專利名稱：短鏈化多核苷酸及其制備方法
技術領域：
本發明涉及作為醫藥品特別有效的短鏈化多核苷酸及其制備方法。具體來講，本發明是以合成的短鏈化多核苷酸或其鹽中的2’-5’磷酸二酯鍵占全部磷酸二酯鍵的3％以下，即，對應于所有磷酸二酯鍵的磷酸基團，從3’位轉移到2’位的磷酸基團的比例(磷酸位移率)在3％以下為特征的短鏈化多核苷酸或其鹽，以及它們的制備方法。
背景技術：
聚肌苷酸·聚胞苷酸，即，以聚[I]·聚[C]為代表的多核苷酸是本領域技術人員公知的化合物，由于其具備干擾素誘導作用和免疫活性作用等，所以，對其作為肝炎治療劑和癌治療劑使用的可能性進行了研究。
多核苷酸的藥理作用與其鏈長有關，鏈越長，其干擾素誘導作用等越強。但是，反過來考慮，鏈越長顯現出的毒性也越強。
最近，嘗試對多核苷酸進行水解，將獲得的合成的短鏈化多核苷酸封入象陽離子脂質體那樣的可將藥物移入細胞內的有效載體中的方法，這樣不僅能夠維持多核苷酸的有效藥理作用，還可減弱毒性(例如，PCT WO 99/20283號、PCTWO 99/48531號)。
但是眾所周知，如果象以上所述那樣通過水解而使多核苷酸短鏈化，則在短鏈化的同時因為偽旋轉機理而使部分磷酸基團從3’位轉移2’位發生分子內位移(參考《蛋白質、核酸、酶》Vol.40，No.10，pp1323-1332(1995))。其結果是，短鏈化多核苷酸分子內的部分3’-5’磷酸二酯鍵被2’-5’磷酸二酯鍵置換。這種磷酸基團的位移現象是否會影響到藥理作用等目前還不清楚。
發明的揭示本發明的目的是提供作為醫藥品有效且安全的短鏈化多核苷酸及其鹽，以及其短鏈化雙鏈多核苷酸及其鹽。
本發明者們經過認真研究后發現了在短鏈化反應時生成的2’-5’磷酸二酯鍵僅在一定比例以下的短鏈化多核苷酸及其鹽中，解決了上述問題，從而完成了本發明。
本發明之一是短鏈化多核苷酸或鹽，其特征是，2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下，更好是2％以下。
此外，本發明還涉及上述2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下，更好是2％以下的短鏈化多核苷酸或其鹽中，由可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸或其鹽構成的雙鏈短鏈化多核苷酸或其鹽。本發明進一步涉及包含以可將藥物移入細胞內的有效載體和上述2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下的短鏈化多核苷酸或其鹽，或和可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸或其鹽形成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸或鹽為必須構成組分的復合體的組合物。
本發明的多核苷酸是各種核苷酸通過磷酸二酯鍵發生直鏈聚合反應形成的化合物，核苷酸數大約在20個以上，可以是天然的也可以是合成的。具體例子包括聚肌苷酸(即，聚(I))或其類似物、聚胞苷酸(即，聚(C))或其類似物、聚腺苷酸(即，聚(A))或其類似物、或聚尿苷酸(即，聚(U))或其類似物。
聚肌苷酸類似物是全部或部分肌苷酸經過化學修飾而獲得的均聚物，或肌苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(7-脫氮肌苷酸)、聚(2’-疊氮肌苷酸)。聚胞苷酸類似物是全部或部分胞苷酸經過化學修飾而獲得的均聚物，或胞苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(5-溴胞苷酸)、聚(2-硫代胞苷酸)、聚(胞苷酸-5’-硫代磷酸)、聚(胞苷酸、尿苷酸)、聚(胞苷酸、4-硫代尿苷酸)、聚(1-乙烯基胞苷酸)。聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸類似物也是如此。其中，適合于本發明的是聚肌苷酸和聚胞苷酸。
本發明的短鏈化多核苷酸的平均鏈長一般為0.1k bases～1kbases(base堿基的個數，1k bases表示1000個堿基，以下將“base(s)”簡稱為“b”)，較好是200b～800b，更好為300b～600b。該平均鏈長如下面的試驗例5所述，可以通過凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography，以下稱為“GPC法”)容易地確定。
本發明的短鏈化多核苷酸的磷酸位移率一般在3％以下，較好在2％以下或0.1％～2％，更好是在1％以下或0.1％～1％。
多核苷酸的磷酸基團從3’位向2’位轉移可通過下面的試驗例6所述的方法容易地確認。即，用核酸酶P1選擇性地對3’-5’磷酸二酯鍵進行水解，使多核苷酸分解為核苷、核苷酸及寡核苷酸后，再用堿性磷酸酶選擇性地對末端的磷酸基團進行水解，使全部核苷酸轉變為核苷。另一方面，具有未被核酸酶P1分解的2’-5’磷酸二酯鍵的寡核苷酸即使用堿性磷酸酶處理，其分子內的2’-5’磷酸二酯鍵也不會被水解，所以不能夠分解為核苷。用液相色譜法對核苷和寡核苷酸(大部分為二聚體)進行定量，求得磷酸的位移率。
