連接酶-輔助的核酸環化和擴增的制作方法
【專利說明】連接酶-輔助的核酸環化和擴増 發明領域
[0001 ] 本發明主要涉及包括經由模板-非依賴性單鏈DNA連接，從單鏈或雙鏈線性DNA 生成單鏈DNA環的核酸測定法。本發明還涉及單鏈DNA環經由滾環擴增的擴增和/或檢 測。單鏈DNA環的生成和后續的DNA擴增在單一反應容器中進行，而無需任何插入的分離 和/或純化步驟。還提供用于進行該方法的試劑盒。
[0002] 背景 DNA擴增是一個復制目標雙鏈DNA (dsDNA)以生成其多個拷貝的過程。因為dsDNA的 各條鏈是反平行的和互補的，每條鏈可用作其互補鏈產生的模板鏈。模板鏈作為整體或作 為截短的部分保留，而互補鏈通過DNA聚合酶從脫氧核苷三磷酸（dNTP)裝配。互補鏈合成 從雜交至模板鏈的引物序列的3 '末端開始，以5 ' - 3 '方向進行。
[0003] 全基因組擴增（WGA)包括目標DNA的非-特異性擴增。WGA往往通過多重置換擴 增（MDA)技術，采用在目標DNA的多個位置引發DNA合成的隨機寡核苷酸引物連同具有鏈 置換活性的高保真性DNA聚合酶（如，Phi29聚合酶）一起實現。盡管目前可市售獲得的 WGA系統例如GenomiPhi (GE Healthcare, USA)和RepliG (Qiagen)試劑盒提供具有高分 子量目標DNA的最佳結果，但當目標DNA短和/或高度片段化時，這些系統的性能是差的。 當目標DNA被片段化和序列長度少于約1000個核苷酸時，使用常規方法擴增目標DNA導致 擴增速度降低，顯著的序列丟失（特別是在接近目標DNA的末端），和高度的序列-偏倚擴 增。隨著模板DNA的長度減少，在MDA反應中引導該鏈的可能性成倍地減少。這降低了這 些較短片段的擴增潛力。因此，用于非-特異性地擴增短的、片段化DNA的有效方法是高度 合乎需要的。
[0004] 連接-介導的聚合酶鏈反應（PCR)已被用來擴增片段化dsDNA。然而，在這些反應 中，只有小部分的片段化DNA得到擴增，導致基因組覆蓋不足。為有效地擴增片段化的目標 dsDNA，可首先修復它們，然后通過鈍端連接被串聯化，以生成長于1000個堿基對（bp)的序 列。然而，往往需要相對較高濃度的目標DNA以促進串聯化（concatamerization)和后續 的擴增。雙鏈目標DNA的環化也被用于各種基于核酸的測定法，包括MDA、WGA、超支化滾環 擴增（RCA)和大規模平行DNA測序。為了有效地環化和擴增片段化dsDNA，片段化DNA的雙 鏈末端被首先修復，接著經鈍端連接，以形成雙鏈DNA環。然而，環化長度少于500 bp的雙 鏈DNA片段是困難的。
[0005] 雙鏈DNA可被變性以產生單鏈DNA (ssDNA)，其可在模板-依賴性分子內連接反應 中使用連接酶而被進一步環化。然而，需要目標DNA的現有序列信息，以進行模板-依賴性 環化。ssDNA的模板-非依賴性分子內連接也已有文獻記載。例如，TS2126 RNA連接酶（可 以商標名 ThermoPhage? RNA連接酶 II 或 ThermoPhage? ssDNA連接酶（Prokaria, Matis, Iceland)或CircLigase? ssDNA連接酉每（Epicenter Biotechnologies, Wisconsin, USA) 經市售獲得）已被用于制備數字（digital) DNA球，和/或DNA，例如基因組DNA的位點-特 異性裂解和擴增。從mRNA的5'-端片段制備的線性單鏈互補DNA (cDNA)分子在使用 TS2126 RNA連接酶環化后，也已通過滾環復制擴增。