干粉形式)。另外，完成反應所需的各試劑能從單獨進樣口被注入到反應室，如通過此附件。流體樣品和試劑也可通過毛細管作用或通過重力進入中型流通系統。
本發明還提供了在擴增反應進行中為封閉一個或多個流體進樣口/出樣口用的方法。這就有效地防止了熱循環中液體的蒸發，因而能在擴增反應中保證最適的反應濃度。在一個實施方案中提供一種包含為把液體通過本裝置一個口進入反應室和從中取出的器具和適應于與這個口相互配合和/或相互封鎖的組件，當液體送入反應室后它能可逆地封閉這個口。例如，流體傳送儀器可包含注射器或移液器。一個實施方案中，流體移送可包含一個帶有移液器頭的移液器，移液器頭就可在移液器和通道之間轉移流體。這個管頭可任意地從移液器上取下并可被處理，以防止樣品之間的污染。
此裝置包括一個底座，底座含有熱導性材料如硅，以及置于底座上的蓋，蓋含有透明原料如玻璃或塑料。裝置還包括做在底座或蓋內的中型多核苷酸擴增室。蓋上可包含有為接受和與用于送樣品和試劑溶液到反應室和從中取出樣品和試劑溶液的移液器相互匹配的凹槽通道，當移液器在槽內合適時，此通道可以通過底座和/或蓋將移液器頭上的小孔與反應室之間溝通。移液器頭上的小孔可設在頭的某一側壁，使頭可以在兩個位置間移動，第一個位置可以使流體從頭通過頭上的開口和通道進入反應室，第二個位置是使頭上的小孔對著蓋上凹槽的側壁，從而達到在反應時封閉流通通道和反應室的目的。另外，也可設置一個可按壓的元件，從底座上延伸出來，當對著通道口按壓此元件時，就可以封閉通道口。
反應室內一個或多個部分的溫度可以受到調節，例如，在底座近反應室處安裝一個或多個電熱阻絲，或者用脈沖激光束或其它導向反應室的電磁能源。這個附件包括位于套架的電接頭，它與整合到底座結構內的電接頭配對，比如給反應室的電阻絲供電。附件中也可以裝備冷卻元件，以幫助反應室進行熱調節。這個附件中設有常規電路與裝置的傳感器互相交流，來對變性和聚合所需的循環溫度進行熱調節。
中型反應室內通過擴增反應產生的多核苷酸可以由底座上的口收集并檢測，另外，本領域內已知的特定試劑和方法可用來直接檢測反應室內的擴增產物(“Taq Man”TMPCR reagents and kit，availablefrom Perkin Elmer Corp.)。另一種方法，在底座中微制作一個中型檢測區，與本裝置的反應室可進行流體交換，作為中型流動系統的一個部分。檢測區可包括標記的結合部分，如標記的多核苷酸或抗體探針，能與擴增的多核苷酸進行可檢測的結合。這樣出現在檢測區的多核苷酸產物就可以被檢測，比如，多核苷酸多聚體形成的凝集和結合部分通過檢測區的玻璃蓋或底座本身半透明或透明的部分，進行光學檢測。另外，檢測區還可包括，為電泳分離和檢測擴增多核苷酸的一系列(電)泳道或微石印裝置。
陽性反應可以通過樣品流體流動特性的變化而顯示出來，例如由于反應室內擴增的多核苷酸產物導致流通系統中不同點上壓力和電導的變化。在一個實施方案中，本裝置包括中型流動系統，這個流動系統又包括多核苷酸擴增反應室和與附件聯合應用的檢測區(如，反應室或流動通道的一部分)，該附件含有傳感裝置例如分光光度計，通過，例如安置在檢測區上的光學小窗能讀出陽性結果。附件也可以設計成能接受壓力讀數，電導率以及其他的電信號指示數，而這些壓力讀數、電導率等是在反應室，檢測區或流通系統中其它區域中感受到的。
底座可以包括多個反應室和/或檢測室，使能對混合物中幾種多核苷酸同時進行快速平行擴增和/或檢測。中型流通系統中可包括突起部分或橫斷面面積減小的部分，以促使微量樣品中的完整細胞在進入反應室之前被裂解。邊緣鋒利的硅片插在流動通道途徑中，可以用作裂解的工具。中型流通系統也可包括細胞捕獲區，這個區又包括細胞結合區域，比如，固定化在流通系統的壁上，當流體流動速度較慢時，它可以結合異質細胞群體中一種特定的細胞類型，當流速較高或更換溶液的性質，例如在傳送進入細胞裂解區前又可以使這被結合的細胞類型釋放，然后進入反應室，在這個實施方案中，從選定的細胞亞群中分離胞內DNA或RNA，并送到同一裝置的中型反應室進行多核苷酸分析。在另外的實施方案中，結合劑也可以固定化在實心顆粒上，如膠乳珠或磁性珠，這在下面會有描述。
復合物形成介質，如涂覆多核苷酸探針的磁性珠，可以引入到中型流通系統，它們可以在如附件所提供的外加磁場作用下，沿著流通系統移動。固定化在磁珠上的多核苷酸探針能使磁珠與在反應室或單獨的檢測室中擴增出來的多核苷酸結合。比如，固定化有多核苷酸探針的小磁珠，可以在整個流通系統中流動或在擴增反應結束后導入反應室與擴增的多核苷酸產物結合。結合在磁珠上的多核苷酸可以隨小磁珠一起運到流通系統中的檢測或純化室，或者到收集口。或者，磁珠也可以選貯于裝置中某一事先定好的位置，當結合了多核苷酸產物以后再轉移到檢測或純化室。
表1對本裝置的一些特別和優點做了說明。本裝置可以快速檢測病原菌或病毒，或檢測某種細胞類型的存在，或細胞中某基因或重組DNA序列的存在。這里公開的這套裝置特征在于中型流通系統，包括有多核苷酸擴增反應室，最好要有至少一個中型反應室，用來擴增樣品中的多核苷酸，其中也可供給所需的擴增反應試劑。本裝置適用于很廣的應用范圍內多核苷酸的擴增，完成反應后，本裝置可棄去，或可清洗后再用表1特點 優點可變通性裝置設計的數量和可達到的用途不受限制可重復性本裝置可進行可靠的，標準化的批量生產低成本生產 與現有體系相比，本裝置在價格上有競爭力。有可以丟棄的性質能滿足一次使用的過程。體積小 不需要大型的儀器。適用于非常規化實驗室環境下可應用的可移動的單元和設計體系。并且貯存和運輸費用低。微型要求最少量樣品和試劑。降低試劑成本，尤其是對那些較昂貴的特殊的檢測程序。簡單化的測試儀器規劃。無菌本裝置能進行無菌處理以滿足微生物測定或要求其它清潔環境的操作處理。封閉體系生物危險事故減到最小，操作過程保證完善。復合通路功能在單一裝置中能完成多項反應或分析。可進行成組的反應。多樣性和檢測器功能 分析過程監測功能實質上擴展到任何系統。可供廣范圍應用。可重復使用的裝置使用者對某些應用，可減少每次操作的費用附圖簡述

圖1A是根據本發明的裝置10的縱斷面視圖，包括完整的實心底座14，其上面是用機械加工的中型流動通道20，與進樣孔16和多核苷酸擴增反應室22相聯，以及依附在底座表面的蓋子12。
圖1B是根據本發明的另一個實施方案裝置10的縱斷面視圖，包括實心底座14，其上是機械加工的中型多核苷酸擴增反應室22和進樣口16，以及底座上面連有的蓋12。
圖1C示意另一個實施例的裝置10的縱斷面視圖，包括完整的底座14，制造有中型多核苷酸擴增反應室22，蓋12上做有進樣口16和通道20，可與反應室22進行流體交換。
圖2A是圖1A裝置的透視圖。
圖2B是圖1B裝置的透視圖。
圖3A是一個套入附件50中的分析裝置10示意說明圖。附件50用來支撐裝置10，它包含有對裝置10中反應室22進行溫度調節的加熱元件57。
圖3B是一個套于附件50中的分析裝置10的示意說明圖，附件50用來支撐裝置10，它包含有對裝置10中的反應室22進行溫度調節的加熱元件53。
圖4是根據本發明的一個裝置的縱斷面視圖，包括一個實心底座14，其上面是機械加工的中型流動通道20，與之相連接的進樣孔16及反應室22，依附在底座上面的蓋子12。
圖5是圖4裝置的透視圖。