本發明的可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸包括聚肌苷酸和聚胞苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸、聚肌苷酸類似物和聚胞苷酸、聚肌苷酸和聚胞苷酸類似物、聚肌苷酸類似物和聚胞苷酸類似物、聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸類似物、聚腺苷酸類似物和聚尿苷酸類似物。因此，由可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸形成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸包括聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸類似物、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸類似物。其中，聚肌苷酸·聚胞苷酸是適合于本發明的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸。
上述具有雙鏈的短鏈化多核苷酸的平均鏈長可以認為是全部短鏈化多核苷酸的平均鏈長。該平均鏈長作為具有雙鏈的短鏈化多核苷酸的外觀平均鏈長可用堿基對的個數表示。因此，上述具有雙鏈的短鏈化多核苷酸的平均鏈長一般為0.1k bp～1k bp(bp堿基對的個數，1k bp為1000個堿基對)，較好為200bp～800bp，更好為300bp～600bp。
本發明的短鏈化多核苷酸鹽及具有雙鏈的短鏈化多核苷酸鹽只要是醫藥上允許的鹽，對其無特別限定。例如，鈉鹽和鉀鹽。
可將藥物移入細胞內的有效載體可采用帶有正電荷的載體，其具體例子包括聚-L-賴氨酸等陽離子性聚合物和Lipofectin、Lipofectamine、Lipofectace、DMRIE-C等陽離子脂質體，還包括PCT WO 94/19314號公報揭示的被認為是同一類的載體。例如，以具有以下結構式[I]的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油 和磷脂(例如，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、它們的氫化磷脂)為必須構成組分的藥物載體。
上述陽離子脂質體帶有正電荷，與帶有負電荷的多核苷酸或寡核苷酸形成靜電復合體，該復合體和細胞膜融合的同時，多核苷酸或寡核苷酸被移入細胞內。這種復合體被稱為“lipoplex”。
以下對本發明的短鏈化多核苷酸的制備方法進行詳細說明。例如，在適當的pH范圍內和適當的溫度范圍內使作為起始原料的多核苷酸溶液加熱水解就可制得。此時，水溶液的pH以在7以上的堿性為宜，更好是pH7～10。此外，如果考慮到短鏈化反應的速度和堿基部分的穩定性，pH更好為8～9。另一方面，從堿基的穩定性考慮，反應溫度應在20～110℃的范圍內，更好是在40～100℃。但是，考慮到足夠的水解速度和堿基部分的穩定性，反應溫度最好在50～90℃的范圍內。
更具體來講，例如，將多核苷酸攪拌溶解于水，如注射用水、注射用蒸餾水或生理鹽水中，用緩沖液或pH調節劑將pH值調整為8～9。然后，在50～90℃的反應溫度范圍內，一邊監控平均鏈長和磷酸的位移率，一邊進行0.5～60小時的加熱水解，就能夠制得磷酸位移率較低、且具有0.1kb～1kb的平均鏈長的短鏈化多核苷酸。
pH的調整可采用醫藥上允許的添加劑，例如，緩沖液或pH調節劑。具體例子包括氨基乙酸(別名甘氨酸)、三羥基甲基氨基甲烷(別名Tris)、碳酸鈉、碳酸氫鈉(別名重堿)、氫氧化鈉、二乙醇胺、三乙醇胺等緩沖液和pH調節劑。對它們的種類、組合和濃度等無任何限定。
如果對反應液進行透析處理或活性炭處理等，能夠將單體和不需要的鹽、雜質、短鏈化生成的反應副產品排出到反應系統外。
此外，在適當的pH范圍內和適當的溫度范圍內，以多核苷酸溶液為起始原料，用磷酸二酯酶也可制得本發明的短鏈化多核苷酸。此時反應液的pH一般在4～9的范圍內，更好是5～8的范圍內。此外，考慮到反應時的磷酸位移，pH值最好在6～7的范圍內。另一方面，考慮到酶的性質，反應溫度一般在20～60℃的范圍內，更好是在25～50℃的范圍內。但是，要獲得足夠的水解速度，避免酶反應以外的熱對水解的影響，且不引發磷酸基團的位移，反應溫度最好在30～40℃的范圍內。
更具體來講，在多核苷酸中加水(注射用水、注射用蒸餾水和生理鹽水等)攪拌并溶解。如有需要，添加緩沖液和pH調節劑來調整pH值。然后，加入核酸酶P1等磷酸二酯酶，在30～40℃的反應溫度范圍內，一邊監控平均鏈長和磷酸位移率，一邊進行短鏈化反應，制得磷酸位移較少、且具有0.1kb～1kb的平均鏈長的短鏈化多核苷酸。對酶的濃度和反應條件等無任何限定。
如果對反應液進行乙醇沉淀、透析處理和活性炭處理等，能夠將單體、不需要的鹽、雜質、短鏈化反應生成的副產品等排除到反應系統外。
通過適當的膜分離能夠對短鏈化多核苷酸進行精制。例如，以分離出本發明的平均鏈長為0.1kb～1kb的短鏈化多核苷酸為目的，可采用超濾膜等。對該濾膜的材質或孔徑等無任何限定。
作為起始原料的多核苷酸可以是天然的也可以是合成的，對鹽的種類和鏈長也無特別限定。天然的多核苷酸包括tRNA和聚腺苷酸。合成的聚核苷酸能夠由以聚核苷酸磷酸化酶為代表的RNA合成酶和其固定化酶制得。此外，作為干擾素誘導劑的市售的聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽等也可作為起始原料使用。