通過適當地將有義RNA聚合酶啟動子 序列摻入cDNA中，已顯示環化的cDNA模板作為轉錄底物起作用，并因而進行在生物學樣 本中的mRNA分子的擴增。此外，TS2126 RNA連接酶已被用來擴增用于隨機擴增cDNA末端 (RACE)的cDNA末端。通過采用TS2126 RNA連接酶，還從有限量的片段化DNA，生成用于 滾環擴增的DNA模板。該方法包括使線性的片段化dsDNA變性以獲得線性ssDNA片段，用 CircLigase? ssDNA連接酶連接線性ssDNA以獲得單鏈DNA環，然后使用隨機引物和Phi29 DNA聚合酶經由RCA擴增單鏈DNA環。然而，即使在優化反應條件后，生成的單鏈環狀DNA 的量是高度可變和序列依賴性的。例如，在相同的連接條件下，包含5 ' G和3 ' T核苷酸 的寡核苷酸比其包含5 ' A和3 ' C的互補寡核苷酸顯著更好地連接。此外，分子內連接 效率在具有相同的或極其類似大小的線性ssDNA序列中變化，但在核苷酸序列中有小的差 異。效率在不同大小的線性ssDNA序列（如，序列長度范圍從100個堿基至數千堿基大小） 中也有變化。而且，連接-擴增反應的所有嘗試涉及中間分離、純化和/或清潔步驟，因而 使得連接-擴增工作流程繁瑣。例如，通過環化，接著滾環擴增的片段化DNA的法醫樣本的 分析以多步驟進行，包括5' DNA磷酸化、接頭連接、DNA環化和全基因組擴增。每個步驟 反應在進行下一步驟之前要經受反應清理。當連接和擴增在單一反應容器中進行時，未觀 察到擴增優點。然而，多步驟過程往往造成模板DNA的丟失并導致分析失敗。用于在單一 反應容器中非-特異性地擴增短的DNA序列，而無任何序列偏倚和任何插入的清潔步驟的 有效方法因而是尚度需要的。
[0006] 簡述 在一些實施方案中，提供一種從線性DNA生成單鏈DNA環的方法。該方法包括提供線性 DNA，通過在磷酸供體的存在下使其與多核苷酸激酶一起孵育將線性DNA末端修復以生成 具有在5'末端的磷酸基團和在3'末端的羥基的可連接的DNA序列，和用連接酶對經修復 的可連接的DNA序列進行分子內連接以生成單鏈DNA環的步驟。該方法的所有步驟在單一 反應容器中進行，而無需任何插入的分離或純化步驟。磷酸供體可以是鳥苷三磷酸（GTP)、 胞苷三磷酸（CTP)、尿苷三磷酸（UTP)、脫氧胸苷三磷酸（dTTP)或其組合。線性DNA可以是 雙鏈或者單鏈DNA。DNA可以是片段化DNA例如循環DNA。可連接的DNA，如果呈現為雙鏈 形式，則在分子內連接反應之前需要被變性。能夠模板-非依賴性的、分子內連接單鏈DNA 序列的預腺苷酸化連接酶可被用于連接反應。
[0007] 在一些實施方案中，提供一種從線性DNA生成單鏈DNA環的方法，其中該方法在分 子內連接步驟之前采用DNA預腺苷酸化步驟。線性DNA可在腺苷三磷酸（ATP)的存在下， 任選地用多核苷酸激酶孵育，以生成包含在5'末端的磷酸基團和在3'末端的羥基的可連 接的DNA序列。如果線性DNA呈現為高度片段化形式，可優先從線性DNA生成可連接的DNA 序列。線性DNA或可連接的DNA序列然后在ATP的存在下用腺苷酸化酶孵育，以生成5 ' 腺苷酸化DNA序列。5 '腺苷酸化DNA序列然后用非-腺苷酸化連接酶孵育，該酶能夠進行 模板-非依賴性分子內連接5 '腺苷酸化DNA序列，以生成單鏈DNA環。該方法的所有步 驟在單一反應容器中進行，而無需任何插入的分離或純化步驟。如果非-腺苷酸化連接酶 是ATP-依賴性連接酶，在分子內連接反應前，ATP可必須從反應混合物中除去（如，通過用 磷酸酶處理反應混合物）。如果5 '腺苷酸化DNA呈現為雙鏈形式，則在分子內連接反應前 需要變性。