圖6A是套入附件50的一個分析裝置10的示意說明圖，附件50用來支撐裝置10，包含有對裝置10中反應室22進行溫度調節的加熱元件57。
圖6B是一個套入附件50中分析裝置10的示意說明圖，附件50可用于支撐裝置10，它包括在裝置10中反應室部位22A及對其調節溫度的熱元件57。
圖7是一個底座14的示意平面視圖，底座14上微制造有中型反應室部分22A和22B，當檢測室進行流體交流而檢測室又包含安置在底座上斷面順次遞減的流動通道分支體系40。
圖8是底座14上流動通道20一個截面透視圖，底座14帶有延伸到通道的某一壁上過濾細胞和碎片的突起80。
圖9是底座14上流動通道20一個截面透視圖，底座14帶有延伸到通道的某一壁上刺破細胞的突起90。
圖10A是一個包括反應室部分22A、22B和檢測室22C的中型分析裝置的平面示意圖，22A、22B、22C都微制造在底座14上。
圖10B是另一中型分析裝置的示意平面圖，包括反應室22A和22B，檢測區26，它們都微制造在底座14上。
圖11是又一個中型分析裝置的示意平面圖，包括微制造在底座14上的反應室22A。
圖12是一個分析裝置的示意平面圖，該裝置制造有多種中型小室，適合于完成各種包括細胞分選，細胞裂解及多核苷酸分析等的功能。
圖13是一個組合有二套分流流通通道系統40的分析裝置的示意平面圖。
圖14、15、16圖示了不同實施方案中微制造在一個分析裝置10中的流通通道20中的中型濾器24的頂部平面圖。
圖17是組件60的示意透視圖，和裝置10(未出示)聯合使用以觀察裝置10里面的情況。
圖18是圖17中組件60一個斷面圖。
圖19是包括底座14及透明蓋12一個裝置示意斷面圖，蓋上又含有接受移液器的凹巢87。
圖20是移液器頭84，包括頭端的開孔88的斷面示意圖。
圖21是底座14及裝配的構件85的斷面示意圖，構件85可以壓縮以封住口15及通道20。
圖22是一個組件透視示意圖，組件包括透明蓋12蓋上的凹巢87和流通過道20A，這個過道引向底座上的流通通道20B和反應室22。
圖23是一個說明在中型反應室中擴增的多核苷酸樣品在瓊脂糖凝膠電泳的模式圖。
在各自的圖中相似的參考特征表示相應的部分。這些附圖是不需要按比例的。發明詳述A.總述在本發明提供了小型，可大量生產，典型的一次性使用的裝置系列，可以用來進行多核苷酸擴增反應，使液體樣品中的多核苷酸快速擴增。本裝置包括實心底座，由至少包含一個多核苷酸擴增反應室組合成，典型的裝置長和/或寬大約0.1-5.0cm。穿過裝置厚度看，通道和反應室的斷面，可以是三角形的，截斷的錐形的，正方形的，長方形的，園形的或其它形狀。裝置也包括一個進樣口與反應室相通。裝置還包括另外的口(其功能可作為進口或進樣/出樣口，或出口)，可設在流通系統上方的任一位置，還有一個或多個樣品流通通道與反應室相通。這些一個或多個孔可以開放于空氣中，或與一些合適的壓力或抽吸裝置相連，如，用來注入或抽空的裝置，或可以將這些口封起來，比如在擴增反應進行之中。這些孔和通道可制造在底座上，或另外，制造在底座上方的蓋上，或兩者皆有。本裝置還應包括一套對反應室內容物進行熱循環的系統，以使樣品多核苷酸進行擴增。
裝置中至少有一個反應室和一個流通通道，最好是兩者同時，具備中型大小，即至少有一個橫斷面的大小在0.1-1000μm數量級。反應室的優選深度是小于500μm左右，小于300μm更好，最優選則是小于80μm。反應室可以有大一些的長度和寬度，如在1-20μm的量級，優選5-15μm。
淺的反應室有利于對反應室內容物進行熱傳遞，如，從底座附近的熱源，從而在擴增反應中達到有效的熱循環。在一個實施方案中，反應室的內壁表面積和體積比可做成從3mm2/μl到大于10mm2/μl左右。當表面積與體積比增加，熱通過底座的傳導及反應熱循環的有效性都增加。但底座壁表面對擴增反應的潛在抑制效應也可能增加，這一點還取決于底座所采用的原料。因此，針對性地采用一些組合物用以減少反應室內表面如硅表面對反應的阻抑效應，在反應室內在壁表上這種處理是可以保證的。
用來減小反應室表面對擴增反應阻抑效應的組合物可以共價或非共價地粘合到反應室表面上。或者，這些組合物也可以在反應中以溶液加入反應室內。在一個實施方案中，中型流通通道和反應室可以建造在硅底座中。反應室和通道的壁上可涂覆一層上述組合物，用以減少裝置中由硅表面所引起的阻抑效應。例如，裝置的硅表面可以被上一層這里已公開過的在本領域可得到的硅烷化試劑范圍內的任何一種。
在一個實施方案中，本發明的裝置可用來在反應室中進行聚合酶鏈式反應。反應室內要供給PCR所需試劑，包括樣品多核苷酸，聚合酶如Taq聚合酶，三磷酸核苷，可與樣品多核苷酸雜交的第一引物，與一個互補于多核苷酸可雜交的第二引物，這里第一和第二引物是決定多聚化產物多核苷酸的端點。這些試劑可先加入到樣品中，然后從進樣口輸入中型反應室，或者可與樣品分開把各種試劑分別從進樣口加入。
聚合酶鏈式反應可依照本領域已建立的方法進行(Man iatis etal.，Molecular cloningA Laboratory Manual，Cold spring harborLaboratory Press，1989)。本領域中任何耐熱的多核苷酸聚合酶都可以使用。裝置可包括對反應室內容物進行熱循環的方法，這樣在每一次循環，先是控制在使雙鏈多核苷酸變性的溫度，產生單鏈多核苷酸，然后使引物退火，進行多核苷酸多聚化。
盡管這里描述和例舉的是聚合酶鏈式反應進行多核苷酸擴增，但本領域技術人員將會清楚本發明的裝置和可同樣有效地利用以進行其它一系列多核苷酸的擴增反應。這樣的另外的反應，可以是熱依賴的，如聚合酶鏈式反應，或可以在單一溫度下進行(如，以核酸序列為基礎的擴增反應(NASBA))。而且，這些反應可以使用很多種多樣的擴增反應試劑和酶，包括其中的DNA連接酶，T7RNA聚合酶，和/或反轉錄酶。另外，多核苷酸變性能用已知的化學或物理方法完成，可單獨使用或與溫度變化結合使用。可在本發明的裝置中進行的多核苷酸擴增反應包括但不僅限于(1)靶多核苷酸擴增法如自身-持續的列復制(3SR)和鏈替換擴增法(SDA)；(2)基于附在靶多核苷酸上的信號擴增的方法，如“支鏈”DNA擴增(Chiron Corp.Emeryville，CA)；(3)基于DNA探針擴增的方法，如連接酶鏈式反應(LCR)和QB復制酶擴增(QBR)；(4)基于轉錄的方法，如激活轉錄的連接(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)；和(5)各種其它擴增方法，如鏈修復反應(RCR)和探針循環反應(CPR)(這些方法的概述和它們的商業來源。請參見pp.2-7，The Genesis Report，DX，Vol.No.3，No.4，Feb，1994；Genesis Group，Montclair，N.J.)。