在適當的溶液(例如，含有0.15M NaCl的10mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7))中，混入以上獲得的磷酸位移率較低的短鏈化多核苷酸中可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸，能夠獲得本發明的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸，此外，利用常規方法進行退火也能夠獲得。退火的方法包括將含有可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸的溶液升溫至70～80℃，再慢慢冷卻的方法。
此外，可以對以上獲得的磷酸位移率較低的短鏈化多核苷酸或具有雙鏈的短鏈化多核苷酸進行冷凍干燥處理，這樣就能夠制得可長期保存的冷凍干燥品。冷凍干燥處理可采用常規方法進行。例如，對在上述條件下獲得的短鏈化多核苷酸溶液進行過濾滅菌處理后，將濾液注入經過熱空氣滅菌處理的金屬容器中，在-40℃～-20℃的棚溫下進行1～4小時的預冷，一次干燥后，在15～30℃的棚溫下減壓進行二次干燥(時間為10～50小時左右)，就能夠獲得冷凍干燥品。一般，在上述冷凍干燥品中添加適當的溶液(注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水、麥芽糖溶液和葡萄糖溶液等)使其溶解就可使用。
本發明的組合物，即，包含以可將藥物移入細胞內的有效載體和2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下的短鏈化多核苷酸、可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸或由可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸形成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸為必須構成組分的復合體(以下稱為“本復合體”)的組合物能夠通過和脂質體的常規制備方法同樣的方法制得。具體來講，在可將藥物移入細胞內的有效載體，例如陽離子脂質體或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油等甘油衍生物及磷脂)中加入水(注射用水、注射用蒸餾水和生理鹽水等)，攪拌混合后，用適當的分散機，例如，均質混合機、均化機、超聲波分散機、超聲波均化機、高壓乳化分散機、Microfluidizer(商品名)、Nanomizer(商品名)、De Bee 2000(商品名)、Ultimizer(商品名)、Manton-Gaulin型高壓均化機進行分散處理。然后，在該脂質分散液中加入本發明的短鏈化多核苷酸或具有雙鏈的短鏈化多核苷酸，再次用適當的分散機進行分散處理，獲得本復合體之后，進行過濾滅菌等滅菌處理，就能夠制得作為注射劑的本發明組合物。在制備時的適當步驟中還可添加其他任意的添加劑，對其無特別限定。此外，預先混合可將藥物移入細胞內的有效載體，例如，陽離子脂質體或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油等甘油衍生物及磷脂)和本發明的短鏈化多核苷酸或具有雙鏈的短鏈化多核苷酸，然后在該混合物中加入水，同時進行分散處理。此外，上述各種制備方法中，還可包括適當的粗分散步驟。
此外，可以對以上獲得的本發明的組合物進行冷凍干燥處理，這樣就能夠制得可長期保存的本發明組合物的冷凍干燥制劑。冷凍干燥處理可采用常規方法進行。例如，在上述分散處理后進行過濾滅菌處理，然后將所得本發明組合物定量地分別注入小瓶中。在-40℃～-20℃的條件下進行約2～3小時的預冷，然后在約0～10℃的減壓條件下進行一次干燥，再在約15～25℃的減壓條件下進行二次干燥，進行冷凍干燥。接著，一般用氮氣等惰性氣體置換掉小瓶內部的空氣，加蓋后就可獲得本發明組合物的冷凍干燥制劑。
一般，用任何適當的溶液對本發明組合物的冷凍干燥制劑進行再溶解就可使用。進行再溶解時，可采用注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水、麥芽糖溶液、葡萄糖溶液和其他普通的輸液等。
本發明組合物及其冷凍干燥制劑可作為藥物制劑使用。作為藥物制劑的本發明組合物及其冷凍干燥制劑能夠發揮出多核苷酸所具有的藥理作用。因此，該藥物制劑的具體例子包括干擾素誘導劑、免疫活化劑、細胞內核酸酶活化劑、癌治療劑或預防劑、肝炎治療劑或預防劑。
實施發明的最佳方式例舉實施例和試驗例對本發明進行更為詳細的說明，但本發明并不僅限于這些實施例和試驗例中。
參考例1在8g肌苷-5’-二磷酸三鈉鹽及1g氯化鎂中加入500mL 0.1M的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，攪拌溶解。然后，添加6N的氫氧化鈉將pH值調整到9.3，于38℃靜置1小時。再添加1mL多核苷酸磷酸化酶溶液，于38℃反應18小時。接著，在上述反應液中加入25mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反應停止，再加入10mL飽和食鹽水和500mL無水乙醇，使聚肌苷酸(1973 b)沉淀。