[0008] 附圖 本發明的這些和其它特征、方面和優點，當參照附圖閱讀以下詳細描述時，將變得更易 理解。
[0009] 圖1說明片段化dsDNA的連接酶-輔助全基因組擴增的實施方案的示意圖。
[0010] 圖2說明從健康個體的血漿分離的循環DNA的大小分布。
[0011] 圖3說明使用不同的連接酶從血液提取的循環DNA的連接酶-輔助全基因組擴 增。
[0012] 圖4說明用于4種不同的CODIS位點的靈敏的和平衡的DNA擴增的連接酶-輔助 全基因組擴增的效力。
[0013] 圖5說明用于12種不同的CODIS位點的靈敏的和平衡的DNA擴增的連接酶-輔 助全基因組擴增的效力。
[0014] 圖6說明在不同的反應和緩沖條件下，連接酶-輔助的全基因組擴增的效率。
[0015] 圖7說明在連接酶-輔助的全基因組擴增中，高分子量基因組DNA擴增的抑制作 用。
[0016] 圖8說明連接酶-輔助的全基因組擴增的示意圖，其包括使用多核苷酸激酶處理 (如，末端修復）片段化DNA，接著是經處理的片段化DNA的連接酶-輔助的擴增。
[0017] 圖9說明在GTP的存在下，采用PNK和CircLigase II?的片段化DNA的連接酶-輔 助擴增的單管反應的示意圖。
[0018] 圖10說明使用雄性-雌性血漿/血的單管連接酶-輔助的擴增反應，其中DYS14 雄性-特異性標記物使用從輸入DNA創立的庫檢測。
[0019] 圖11說明片段化DNA的磷酸化和預腺苷酸化，接著使用基本上非-腺苷酸化連接 酶連接的示意圖。
[0020] 圖12說明使用基本上非-腺苷酸化連接酶環化預腺苷酸化DNA序列的提高的效 率。
[0021] 圖13說明當目標DNA序列被預腺苷酸化和當使用非-腺苷酸化連接酶進行連接 時，連接酶-輔助全基因組擴增的提高的效率。
[0022] 詳細描述 以下詳細描述是示例性的并不打算限制本發明或本發明的應用。貫穿整個說明書，具 體術語的舉例說明應視為非-限制性實例。單數形式"a"、"an"和"the"包括復數指代，除 非文中另外清楚地指明。近似語言，如本文貫穿說明書和權利要求書中所用的，可用于修飾 任何定量的表示，其可允許變化而不導致其相關基本功能的改變。因此，由術語如"約"修飾 的值并不限于所指定的精確值。除非另外指明，否則表示本說明書和權利要求書中所用的 成分的量、特性如分子量、反應條件等的所有數字將被理解為在所有的情況下由術語"約" 修飾。因此，除非有相反的指示，否則在以下本說明書和所附權利要求書中提出的數值參數 是近似值，其可根據本發明探尋而獲得的所需特性而變化。最低限度上，以及不試圖限制權 利要求書范圍的等同原則的適用，每個數值參數應該至少按照報告的有效數字的位數和通 過應用普通的四舍五入技術來解釋。必要時，提供范圍，和那些范圍包括之間所有的子范 圍。為了更清楚地和準確地描述和指出要求保護的發明的主題，對在以下描述和所附權利 要求書中使用的具體術語提供以下定義。
[0023] 如本文所用的，術語"核苷"指糖胺化合物，其中核酸堿基（核堿基）連接于糖部 分。"核苷酸"指核苷磷酸。核苷酸可使用對應于其核苷的按字母順序排列的字母（字母代 號）表不，如在表1中所述。例如，A表不腺苷（含有核堿基的核苷，腺噪呤），C表不胞苷， G表示鳥苷，U表示尿苷，和T表示胸苷（5-甲基尿苷）。W表示A或者T/U，和S表示G或者 C。N表示隨機核苷和dNTP指脫氧核糖核苷三磷酸。N可以是A、C、G或T/U的任何一個。
[0024] 表1 :各種核苷酸的字母名稱。
[0025] 如本文所用的，術語"核苷酸類似物"指在結構上與天然存在的核苷酸類似的化 合物。核苷酸類