本發明的裝置容量小，對很小量液體樣品(如，小于50μl和甚至小于10μl能完成測定。本裝置的中型流通系統可以微制造到微升體積或納升的體積甚至更小，以有利于限制分析用的反應所需的樣品量和/或液體試劑的量。裝置可用來完成各種自動，敏感和快速的多核苷酸分析，包括細胞和溶液中的多核苷酸分析。在測定反應結束后，裝置可被清洗后再用，也可以丟棄。一次性裝置的使用可杜絕污染和減少生物危險事故。樣品和反應混合物不論何時都能保持的是被包埋著的，低容量可簡化廢物處理。B.底座制作包括一個實心底座和置于其上的任選的蓋子分析裝置，能選用廣范圍的原料從設計和制造成有中型流通通道和反應室的裝置。這些裝置可選擇易于滅菌的材料來制作。硅是比較有用的材料，因為它準確而有效的制造技術已比較完善，但其它許多材料也可在本發明范圍之內被應用。其它可以被利用的材料包括，如，砷化鎵，磷化錮、鋁、多聚硅、氮化硅、二氧化硅、聚酰亞胺以及熱電偶材料如鉻/鋁、及石英、玻璃、鉆石、聚合碳酸鹽、聚苯乙烯和其它多聚物如聚四氟乙烯。其它可能的材料包括超合金，鋯錫合金，鈉、金、銀、銅、鎢、鉬、鉭、KOVAR，陶、KEVLAR、KAPTON、MYLAR、黃銅、藍寶石或任何本領域中可得到的塑料和有機聚合原料。
那些口，中型流通系統，包括樣品流通通道和反應室及其它一些功能元件，可以大量地低成本地制造，如通過本領域技術人員已知的任一微機械制造方法加工的硅底座。現有的微型機加工方法包括膜鍍過程，如化學蒸汽沉積，激光加工或照相影印石板術如紫外，X-射線LIGA過程和塑料模子，或蝕刻方法，可以用濕化學過程或等離子體過程。(參見，如，Manz et al.，Trends in Analytical Chemistry，10144-149(1991))。通道，裝置內的小室和多個口的安排要有利于樣品和試劑有序，適時及定量地加入。
在一個實施例中，不同濃度和寬度的流通通道和小室可以造在如硅的底座上，要至少有一個中型大小的。包含有中型通道和反應室的底座可以由玻璃蓋兒蓋上并封上，蓋可以夾在，螺紋連接在或連在底座上。其它清亮或不透亮的原料也可以用作蓋。或者，兩個底座呈三明治式放置，或一個底座被兩個玻璃蓋夾在中間，用透明蓋形成窗口，有利于對流通系統中的內容物進行動態觀察。其它制造方法也可采用。C.鈍化方法在中型擴增反應室或流通通道上可以提供一種組合物，以便它們的內壁表面鈍化，即如壁原料的本質決定使成為必需這種處理以減少壁表面對擴增反應的抑制作用。這種組合物可以共價或非共價地粘附到反應室或通道內表面。例如，可在壁表面涂覆任一種本領域內已知的硅烷化試劑。或者，這組合物可以在反應室中供以溶液，在分析過程中與樣品多核苷酸和擴增試劑一起加入。中型反應室的制造要符合反應室各壁的總表面與反應室體積比在3mm2/μl到大于10mm2/μl范圍內，或者可以選擇大于20mm2/μl。當表面積與體積比增加，熱通過底座傳到反應室的速度加快，依賴熱的擴增反應也將循環得更快。但同時，表面積與體積的增加，表面抑制效應也將增加。同時，對在反應室表面積與體積比較高的情況下，如大于3mm2/μl左右，用來減少反應室壁對擴增反應的阻抑的這些組合物就顯得格外有用了。
本領域那些技術人員將會意識到這里描述的鈍化組分和方法只適用于某些材料，在那里已經觀察到的是用這些材料做的反應室表面經鈍化處理后擴增反應已有所改善。有一些考慮用作本發明裝置的材料，本身就是惰性的，因此這里所描述的鈍化處理對這些材料意義不大。
底座可包含熱導性材料如硅或玻璃。反應室和/或通道內壁可以應用本領域可得到的硅烷化試劑通過涂覆硅烷而被鈍化。有用的硅烷化試劑包括二甲基氯硅烷(DMCS)，二甲基二氯硅烷(DMDCS)六甲基二硅烷(HMDS)和三甲基氯硅烷(TMCS)。如果這些氯硅烷能與含有硅或其他物質的壁表面的羥基共價反應；而硅或其他物質能潛在地干擾這反應，例如由與樣品多核苷酸或擴增試劑結合引起的反應。
另外，反應室和/或通道壁可用硅涂覆，這可應用從市場上能得到的硅化試劑，如AquasilTM或SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(Sigma Chenical Co.，St.Louis，MO)。從商業廠家如Pierce(Rockford，IL)或Sigma Chemical Co.，(St.Louis，MO)處得來的硅化試劑是含有可水解基團的有機硅烷，因而能在溶液中能進行水解，形成硅烷醇，硅烷醇能多聚化并在小室表面上形成一薄膜，并能與小室表面的羥基反應，使得這層膜緊密附著在整個小室表面。
這個涂層還可包括一類大分子，以共價或非共價地與涂層相聯，進一步減少反應室壁對擴增反應的阻抑效應。有用的大分子包括氨基酸聚合物，或一些多聚物如聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸，或聚順丁烯二酰亞胺，或其它諸如順丁烯二酰亞胺等組分。另外一些有用的大分子包括如，聚-L-丙氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚甘氨酸、聚-L-苯丙氨酸、或聚-L-色氨酸。氧化硅薄膜也可以用于反應室和/或通道內壁以減少硅壁表面對擴增反應的阻抑。在氧存在下，加熱底座，這樣一個熱處理可以形成氧化硅薄膜。或者，可以應用等離子體加強氧化作用或化學蒸汽沉積過程。另外，反應室和/或通道壁可以用多聚物，如聚氯乙烯涂覆。例如，聚氯乙烯的氯仿溶液加入中型流通系統，當溶劑揮發后，就形成涂層了。
在另一個實施方案中，反應室中可加入諸如多核苷酸或多肽等封閉劑。例如，基因組DNA或多聚腺苷酸可加入反應室的溶液中，其濃度最好要大于樣品多核苷酸的濃度。這樣，那些潛在的能與樣品的多核苷酸或反應試劑相結合從而降低反應產率的表面任何位點都可被這些多核苷酸所占有。如果把DNA或RNA用做封閉劑的多核苷酸，就應該有效地避免能干擾擴增反應的序列(即，它們基本上只含有與樣品多核苷酸無關的序列)。其它可被用作封閉劑的一些組合物包括牛血清白蛋白，或氨基酸多聚物或一些多聚物如聚乙烯吡咯烷酮，或聚順丁烯二酰亞胺或諸如順丁烯二酰亞胺等組合物。D.熱循環多核苷酸擴增反應，如PCR反應，可以在圖1A和2A所示的裝置10的反應室中進行。在另一個實施方案中的裝置10在圖1B和2B也做了圖示。如圖1A、1B、2A和2B所示，裝置10包括硅底座14，上面微制造有進樣孔16，一個中型流通通道20和反應室22。擴增反應所需的樣品多核苷酸和試劑的加入及產物的取出都是通過流動通道20從反應室22穿過進樣口16，進樣口16被制造在流通通道20的一端。底座14是蓋著的，如用玻璃或塑料蓋12。裝置10也可和附件結合使用，如圖3A簡示的附件50。附件50含有嵌套部分58以支撐裝置10，以指示出口，如裝置10上的出口16，以及附件上一條流通線56。在附件50上的泵52就是用來將樣品和/或試劑從附件上的通道56通過進樣孔16泵入反應室22。
附件50可包括加熱/冷卻元件57以控制PCR擴增反應室內的溫度，如一個電熱元件和/或一個冷卻線圈。電熱元件或者可交替地整合到底座10中，用一個電源接頭與位于反應室22下方的附件50中電接頭相匹配。或者也可以象圖3B所示那樣，附件50可包括一個加熱器53，如激光器，珀爾帖(Peltier)加熱器，或電磁能源，放于裝置10反應室上方或附近。加熱器也可放在反應室下方的附件50中。附件中要有微型計算機可被用于調控加熱元件，為了為擴增室提供，在適于去雜交的溫度，如94℃，和適于退火和聚合的溫度，如40-60℃退火和70-75℃聚合之間的溫度循環。在底座與附件電接觸的部位要安裝有電熱偶，熱敏電阻或電阻溫度計，使微型計算機能檢測并維持反應室中的溫度循環。通過使用單個元件，如電阻溫度計，可以使加熱和測溫有利地結合起來，或者同時或者通過各個步驟將加熱和感知溫度結合起來，從而達到兩個目的。