參考例2在10g胞苷-5’-二磷酸三鈉鹽及3g氯化錳中加入約1L 0.2M的碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液，攪拌溶解。然后，添加6N的氫氧化鈉將pH值調整到9.8，于36℃靜置1小時。接著，添加2mL精制的多核苷酸磷酸化酶溶液，于36℃反應24小時。再添加50mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反應停止，最后在反應液中加入20mL飽和食鹽水和1L無水乙醇，使聚胞苷酸(3300 b)沉淀。
實施例1對參考例1獲得的聚肌苷酸進行離心分離，在沉淀物中加入500mL注射用水進行再溶解，然后進行透析處理。用活性炭對透析內液進行處理后，通過過濾除去活性炭，再在濾液中加入6N的氫氧化鈉，將pH值調整為8.5。接著，于70℃進行8小時的加熱水解使該聚肌苷酸短鏈化，再用活性炭對上述短鏈化多核苷酸進行處理，過濾除去活性炭后，進行透析處理。對透析內液過濾滅菌后，用常規方法對濾液進行冷凍干燥處理，獲得1.9g磷酸位移率較低的本發明的短鏈化多核苷酸(聚肌苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為0.2％，平均鏈長為360 b)。
實施例2對參考例2獲得的聚胞苷酸進行離心分離，在沉淀物中加入500mL注射用水進行再溶解，然后進行透析處理。用活性炭對透析內液進行處理后，通過過濾除去活性炭，再在濾液中加入6N的氫氧化鈉，將pH值調整為9.0。接著，于80℃進行4小時的加熱水解使該聚胞苷酸短鏈化，再用活性炭對上述短鏈化多核苷酸進行處理，過濾除去活性炭后，進行透析處理。對透析內液過濾滅菌后，用常規方法對濾液進行冷凍干燥處理，獲得2.7g磷酸位移率較低的本發明的短鏈化多核苷酸(聚胞苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為0.1％，平均鏈長為318 b)。
實施例3在1g聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)7.2，生化學工業株式會社制)中加入200mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，攪拌溶解后，一邊用試驗例5記載的方法監控平均鏈長，一邊于60℃進行48小時的加熱水解使該聚腺苷酸短鏈化，再用活性炭對上述短鏈化多核苷酸進行處理，通過常規方法對透析內液進行冷凍干燥處理，獲得0.3g磷酸位移率較低的本發明的短鏈化多核苷酸(聚腺苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為1.9％，平均鏈長為154 b)。
實施例4在1g聚尿苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)6.5，生化學工業株式會社制)中加入200mL 0.2M的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)，攪拌溶解后，一邊用試驗例5記載的方法監控平均鏈長，一邊于60℃進行25小時的加熱水解使該聚尿苷酸短鏈化。對上述短鏈化多核苷酸進行透析處理后，通過常規方法對透析內液進行冷凍干燥處理，獲得0.2g磷酸位移率較低的本發明的短鏈化多核苷酸(聚尿苷酸鈉鹽)的冷凍干燥制品(磷酸位移率為1.2％，平均鏈長為108 b)。
實施例5在250mg聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.8，Yamasa醬油株式會社制)中加入50mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)，攪拌溶解后，在50～120℃的適當的短鏈化溫度下對上述溶液進行加熱，然后一邊用試驗例5記載的方法監控平均鏈長，一邊對任意鏈長的聚肌苷酸進行取樣，其結果如表1所示。分別對所得試樣溶液進行透析后，通過常規方法進行冷凍干燥處理，獲得各種冷凍干燥制品。
表1

實施例6在250mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.6，Yamasa醬油株式會社制)中加入50mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)，攪拌溶解后，在55～120℃的適當的短鏈化溫度下對上述溶液進行加熱，然后一邊用試驗例5記載的方法監控平均鏈長，一邊對任意鏈長的聚胞苷酸進行取樣，其結果如表2所示。分別對所得試樣溶液進行透析后，通過常規方法進行冷凍干燥處理，獲得各種冷凍干燥制品。
表2

從上述實施例5和實施例6可明顯看出，使市售的聚肌苷酸鈉鹽及聚胞苷酸鈉鹽短鏈化時，在55℃以下的短鏈化溫度下，不能夠進行充分的水解。因此，即使短鏈化時間超過約50小時，平均鏈長還是超過1kb。另一方面，由于將短鏈化溫度設定在120℃的試樣及將短鏈化溫度設定在90℃的試樣的水解反應速度過快，所以很難對短鏈化進行控制。特別是短鏈化溫度為120℃時，在1～1.5小時的短鏈化時間內可將多核苷酸分解至接近寡核苷酸的程度。此外，還可確認該試樣的磷酸位移率較高，堿基部分也出現了分解。
實施例7在100mg聚腺苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)7.2，生化學工業株式會社制)中加入100mL 0.1M的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0)，溶解后，在該溶液中加入核酸酶P1(來源于青霉，生化學工業株式會社制)，然后一邊用試驗例5記載的方法監控平均鏈長，一邊于25℃進行3小時的孵化，使該聚腺苷酸短鏈化(磷酸位移率為0.1％，平均鏈長為287 b)。
實施例8在1g尿苷-5’-二磷酸三鈉鹽及0.3g氯化錳中加入約100mL 0.2M的碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖液，攪拌溶解。然后，添加1N的氫氧化鈉將pH值調整到9.5后，再添加0.2mL多核苷酸磷酸化酶溶液，一邊用試驗例5記載的方法監控平均鏈長，一邊于25℃進行10小時的反應。接著，在上述反應液中加入5mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反應停止，再加入2mL飽和食鹽水和100mL乙醇，使聚尿苷酸(549 b)沉淀。對所得聚尿苷酸進行離心分離，在沉淀物中加入50mL注射用水進行再溶解后再進行透析處理。然后，在透析內液中加入1N的氫氧化鈉，將pH值調整到8.5，于80℃進行30分鐘的加熱水解調節該聚尿苷酸的鏈長。最后，用超濾膜對上述短鏈化多核苷酸溶液進行膜分離，在調節鏈長分布的同時除去不需要的鹽、短鏈化反應時生成的副產品等(磷酸位移率為0.1％，平均鏈長為485 b)。
實施例9在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和2g精制卵磷脂中加入溶有40g麥芽糖的100mL注射用水，攪拌混合后，用均化機進行5分鐘的分散處理，獲得陽離子脂質體(載體)的粗分散液。然后，用實驗室用小型乳化分散機對該粗分散液進行1小時的分散處理，獲得陽離子脂質體溶液。在攪拌下緩緩地在該陽離子脂質體溶液中加入約50mL分別含有200mg實施例1及實施例2制得的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸鈉鹽及聚胞苷酸鈉鹽的水溶液后，用實驗室用小型乳化分散機對該水溶液進行2小時的分散處理，最后用注射用水定容至400mL，獲得含有本復合體的組合物。對該含有本復合體的組合物進行過濾滅菌處理后，將其1mL一份分別注入小瓶中，然后按照常規方法制成冷凍干燥制劑。用注射用水重組冷凍干燥制劑，使其為1mL時的本復合體的平均粒徑為133nm(光子相關法)。
實施例10在50g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和25g大豆磷脂中加入溶有1kg蔗糖的3L注射用水，攪拌混合后，用Manton-Gaulin型高壓均化機進行30分鐘的分散處理，再用注射用水定容至5L，獲得陽離子脂質體(載體)的分散液。然后，在攪拌下緩緩地在該陽離子脂質體溶液中加入約2L分別含有1g實施例1及實施例2制得的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸鈉鹽及聚胞苷酸鈉鹽的水溶液，再用1N的鹽酸將pH值調整為5.5。接著，再次用Manton-Gaulin型高壓均化機進行1小時的分散處理，最后用注射用水定容至10L，獲得含有本復合體的組合物。將含有本復合體的組合物20mL一份分別注入小瓶中后，按照常規方法制成冷凍干燥制劑。用注射用水重組冷凍干燥制劑，使其為20mL時的本復合體的平均粒徑為158nm(光子相關法)。
實施例11在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和2g卵磷脂中加入溶有40g葡萄糖的100mL注射用水，攪拌混合后，用均化機進行5分鐘的分散處理，再定容至500mL，獲得陽離子脂質體(載體)的粗分散液。接著，用實驗室用小型乳化分散機對粗分散液進行1小時的分散處理，獲得陽離子脂質體溶液。將所得溶液10mL一份分別注入小瓶中，按照常規方法進行冷凍干燥。在該冷凍干燥品中加入10mL分別含有5mg實施例1、2或5、6獲得的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽，以及市售的聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.8，Yamasa醬油株式會社制)和聚胞苷酸鈉鹽(S020.w(沉降系數)8.6，Yamasa醬油株式會社制)的水溶液，然后，用探針型超聲波分散機進行10分鐘的分散處理，獲得含有本復合體的組合物。
實施例12攪拌下混合1mL分別含有100μg實施例3及4獲得的磷酸位移率較低的短鏈化聚腺苷酸鈉鹽和聚尿苷酸鈉鹽的水溶液及2mL含有2mg市售Lipofectin(商品名)的水溶液，然后用探針型超聲波分散機進行15分鐘的分散處理，獲得含有本復合體的組合物。
實施例13在約200mg聚肌苷酸鈉鹽(S020.w(沉降系數)8.8，Yamasa醬油株式會社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，攪拌溶解后，加熱至80℃，然后，一邊用試驗例6記載的方法對磷酸位移率進行監控，一邊對具有任意的磷酸位移率的聚肌苷酸進行取樣。接著，在硼酸緩沖液(pH 8.5)中將具有各種磷酸位移率的聚肌苷酸加熱至60℃，再用試驗例5記載的方法一邊監控鏈長一邊使聚肌苷酸短鏈化，使其平均鏈長達到200±50 b，其結果如表3所示。分別對所得短鏈化聚肌苷酸溶液進行透析處理后，按照常規方法進行冷凍干燥處理，獲得冷凍干燥品。
表3