調節反應室溫度的附件如微型的熱溫差泵(Meterials electronicProduct Corporation，Trenton，New Jersey)，珀爾帖(Peltier)溫差電偶或Joule Thompson冷卻裝置，另一實施方案中，如圖3B所示的附件中，反應室溫度能被定時的脈沖激光調節，激光束穿過玻璃蓋12射向反應室，這就使樣品順序加熱和冷卻到多核苷酸擴增循環所需的溫度。另外，采用Peltier溫差電偶可以將加熱和冷卻兩個功能有利地結合起來。硅的熱性能使它能進行快速的冷卻和加熱的循環。采用表面積與體積比大，如大于3mm2/μl的反應室是有利的因為熱在反應室內容物中進和出的轉移是方便的。有利的熱傳導又增加了反應室內熱循環及擴增反應的效率。
如圖4、5、6A所示意的那樣，中型多核苷酸擴增反應室可以微制造成多個部分，如兩個部分22A和22B，兩者由流通通道20B相連。在這個實施方案中，22A部分是被加熱到或保持在適于變性溫度，22B部分被加熱到或保持在適于退火和聚合的溫度。分析時，裝置10裝入附件50里(圖6A)。附件50設有控制反應室溫度的儀器57。或者，可以用激光對反應室部分加熱。底座可以包括熱電偶或其它溫度傳感裝置來監測反應室各部分的溫度，它的輸出的結果可以用于控制熱的輸入如在微型計算機的幫助下。
在操作中，附件中的泵52用來傳送多核苷酸樣品所需的反應試劑，從通過56通過進樣品16A到反應室22A部分。泵52也可以由附件中的微型計算機控制，然后再被用于階段性地通過通道20B在反應室22A和22A間進行樣品轉移，完成多核苷酸擴增循環的重復，而16B在這里作為出口。當反應結束后，附件50中的泵52又可以將樣品從16B口通過附件中的通道56送到59口處回收產物。當然，也可以有3個或更多的反應室，其中每個部分分別保持在適合特定反應的溫度。
在圖4、5、6B中所示的裝置10，使用熱元件來加熱22A反應室，使溫度適合于雙鏈DNA的變性，如94℃，而22B連接22A和22B的通道20B則位于這個加熱區之外，這樣在熱的樣品從22A向22B運送過程中，散發掉足夠多的熱量，使得樣品在返回22A進行下一輪循環之前，溫度降到退火及聚合所需的溫度。這個很容易達到，因為硅有相對較高的導熱性能，而且液體樣品與底座接觸的界面面積也相當大。在這樣的實施方案中，附件50中的微型計算機用來控制泵52，由它來調節22A和22B間樣品的循環流動。這樣，沿反應室之間的流通路徑，由于熱力學平衡而產生溫度梯度，而且，只用單一熱源就可以得到兩個適宜的溫度。也可以采用其它設計，如，退火和聚合反應可以在一個反應室的不同部分完成，這兩個部分分別設置合適的溫度。E.封閉流體傳送口裝置包括，制造有中型多核苷酸擴增反應室的實心底座。裝置還包括至少一個進樣口及一個連接進樣口和反應室的通道。裝置中一個或多個的口及通道可以做在底座上(圖14)或做在底座上的蓋上(圖1C)。蓋可包括如透明材料象玻璃或本領域現有的一系列塑料原料。
本發明提供了擴增反應中封閉一個或多個口的方式以防止熱循環過程中液體的揮發。在一個實施例中，設有流體運送組件，可以將流體通過口送到反應室或通過口從中取出，這個組件要適合于和口能互相匹配和/或互鎖，這樣當流體送入反應室口就可逆性地被封閉了。可以使用能和底座中流體進/出口相匹配并能將之封閉的注射器或移液器。
如圖19和22所示，在一個實施方案內，蓋12上可做成凹槽87與移液器86匹配并承接86。移液器86可備有移液器頭84，上有孔88，當移液器安裝在凹槽87中時可以將流體從頭84，通過蓋上的通道20A送到底座14上的通道20B和擴增反應室22。頭可以選擇性地從移液器上卸下來以防樣品間的污染。
如圖20所示，孔88可設在頭84頭端的側壁，這樣，如圖22所示當移液器安裝在裝置10的87槽中時，移液器頭可以在兩個位置移動，位置1可以使流體從頭經過孔88送到通道20A和反應室22，位置2使孔88面向槽87的壁，因而就在反應過程中封閉了通道20A和反應室22。另外，如圖21所示，可以從底座上伸出一個可以按壓的元件85，當元件85受到按壓，就可以封閉開口。
上面描述的包含有封閉的流體轉移口的裝置，除了多核苷酸擴增還可用于其它各種目的。例如，這樣的口可以在個別的裝置中采用，用以樣品制備，免疫分析或二者兼有，就象共同享有的共同未決的申請(登記號尚未指定)所描述的那樣它的內容在此引入作為參考。F.擴增的多核苷酸的檢測擴增室內已擴增的多核苷酸可以用本領域內現有的一系列檢測多核苷酸的方法進行檢測，如含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳。在一個實施例內，擴增的多核苷酸產物可以在反應室內就地檢測，采用現有的商業性的專門針對此目的的試劑(如“Taq Man”TM試劑，Perkin ElmerCorporation)。裝置也可以在底座中或在與底座聯合使用的附件中設置多核苷酸檢測儀器。裝置中擴增的多核苷酸產物的存在可以用以下任一種方法但并不限于這些。進行檢測(1)監測中型流通系統中流入和/或流出反應室的液體樣品的壓力或電導率；(2)形成可檢測的復合物，如，多核苷酸產物與標記的探針結合，如標記的寡核苷酸或抗體探針；和(3)在電泳上使多核苷酸產物和反應物及樣品的其它組分分離。
分析裝置也可和用來觀測中型通道內容物的附件結合使用。一個實施例中的附件可以包括觀測裝置中型通道內容物的顯微鏡。在另外的實施例里，附件又可以包含照相機，如圖17和18所示的附件60。附件60設有小屋62，觀測屏64和用以把裝置插入附件的狹縫66。如圖18所示的斷面那樣，附件60也包括有視頻照相機68，光學系統70和傾斜機構72以承接裝置10，可以和調整裝置10的位置和角度。光學系統70可包括透鏡系統用來放大通道內容物，還有光源。視頻照相機68和觀測屏64可以對樣品液體特性的變化，如由于多核苷酸擴增產物存在的誘導流動特征或顏色變化，用附件進行可見監測或選擇性記錄。另外，向反應室添加或從中取出液體樣品也可以用這個附件進行監測，如進行光學監測。
在一個實施例中，擴增的多核苷酸產物可以在檢測室內檢測，檢測室就裝在底座上中型流通系統中，并與反應室相通。檢測室備有復合物形成介質，如結合部分，可結合擴增的多核苷酸產物形成可檢測的復合物，結合部分可包括，如多核苷酸或抗體探針。檢測室的制作可以根據已公開的1992年5月1日提交的美國專利號07/877,702方法相一致，它的公開內容在此引入作為參考。在另一個實施例中，復合物形成介質可以在反應完成之后加入反應室，在那兒形成可檢測的復合物。裝置還可以與檢測器結合使用，如包含有在分析中所得的檢測和記錄數據的微型計算機的附件。
一個實施例中，中型檢測室可以備有惰性物質，如，能與多核苷酸產物結合的珠子或其它顆粒，當存在聚合的多核苷酸時，珠子形成可檢測的凝集。在這樣的顆粒上面附加結合部分，如抗體，能加強這種可誘導的凝集。