實施例14在約200mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.6，Yamasa醬油株式會社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，攪拌溶解后，加熱至80℃，然后，一邊用試驗例6記載的方法對磷酸位移率進行監控，一邊對具有任意的磷酸位移率的聚胞苷酸進行取樣。接著，在硼酸緩沖液(pH8.5)中將具有各種磷酸位移率的聚胞苷酸加熱至70℃，再用試驗例5記載的方法一邊監控鏈長一邊使聚胞苷酸短鏈化，使其平均鏈長達到200±50 b，其結果如表4所示。分別對所得短鏈化聚胞苷酸溶液進行透析處理后，按照常規方法進行冷凍干燥處理，獲得冷凍干燥品。
表4

實施例15具有雙鏈的短鏈化多核苷酸分別調制由實施例1、2、13及14獲得的磷酸位移率為0.7％的聚肌苷酸和磷酸位移率為1.2％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)，磷酸位移率為2.0％的聚肌苷酸和磷酸位移率為1.9％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)，磷酸位移率為2.8％的聚肌苷酸和磷酸位移率為2.7％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)。將各聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽溶于Tris-鹽酸緩沖液(pH7，含有0.15M的氯化鈉)，于80℃加熱5分鐘后，慢慢冷卻就可獲得各種具有雙鏈的短鏈化多核苷酸。
比較例1(對應于實施例1的以往制法-1)在5mg聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.8，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，在該溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加熱5小時(磷酸位移率為8.9％，平均鏈長為628 b)。
比較例2(對應于實施例2的以往制法-1)在5mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.6，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，在該溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加熱5小時(磷酸位移率為4.2％，平均鏈長為751 b)。
比較例3(對應于實施例1的以往制法-2)在5mg聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.8，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，于90℃對該溶液進行8小時的加熱(磷酸位移率為7.1％，平均鏈長為213 b)。
比較例4(對應于實施例2的以往制法-2)在5mg聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.6，Yamasa醬油株式會社制)中注入10mL注射用水，攪拌溶解后，于90℃對該溶液進行12小時的加熱(磷酸位移率為4.2％，平均鏈長為289 b)。
比較例5調制分別由實施例13和14獲得的磷酸位移率為4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率為3.8％的聚胞苷酸組合而成的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸(雙鏈RNA)。將作為多核苷酸的聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽溶于Tris-鹽酸緩沖液(pH7，含有0.15M的氯化鈉)，于80℃加熱5分鐘后，慢慢冷卻就可獲得該具有雙鏈的短鏈化多核苷酸。
試驗例1平均鏈長對藥理活性的影響根據對HeLa S3癌細胞的細胞增殖抑制作用(體外)對實施例9的組合物的藥理活性進行評估。進行實驗時，將HeLa S3癌細胞以104細胞/孔的密度接種在96孔的滴定板中進行24小時或更長時間的培養，確認細胞充分附著在板中后，添加該組合物，繼續進行培養。在CO2培養箱內培養3天后，用MTT法測定存活細胞數，再用下式算出細胞增殖抑制率，其結果如表5所示。
細胞增殖抑制率(％)＝(復合體處理群的吸光度值/對照群的吸光度)×100
表5

(a)聚肌苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)(b)聚胞苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)如表5所示，各組合物對作為癌細胞株的HeLa S3的細胞增殖抑制作用和平均鏈長有很大關系。表5中，一般作為干擾素誘導劑使用的1000 b以上的長鏈聚肌苷酸·聚胞苷酸顯現出最強的增殖抑制作用，本發明的平均鏈長在0.1kb～1kb范圍內的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸·聚胞苷酸雖然略低，但也保持了足夠強的增殖抑制作用。此外，當平均鏈長不足100 b時細胞增殖抑制作用急劇下降，接近寡核苷酸程度的多核苷酸幾乎不顯現活性。