能結合多核苷酸產物的抗體或其它結合部分可被引入到檢測室，或通過化學方式或吸附方式包被于檢測區表面上，或者也可以包被于檢測區的惰性顆粒上，以引發結合給出多核苷酸的陽性檢測。化學激活硅表面的技術已比較完善，特別是在層析領域(參見如，Haller inSolidPhase Biochemistry，W.H.Scouten，Ed.，John Wiley，New York，pp535-597 (1983)；and Mandenius et al.，Anal.Biochem.17068-72(1988))。在一個實施方案中，結合部分可含有抗體，本領域內已知的免疫分析技術可以在這樣的檢測區進行。(參見如，Bolton etal.，Handbook of Experimental Immunology，Weir D.M.，Ed.，Blackwell Scientific Publications，oxford，1986，Vol.1，Chapter 26，for a general discussion of immunoassays)。
可檢測的光學標記如熒光分子或熒光珠子可以貼附在結合部分以增強對擴增的多核苷酸產物的檢測。或者第二種標記物，如熒光標記的抗體，可以從流通通道送入檢測區，與已結合的多核苷酸/結合部分的復合物結合，形成一種“夾層結構”包含可以用光學檢測的部分，表明待分析物的存在。在檢測區與結合部分結合的多核苷酸擴增的結合是可被檢測的例如，在光學上，從檢測區上面的一個透明窗口可以見到或通過儀器檢測。在一個實施例中，也可以通過加染料檢測擴增的多核苷酸產物，如溴化乙錠，當它與雙鏈DNA結合后，熒光增強。Higuchi et al.，Biotechnology，10413(1992)。
檢測室也可設有標記的多核苷酸，它可以互補地與擴增的多核苷酸鏈中的一條結合，如，固定化于珠子上的標記多核苷酸通過珠子凝集的方式即可檢測擴增多核苷酸產物。也可以應用本領域內已知的多核苷酸雜交技術。Maninatis et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，1989；Vener et al.，Anal.Chem.198308-311(1991)。多核苷酸探針也可以連到如亞微細粒膠乳上。Wolf et al.，Nucleic Acids Research，152911-2926(1987)。
在另外的實施例中，擴增的多核苷酸產物可以通過適合于本發明中型裝置的電泳方法而與反應物以及原始樣品中的其它組分分開。這樣的技術本領域是有的。如，用SiO2做的微型石板影印設置可以達到電泳分離DNA分子的目的。(Volkmuth & Austin，Nature，358600-602，1992)。或者，玻璃板與各種通道相結合的微制造產品，可以進行毛細管電泳，分離各種生物分子(Harrison et al.，Science，261895-897，l993)。
在這種實施方案中，本發明的裝置可以裝備有檢測區，該裝置包含有微石板影印裝置或一系列通道。提供一個穿越檢測區的合適的電場，就可以在板上進行電泳了(如，在檢測區的兩端分別放置微電極)。檢測區的一端設一個加樣區，用以在電泳前收集反應室內容物。反應混合物中的不同組分就可以通過電泳彼此分離。多核苷酸擴增產物可以通過與已知大小的分子作比較加以鑒別。在一個實施例中，分子大小參照物也引入檢測區(通過進口)，電泳分離后，記錄結果并存貯(如，存在計算機里)。然后把反應室內容物引入檢測區，電泳分離，記錄結果，并與所保存分子大小參照物的電泳結果相比較。靠這種方式鑒別多核苷酸擴增產物并純化以備后用，不需要惰性物質和結合部分來捕獲多核苷酸產物。
反應室內擴增產生的多核苷酸可使流動受到限制，利用對這個限制敏感的檢測區也可以檢測多核苷酸的擴增。這在美國專利申請號08/250,100中已公開，它的公開內容已在此引入作為參考。擴增的多核苷酸的存在也可以通過感知進入或流出流通系統的液體樣品壓力和電導率的變化而檢測出來。電導率是可被測定的，比如，通過底座上延伸出來的電觸頭，還有與裝置結合使用的附件上的電觸頭，二者形成配對。電觸頭可以用已有的技術制作，如各種熱梯度區域熔煉法。(參見Zemel et al.，inFundamentals and Applications of Chemical Sensors，D.Schuetzle and R.Hammerle，Eds.，Acs Symposium Series 309，Washington，DC，1986，p.2.)。
反應室中擴增的多核苷酸可以通過監測液體樣品的壓力而檢測出來。例如，如圖6A所示，裝置10嵌在附件50里，通過口16進入和流出中型流通通道的液體樣品與壓力檢測器54相連，由于聚合產物的存在，產生阻塞或流動限制以至壓力減小，這個壓力變化即可被檢測器檢測。中型壓力傳感器也可直接裝在硅底座上。Angell et al.，SeientificAmerica 24844-55(1983)。
多核苷酸的擴增可以通過采用對流動限制敏感的中型流動系統來檢測，采用“分枝”(“fractal”)模式，即流動通道分支的方式。通道可以造在硅底座上，尺寸逐漸減小，形成漸漸變狹的流動通道。本領域的技術人員應該知道，盡管這里舉的是兩個分支通道的例子，但裝置可以制成數目不等的平行流動通道，或其它斷面積減少的對稱或不對稱方式的流動通道。或者可以采用一個流動通道，包含有一段狹區，就如共同享有的美國專利申請號08/250,100中所述那樣，(在此引入作為參考)。
圖7顯示的是一個底座14平面圖，底座14上裝有通道系統40，通過通道20與口16及包括22A和22B部分的反應反應室相聯接。樣品中擴增的多核苷酸的產物的存在影響流通通道中的流動特征。在這實施例中通道40是對稱設置的，具有模型中部逐漸變狹的直徑。在這樣的通道模式中的流動對因多核苷酸擴增產物的存在而產生的流體粘性變化是很敏感的。另外如圖13所示，可以采用一種更復雜的通道系統。圖13圖解了一對流通通道系統40A和40B，通道系統40A中通道的構造向著模型的中部逐漸變窄，結果使對流動限制的敏感度增加。
流動限制也可以通過檢測區上方的透明蓋進行檢測，如光學檢測。或者，由于流通限制路徑之內或之外多核苷酸擴增的積聚導致流體特征變化，因為這個變化而引起的壓力變化可以用一個或多個壓力傳感器來檢測。多核苷酸的擴增引起的電導變化也可以由與流通區接觸的電導傳感器很容易地測出。例如，限制區40的阻塞，阻斷了進樣口16A到出樣口16B的流通，這可以用常規的電導探測器17檢測出，它的輸出端可以指示流出通路中水狀液體的存在與否。限制流通區也可包括結合部分如標記的抗體或多核苷酸探針，如固定化探針或結合于固相反應物如珠子上，通過結合擴增的多核苷酸誘發限制流通路徑中流動限制的降低。
在一個實施方案內，中型流通系統包括一個裂解樣品中細胞的小室，為下游進行多核苷酸分析作準備。裝置也可包括適于在異質細胞群體中分離特定細胞類型的區域。細胞分離區包括固定化在底座內的結構上的結合部分，通過特征性細胞表面的分子如蛋白而選擇性和可逆性地結合靶細胞。樣品中的另一些細胞則通過下游，并被引導進入一個槽或穿過一個出口。流動可以繼續以清洗細胞，如用緩沖液流。在高流速或壓力下，或改變溶劑組分，被洗脫過的細胞就從它們原先被固定化的結構上釋放出來，之后就從這個細胞分離區向下游的一個細胞裂解裝置移動，使細胞在進行胞內RNA或DNA PCR分析前得以裂解。