試驗例2對骨髓細胞的影響對骨髓毒性進行研究作為毒性評估。對ddY小鼠(雄性，8周)靜脈注射市售的聚肌苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.8，Yamasa醬油株式會社制)和聚胞苷酸鈉鹽(S020，w(沉降系數)8.6，Yamasa醬油株式會社制)，以及實施例5和6中的磷酸位移率較低的聚肌苷酸、聚胞苷酸中平均鏈長分別為982 b和907 b的多核苷酸，第2天從大腿骨處抽取骨髓細胞。用新亞甲藍和吉姆薩對細胞進行染色，測定網織紅細胞和成熟紅細胞，其結果如表6所示。表6的骨髓毒性是指網織紅細胞數和全部紅細胞數之比，由下式定義。此外，*標記為顯著性水平p＜0.01，表示試驗群和靜脈內注射了無多核苷酸的載體的對照群的顯著性差異(Dunnett的多重比較法)。
骨髓毒性＝(網織紅細胞數/網織紅細胞數＋成熟紅細胞數)表6

(a)聚肌苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)(b)聚胞苷酸鈉鹽(Yamasa醬油株式會社制)從表6可看出，一般作為干擾素誘導劑使用的平均鏈長超過1000 b的長鏈聚肌苷酸·聚胞苷酸的投藥量即使只有1mg/kg，其對應于對照群的變化也達到了39％，而本發明的平均鏈長在0.1kb～1kb范圍內的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸·聚胞苷酸的投藥量即使是前述的25倍，和對照群相比也未顯現出顯著性差異。從上述結果可知，聚肌苷酸·聚胞苷酸的毒性和藥理活性一樣，和平均鏈長有極大的關系，這樣就完全意外地發現本發明的短鏈化多核苷酸能夠大幅度地緩解毒性。
試驗例3對A431癌細胞的細胞增殖抑制作用(體外)(平均鏈長200±50b)使用實施例13和14的磷酸位移率為0.7～4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率為1.2～3.8％的聚胞苷酸、實施例1和2的短鏈化聚肌苷酸和聚胞苷酸，與實施例11同樣操作獲得組合物。將A431癌細胞以104細胞/孔的密度接種在96孔的滴定板中進行5小時以上的培養，確認細胞充分附著在板中后，添加該組合物，繼續進行培養，在二氧化碳培養箱內培養3天后，用MTT法測定存活細胞數，再用前述式1求得細胞增殖抑制率，由細胞增殖抑制率算出對應于50％的細胞增殖抑制率的聚肌苷酸鈉鹽和聚胞苷酸鈉鹽的合計濃度(IC50值)，其結果如表7所示。
表7

從表7可看出，該組合物對癌細胞A431的細胞增殖抑制作用和磷酸位移率有很大的關系。即，不論是聚肌苷酸還是聚胞苷酸，從3’位轉移到2’位的磷酸基團越多，顯現出越弱的增殖抑制作用。值得注意的是，本發明的磷酸位移率較低的短鏈化聚肌苷酸、短鏈化聚胞苷酸(磷酸位移率在3％以下，特別好的在2％以下)的組合對細胞的增殖抑制作用大幅度增強。此外，磷酸位移率為3％，特別是超過2％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的組合雖然有協同作用，但增殖抑制作用有減弱的趨勢。例如，表7中，磷酸位移率為2.0％和1.9％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的組合和同樣的磷酸位移率為2.8％及2.7％或4.2％及3.8％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的組合相比，IC50之比提高12倍或47倍。極為意外地發現，以3’位轉移到2’位的磷酸位移率為3％，特別是2％為界，藥理活性有了急劇提高。
試驗例4 因磷酸位移而造成的熔解溫度(Tm)和藥理活性的變化在溫度上升到特定溫度時，雙鏈RNA被分解為單鏈RNA。由于該溫度因包含在RNA中的堿基種類的不同而顯現出特定值，所以該溫度為雙鏈RNA的熔解溫度，一般被稱為Tm值。在對該Tm值進行測定時可采用各種方法，但本實施例使用最普通的吸光光度法對實施例15及比較例5的雙鏈RNA的Tm值進行測定，其結果如表8所示。此外，同樣記錄在表8中的IC50值是試驗例3的測定結果。
表8

各組合物的磷酸位移率約為0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值測定結果無明顯差異(一般作為干擾素誘導劑使用的長鏈聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值為61℃)。即，由磷酸位移率約為0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸獲得了以雙鏈RNA為特征的雙重螺旋結構。但是，從試驗例3可知，由于以2％～3％的磷酸位移率為界的多核苷酸的藥理活性提高4倍～50倍不等，所以意外地發現作為聚肌苷酸·聚胞苷酸的主要藥效的免疫活性作用和抗癌作用不僅受雙鏈RNA的雙重螺旋結構的影響，還受磷酸基團的位移率的影響。而且，從3’位轉移到2’位的磷酸基團的位移率在2％～3％的范圍內時，其藥理活性急劇提高。
試驗例5 短鏈化多核苷酸的平均鏈長的測定(GPC法)在以下的凝膠滲透層析(GPC)的操作條件下，用1mg/mL的多核苷酸水溶液進行試驗，求得平均鏈長。
GPC操作條件檢測波長UV 260nm柱 Tosoh-TSKgel G5000PWXL 7.8mmφ×300mm流動相 含有7M尿素的50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)流速0.5mL/min.
尺寸標記RNA Ladder(1770 b，1520 b，1280 b，780 b，530b，400 b，280 b，155 b)(Gibco BRL株式會社制)
試驗例6 磷酸位移率的測定在1mg/mL的多核苷酸水溶液1mL中加入3.2mL的500U/mL的核酸酶P1(來源于青霉，生化學工業株式會社制)，再加入水稀釋至5mL。將該水溶液放置在37℃的熱水浴中使反應進行1小時后，加水至10mL。從該反應液中取出3.2mL，在其中加入0.1U/mL的堿性磷酸酶(來源于牛仔的小腸，生化學工業株式會社制)水溶液0.8mL后，在37℃的熱水浴中使反應進行30分鐘，再對該溶液進行適當的稀釋，按照以下的液相色譜法的操作條件進行試驗，對含有2’-5’磷酸二酯鍵的二聚體進行定量，測定磷酸位移率。
液相色譜法操作條件檢測波長UV 260nm柱 資生堂Capcell pack C18 UG1205μm 4.6mmφ×250mm流動相 含有5mM硫酸氫四丁基銨的50mM磷酸緩沖液(pH8)和甲醇的混合液(95∶5)流速1mL/min.
權利要求
1.短鏈化多核苷酸或其鹽，其特征在于，2’-5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3％以下。
2.如權利要求1所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，其中，多核苷酸為聚肌苷酸或其類似物、聚胞苷酸或其類似物、聚腺苷酸或其類似物、或聚尿苷酸或其類似物。
3.如權利要求1或2所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，其中，所述短鏈化多核苷酸或鹽的平均鏈長在0.1k bases～1k bases的范圍內。
4.具有雙鏈的多核苷酸或其鹽，其特征在于，由權利要求1～3的任一項所述的短鏈化多核苷酸或其鹽中，可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸或鹽形成。
5.如權利要求4所述的具有雙鏈的多核苷酸或其鹽，其中，可形成雙鏈的2個短鏈化多核苷酸選自聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸類似物、聚肌苷酸類似物·聚胞苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸類似物、聚腺苷酸類似物·聚尿苷酸類似物。
6.權利要求1～3的任一項所述的短鏈化多核苷酸或其鹽的制法，其特征在于，在pH值為7～10的溶液中，在20～110℃的溫度條件下，使多核苷酸或其鹽短鏈化。
7.如權利要求1～3的任一項所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，其特征還在于，多核苷酸或其鹽通過磷酸二酯酶短鏈化。
8.含有復合體的組合物，其特征在于，所述復合體以可將藥物移入細胞內的有效載體和權利要求1～3的任一項所述的短鏈化多核苷酸或其鹽，或權利要求4或5所述的具有雙鏈的短鏈化多核苷酸或其鹽為必須構成組分。
9.如權利要求8所述的組合物，其中，可將藥物移入細胞內的有效載體為帶有正電荷的載體。
10.如權利要求9所述的組合物，其中，帶有正電荷的載體為陽離子脂質體。
11.如權利要求8所述的組合物，其中，可將藥物移入細胞內的有效載體以2-o-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-o-二油酰基甘油和磷脂為必須構成組分。
12.如權利要求8～11的任一項所述的組合物，其中，所述組合物為藥劑。
13.如權利要求12所述的組合物，其中，所述藥劑為干擾素誘導劑、免疫活性劑、細胞內核酸酶活性劑、癌治療劑或預防劑、肝炎治療劑或預防劑。
全文摘要
本發明的目的是提供作為醫藥品特別有用的短鏈化多核苷酸或含有短鏈化多核苷酸的醫藥組合物。本發明的短鏈化多核苷酸或其鹽、以及含有其中任1種的醫藥組合物的特征是,2’－5’磷酸二酯鍵占所有磷酸二酯鍵的3%以下。
文檔編號A61P43/00GK1340055SQ00803787
公開日2002年3月13日 申請日期2000年2月14日 優先權日1999年2月15日
發明者松山伸二, 石山幸一, 關純造, 大木忠明 申請人:日本新藥株式會社