細胞裂解裝置典型設置的位置是在流通路徑中細胞分離區(如果有的話)和多核苷酸擴增反應室之間，使得細胞在進行胞內多核苷酸分析前得以裂解。如圖9所示，細胞裂解裝置包括細胞膜穿剌突起90從流通通道20表面延伸。當液流受到推力經過這個穿剌突起90的時候，細胞就破裂了。在另一實施方案中，細胞裂解裝置簡單地包含一個斷面大小受限制的區域，應用足夠的流動壓力完成細胞裂解。細胞裂解裝置還可包括插在中型裂解室內的邊緣鋒利的硅片。附件還包含有某些設置，如泵，推動含有樣品的細胞進入細胞裂解裝置，應用足夠的流動壓力使細胞裂解，然后將樣品通過流動系統送到反應室。在另外的實施方案中，細胞裂解裝置可以包括細胞裂解劑。可以使用本領域現有的細胞裂解劑。
可以從底座上與反應室相的獨立地進樣口向反應室加入試劑。底座上的流通通道內可微制造一個濾器，能夠在進行多核苷酸分析之前濾掉細胞碎片。在一個實施方案中，如圖14、15、16所示，裝置10中的濾器24可以包括一個中型的直徑比通道20小的流通通道。操作時，樣品流從通道20A流過濾器24，樣品過濾液流出濾器24后又流過通道20B。濾器24被微制作成直的或彎的通道，其優選深度和寬度在0.1-50μm數量級，并跨越通道20A和20B，通道20A和20B的最大的深度和寬度約在500μm數量級。如圖8所示，位于PCR分析室上游的通道20的表面也可包含由細胞篩組成的突起可通過大小分離細胞，當細胞樣品流經通道時，典型的要在低壓力情況下，只有足夠小的細胞才可以通過細胞篩80到達下游的功能性單元中。這些細胞接著被送到細胞裂解區，然后再到多核苷酸擴增室進行分析。
另一個實施方案中中型流通通道內可含有順磁性或鐵磁性珠子，它們可以在外界磁場作用下沿通道系統運動，比如在附件磁場作用下。這些珠子可用來在裝置的功能單元間運送試劑，或用來替換樣品，試劑或反應混合物。在一實施方案，多核苷酸探針可以固定化于磁珠上使它們可以結合擴增的多核苷酸。測定結束后，這樣的被有多核苷酸探針的磁珠可以沿流通系統被送到反應室去結合擴增的多核苷酸產物。結合的多核苷酸擴增物可以載在小磁珠上而運到流通系統中檢測或純化室，或到收集口。G.示范裝置如圖10所示的本套發明的一個實施方案，裝置10包括底座14，上面微制造有中型多核苷酸擴增反應室包括22A部分和22B部分，二者靠通道20B相連。裝置10要與附件結合使用，如圖6A所示的附件50，包含有支持裝置的套嵌部位，附件50中設有通路56與裝置10中的口16A、16B、16C、16D相配對。附件中也含有可使口16A、16B、16C、16D機械地開和關的閥門。還包括口16E用來將試劑加到檢測室22C。另一實施方案中，裝置的流通系統可以保持用水力學充滿狀態，附件中或裝置中的閥門可用來引導液流的流向。PCR反應室22A和22B分別加熱到如94℃和40～65℃，提供了PCR和其它溫度依賴性的擴增反應所需的熔解和退火溫度。如前面曾經討論的，反應室可以由整合在反應室下部的底座內的電元件加熱，這個元件要和附件中的電元件配對。或者，可以采用光學的激光束，穿過底座上方的玻璃蓋對反應室加熱。在底座中可以設熱傳感器，它與附件要形成電接觸。附件中微型計算機可用來控制反應室部分溫度和流通系統中液體的流動。
裝置10的流通通道安裝有濾器24A、24B、24C。濾器24A用來防止細胞碎片及其它樣品中不需要的顆粒物質進入反應室。濾器24B和24C用來將復合物形成介質即珠子92限制檢測室22C里。因此濾器24A、24B、24C不必相同。
對于熱依賴的擴增反應如PCR，操作開始，通道和小室中充滿緩沖液，口16A和16C是開的而16B和16C是關的。附件中泵52將樣品液體和/或擴增所需試劑如Taq聚合酶，引物和三磷酸核苷，從口16A通過濾器24A送到反應室22A。然后口16A關閉16B打開，附件中泵52在反應循環中，在反應室22A和22B之間，通過通道20B交互傳送液流，其中22A中進行的是多核苷酸變性，而退火和聚合在22B中進行。口16C常用為這系統的出口或也可選擇性地送Taq聚合酶，三磷酸核苷，引物或其它試劑，當擴增循環結束，如30-35個循環之后，口16C關閉，口16D打開，附件中泵又啟動，將反應產物從反應室22A和22B送到檢測室22C，其中包含有，如固定化于珠子92上與擴增的正義和/或反義鏈互補的多核苷酸。擴增產物觀察到珠子92的凝集得到檢測，如通過檢測區上方的透明蓋就可看見。
圖10B所示的是另一實施方案裝置。這個裝置的功能，結構和操作與圖10A所示的很相似，除了它包含檢測區26，其中制造有用來進行多核苷酸擴增產物電泳分離的管道或其它裝置(圖中沒有顯示)。本裝置包括口16E用來向檢測室添加或取出原料。本裝置和圖16所示的附件50相類似的附件結合使用，它進一步包含有一個穿過檢測區26的電場的應用設置。
圖11所示的是又一個實施方案裝置，本裝置功能，結構和操作與圖10所示的相同，只是它只包括一個單獨的反應室22A。本裝置與附件結合使用，如圖3A所示的附件50。本裝置包括交替加熱和冷卻反應室22A的儀器，以使反應室達到變性和退火，聚合所需的溫度。
操作時，使用附件將含有聚合酶及其它擴增反應如PCR所需試劑的樣本液從進樣孔16A送到反應室22A。然后利用附件中連的閥門把口16A和16D關閉。接著利用附件中的加熱元件對反應室進行熱循環。循環是在適于變性溫度和適于退火及聚合的溫度之間進行。當擴增循環終止后，口16B和16D打開，樣品被送到檢測室22B，里面含有多核苷酸探針，如固定化于珠子92或其它固體物質上。多核苷酸陽性反應可以通過檢測室內固體物質(如珠子)的凝集被顯示出來。在如圖10B所示的實施例中，反應室22A和22B內容物送到檢測區26，在那兒，多核苷酸產物通過電泳進行分離和鑒定。
通過以下不加限定的例子，可以進一步了解本發明。實施例1在圖11所示的裝置中進行聚合酶鏈式反應，設有一個中型反應室22A。為了通過PCR反應來檢測細胞內多核苷酸，將樣品細胞裂解物加到PCR反應緩沖液中，包括Taq聚合酶，三磷酸核苷，多核苷酸引物及其它PCR所需的試劑。細胞樣品裂解液從附件通過進口16A送到反應室22A。口16A和16D借助于附件上包含的閥門進行關閉。附件中的微型計算機和溫控元件用來實現反應室22A中的溫度，在94℃，多核苷酸變性和40-60℃，退火，以及70-75℃引物延伸之間的循環。
當聚合酶鏈式反應結束后，口16B和16D打開，附件中與16B相連的泵將PCR反應室22A中的樣品通過通道20B送到檢測室22B。檢測室22B中含有珠子92，這些珠子包括在表面上固定化的與擴增多核苷酸互補的并能與之結合的多核苷酸。由于擴增多核苷酸和互補多核苷酸的雜交而促使珠子凝集，可以通過檢測室22B上方的窗口觀察到，從而對擴增多核苷酸產物存在進行檢測。實施例2圖12概要描述了裝置10，包括底座14，用以從生物流體樣品中的細胞亞群中分離核酸，然后對某特定的核酸序列進行分析。裝置10上微制造有中型流通路徑20，包括一個細胞分離室22A，一個細胞裂解室22B，濾器區24，PCR反應室包括22C部分和22D部分和限流檢測區40。中型流通系統20也設有流體進/出口16A、16B、16C、16D。裝置與附件如圖6A所示的附件50聯合使用。
起初，附件的閥門使口16C和16D關閉，口16A和16B打開。附件中泵52將含有細胞混合液的樣品送到進樣口16A，并流過中型通道20到達細胞分離室22A。分離室22A包括固定化于室表面的結合部分，能選擇性地結合樣品中期望的細胞類型的表面分子。樣品中殘余的細胞組分從口16B退出底座。當期望的細胞群體已在分離室22A結合后，繼續使流動緩沖液流，用以洗脫和保證這種細胞群體的分離接下來，口16B關閉，口16C打開。然后液流加大足以使固定化的細胞洗脫下來。液流繼續，推動細胞穿過裂解室22B中膜穿刺突起90，裂解細胞，釋放出內容物。
樣品流繼續通過濾器24，濾掉大的細胞膜成分及其它碎片，進到中型PCR反應室22C，22C和22D借通道20B相連。Taq聚合酶，引物及PCR反應所需試劑從附件中與口16B配對的口和通路中加入，通過口16B到反應室22D，在這個過程中，分離后的細胞亞群的胞內可溶組分與PCR試劑得以混合。當口16A關閉，附件中通過口16B與裝置相連的泵用來循環PCR樣品和試劑，循環是在22C和22D之間通過通道20B進行，22C和22D分別設置不同溫度，如94℃和65℃，來完成多核苷酸變性，退火和聚合的多次循環，從而擴增多核苷酸。或者，在反應進行中可以關閉所有的口，象上面所描述的實例1那樣進行熱循環。接下來，用附件中的閥門把口16D打開。附件中與口16B相連的泵將從細胞群體中分離擴增過的多核苷酸送到，包括雙分支系列的流通路徑40的檢測區。檢測區40中的液流限制可以作為擴增的多核苷酸產物存在的陽性指標，通過檢測區上方的玻璃蓋進行光學上的檢測。實施例3樣品多核苷酸(噬菌體λDNA)的擴增作用是在一個具有深80μm、寬8mm、長14mm的制造在硅底座上并用不同鈍化方法鈍化處理過的中型反應室中進行檢測的。
要進行反應，PCR試劑(如，核苷酸，AmpiTaq DNA聚合酶，引物和噬菌體λDNA樣品)先在管(tube)中混合，然后轉移到硅底座的中型反應室中。反應物的終濃度為核苷酸，各200mM，Taq聚合酶，0.25U/10ml；引物，各1.00mm；DNA模板，每10ml0.1ng。用計算機控制下的帕爾帖(Peltier)加熱-冷卻器進行自動熱循環(一般35次)。
裝配在硅底座中的中型反應室壁經不同鈍化方法處理后，PCR反應結果如圖23所示。圖23是反應產物在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上的電泳圖。膠的泳道對應如下(1和7)分子量標準參照物(1000，750，500，300，150和50bp)；(2)在Perkin-Elmer 9600型熱循環儀中進行擴增反應的產物，作對照；(3)未經處理的反應室中的擴增產物；(4)反應室表面有一層熱處理后的硅氧化膜，在其中進行擴增反應的產物；(5)用硅氧烷和氨的混合物，通過等離子體增強的化學蒸汽沉積(PECVD)過程，在反應室表面被一層氮化硅，在這樣的反應室中進行擴增反應的產物；(6)在被有通過PECVD過程形成的氧化硅薄膜的反應室中進行擴增反應的產物。硅的熱氧化方法有過描述，如在Runyan and Bean，“Semiconductor Integrated Circuit ProcessingTechnology”，Addison-Wesley Publishing Co.，1990，Chapter 3，和等離子體協助參與化學蒸汽沉積過程在表面鍍膜的方法有過描述，如，在Sze，“Technology”，McGraw-Hill Book Co.，1983，Chapter3中。
如圖23所示，在被有熱氧化膜(4泳道)和PECVD氧化膜(6泳道)的硅反應室中進行PCR反應，與未經處理的硅反應室相比(泳道3)，反應產物基本上增加了，相反，氮化硅膜(4泳道)對擴增反應沒有任何正的鈍化效應。實施例4制造在硅底座上中型多核苷酸擴增反應室涂覆有使反應室壁表面鈍化的涂層。
硅底座上設有流體進口和出口，中型流通系統包括流通通道，它和口是相通的，可進行流體交換，還包括多核苷酸擴增反應室，中型擴增反應室深80μm，寬8mm，長14mm，用硅化試劑以及，選擇性，用某種大分子一起形成鈍化硅表面的涂層。擴增室中注滿硅化試劑，如AquasilTM或SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(SigmaChenical Co.，St.Louis，MO)。注入時可采用100μl的移液器，并在底座片的出口處采用負壓。硅化試劑在底座中于室溫下保持至少30分鐘。在出口處采取恒定負壓以移去硅化試劑，至少要經4個小時。將100μl蒸餾水或0.1M TE緩沖液通過流通系統，從進樣口送到擴增室，也是用100μl的移液器，并在出口外施加負壓。這樣的沖洗約重復6次。最后一次沖洗后，出口處的負壓要維持10-15分鐘以吸干通道。
或者，擴增室表面用硅烷化試劑如二甲基二氯硅烷(DMDCS)或二甲基氯硅烷(DMCS)。用硅化或硅烷化試劑進行表面處理的方法也有描述，如，在Pierce，“InstructionsSiliconizing Agents，”Rockford，I，1993，它的公開內容在此引入作為參考。
擴增反應室也可選擇性地充滿封閉劑，包括大分子(約0.1M Tris緩沖液中，pH 8.6，大分子濃度為10mg/mL)，如氨基酸聚合物(參見表2)，注入時也是用100μl的移液器從入口處注入，并在出口處施加負壓。大分子溶液在反應室中于4℃至少保持1個小時。然后在裝置的退出口施加10-15分鐘負壓。這樣，提供了非共價地與硅處理過表面相結合的大分子涂層。實施例5對不同的涂層在降低硅對多核苷酸擴增反應的阻抑效應作了測試。
硅粉樣品上涂覆一層SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)或SigmacoleTM(Sigma Chenical Co.，St.Louis，MO)。并使之干燥，然后再在上面涂覆表2所列的一系列不同的大分子(來自Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)，如實施例4所述那樣。然后把每個大約4mg的涂覆過的硅制品放入分開的含有45μl PCR反應混合液反應管內(參見實施例3)，并在Perkin Elmer 9600型熱循環儀上運行。
或者，在深80μm，寬8mm，長14mm的中型反應室內表面涂覆一層硅烷化試劑，或參照例4所描述的程序用與不同大分子(表2)相聯的硅烷化試劑。PCR反應就在有這樣涂層的反應室中進行，利用實施例3所描述的試劑。使用不同涂層后所得的結果列于表2，采用0-4的比例范圍，其中陽性對照(在Gene Amp 9600型中進行的反應)的比例是3。如表2所示，最有效的涂層是如SurfasilTM(Pierce，Rockford，IL)與聚乙烯吡咯烷酮或多聚腺苷酸結合使用。
表2編號 硅劑/大分子 對硅粉的 對PCR的效率比效率比1SigmacoteTM/聚-L-丙氨酸2-2SigmacoteTM/聚-L-天冬氨酸 0-3SigmacoteTM/聚甘氨酸 3＞14SigmacoteTM/聚-L-亮氨酸2-5SigmacoteTM/聚-L-苯丙氨酸 2-6SigmacoteTM/聚-L-色氨酸2-7SigmacoteTM/聚-L-賴氨酸0-8SigmacoteTM/聚乙烯吡咯烷酮 ＞1 -9SigmacoteTM/聚腺苷酸 4010 SigmacoteTM/聚順丁烯二酰亞胺 0-11 SigmacoteTM/順丁烯二酰亞胺 1-12 SurfasilTM/聚-a-丙氨酸 3213 SurfasilTM/聚-L-天冬氨酸 0-14 SurfasilTM/聚甘氨酸1-15 SurfasilTM/聚-L-亮氨酸 2-16 SurfasilTM/聚-L-苯丙氨酸 2-17 SurfasilTM/聚-L-色氨酸 1-18 SurfasilTM/聚-L-賴氨酸 0-19 SurfasilTM/聚乙烯吡咯烷酮 42-320 SurfasilTM/聚腺苷酸43-421 SurfasilTM/聚順丁烯二酰亞胺0-22 SurfasilTM/順丁烯二酰亞胺 1-23 不含涂層的硅00-224 SurfasilTM30-125 SigmacoteTM2-26 DMDCS -027 DMDCSC/聚腺苷酸 -128 AquasilTMin H2O 199-權利要求
1.一種通過進行多核苷酸擴增反應來擴增樣品中多核苷酸的裝置，該裝置包括制造有至少包括一個多核苷酸擴增反應室的實心底座，所說的室至少有一個中型斷面，大小要在約0.1-1000μm，所說的反應室至少含有一種對所說的多核苷酸進行體外擴增的試劑；以及至少一個可以與該反應室以流體相通，用以將所說的樣品引入反應室的口。
2.權利要求1的裝置，其中還包括將所說口與反應室相連的流通通道。
3.權利要求1的裝置，其中所說的實心底座，包括的材料選自玻璃、硅、硅石、多聚硅、氮化硅、二氧化硅、塑料或有機聚合材料。
4.權利要求1的裝置，其中所說的反應室深度小于500μm左右。
5.權利要求1的裝置，其中所說的反應室深度小于300μm左右。
6.權利要求1的裝置，其中所說的反應室深度小于80μm左右。
7.權利要求1的裝置，其中所說的反應室表面積與體積比大于3mm2/μl左右。
8.權利要求7的裝置，其中所說的比例大于5mm2/μl左右。
9.權利要求7的裝置，其中所說的比例大于10mm2/μl左右。
10.權利要求1的裝置，其中所說的反應室至少包含一面壁與一種組合物相結合，這組合物可以減少由所說反應室的所說的壁對多核苷酸擴增反應的抑制。
11.權利要求10的裝置，其中所說的組合物是被粘附在所說的壁表面。
12.權利要求11的裝置，其中所說的組合物是共價地貼附到壁表面。
13.權利要求11的裝置，其中所說的組合物包括一種聚合物。
14.權利要求13的裝置，其中所說的聚合物包括聚氯乙烯。
15.權利要求10的裝置，其中所說的組合物包括一種，配置在該反應室的溶液里的封閉劑。
16.權利要求15的裝置，其中所說的封閉劑選自多核苷酸和多肽。
17.權利要求16的裝置，其中所說的封閉劑是一種選自DNA，RNA，多聚鳥苷酸和多聚腺苷酸的封閉多核苷酸。
18.權利要求17的裝置，其中包含有所說的封閉多核苷酸的溶液還包含在所說反應室中待擴增的樣品多核苷酸。
19.權利要求10的裝置，其中所說的底座包括硅。
20.權利要求19的裝置，其中所說的組合物包含涂覆于所說的壁表面的硅烷涂層。
21.權利要求20的裝置，其中所說的涂層是通過所說的壁表面與硅烷之間的反應形成的，該硅烷選自二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷，六甲基二硅氮烷和三甲基氯硅烷。
22.權利要求19的裝置，其中所說的組合物包括涂覆于所說壁表面的硅氧烷。
23.權利要求22的裝置，其中所說的涂層是通過壁表面與硅烷化試劑相互作用形成的。
24.權利要求22的裝置，進一步包括與所說的硅氧烷涂層相連結的大分子。
25.權利要求24的裝置，其中所說的大分子是一種氨基酸聚合物。26.權利要求24的裝置，其中所說的大分子選自聚乙烯吡咯烷酮、多聚腺苷酸和聚順丁烯二酰亞胺。
27.權利要求19的裝置，其中所說的組合物包括涂覆于壁表面的氧化硅涂層。
28.權利要求1的裝置，其中還包括調節反應室內的溫度的熱調節器。
29.權利要求1的裝置，其中進一步包括用以檢測多核苷酸擴增反應產物的檢測系統。
30.權利要求29的裝置，其中所說的檢測系統包括一種復合物形成介質，當它與所說多核苷酸擴增產物接觸時，與所說產物形成一種可檢測的復合物；一個小室，多核苷酸擴增反應產物與復合物形成介質在其中接觸，從而形成可檢測的復合物；以及一種用以確定在所說小室中可檢測復合物的存在或數量的檢測器。
31.權利要求30的裝置，其中所說的可在其中形成可檢測復合物的小室，就是多核苷酸擴增反應室。
32.權利要求30的裝置，其中所說的可在其中形成可檢測的復合物的小室是檢測室，它與多核苷酸擴增反應室以流體相通。
33.權利要求1的裝置，其中所說的反應室至少要有一部分被底座上面的蓋子所覆蓋。
34.權利要求2的裝置，其中的口和流通通道都制造在底座上。
35.權利要求2的裝置，還包括置于所說底座上的蓋子，其中所說的口和流通通道都制造在所說的蓋上。
36.權利要求33的裝置，其中所說的蓋子包括一種選自玻璃和有機聚合物的材料。
37.權利要求34的裝置，還包括從所說底座上延伸出來的一個元件，當對著所說口按壓該元件時能將口封閉。
38.一種進行多核苷酸擴增反應的裝置，該裝置包括一種用以將樣品引入到所說裝置的進樣系統，其中包括一個進樣品和一個出樣口；至少一個從所說的進樣口延展出去的樣品流通通道；一個制造的包括至少一個多核苷酸擴增反應室與流通通道和出樣口以流體相通的實心底座，所說的反應室至少有一個中型斷面，大小在0.1-1000μm，以及一種用以將液體送至進樣口以及從該口接受液體的運送組件，其中所說的液體運送組件與進樣口互相匹配并可逆地封閉進樣口。
39.權利要求38的裝置，其中所說的運送組件包括注射器。
40.權利要求38的裝置，其中所說的運送組件包括一個移液器，所說的移液器包括一個移液器頭，頭上設有一個孔用以在移液器頭和進樣孔間轉移液體。
41.一種進行多核苷酸擴增反應室，至少制造在底座或蓋其中之一上，所說反應室至少有一個中型斷面，大小在0.1-1000μm；其中所說的蓋包括一個用來承接和匹配移液器的凹槽，移液器包括上面有孔的移液器頭；和一個當移液器嵌入槽內時溝通所說移液器頭上的孔和所說反應室的流通通道。
42.權利要求41的裝置，其中所說的蓋包括一種透明材料。
43.權利要求42的裝置，其中所說有透明材料包括選自玻璃和有機聚合物的一種材料。
44.權利要求41的裝置，其中所說的孔位于移液器頭的側壁，當移液器嵌凹槽中時，移液器頭可以在下列兩個位置間移動一個使流體從移液器頭經其上的孔及通道送到反應室的位置1；以及一個使孔對著槽的壁因而封閉了通道和反應室的位置2。
全文摘要
這里公開的是通過多核苷酸擴增反應對樣品中預先選定的多核苷酸進行擴增的裝置。裝置設有一個底座，其中微制造有多核苷酸擴增反應室，它至少有一個斷面大小約為0.1-1000μm。裝置還包括至少一個口與反應室相通，可進行液體交換，用以將樣品引入反應室和必要時從此取出，而且可以選擇性地用來從裝置中移出產物或廢物。反應室可備有對既定多核苷酸進行擴增所需的試劑。裝置也可包括對反應室內容物進行熱調節的方式，以擴增既定的多核苷酸。最好的是，把反應室制作成有高的表面積與體積比以有利于熱調節。必要時可以用某種組合物處理擴增反應室，以減少包括反應室壁在內的物質對擴增反應的抑制效應。
文檔編號G01N1/28GK1157639SQ95192076
公開日1997年8月20日 申請日期1995年11月13日 優先權日1994年11月14日
發明者P·韋爾丁, L·J·克里卡 申請人:賓夕法尼亞州大學信托人