檢測伏馬毒素的elisa試劑盒的制備及檢測方法
【專利摘要】本發明為檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及其檢測方法，其檢測靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。所述試劑盒包括：包被了伏馬毒素抗原的酶標板、伏馬毒素標準品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮樣品稀釋液和濃縮洗滌液。伏馬素素檢測試劑盒的原理是固相間接競爭酶聯免疫反應，把提取的樣品、酶標二抗工作液和抗體工作液加入對應的酶標孔中，孵育一段時間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里將會出現藍色，加入終止液，顏色由藍色變為黃色。顯色的深淺與標準品或樣品中伏馬毒素的含量成反比例關系。該方法可直接用于檢測玉米中的伏馬毒素。
【專利說明】檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于檢測【技術領域】，具體地涉及一種用于定量檢測堅果、谷物和谷物產品中的伏馬毒素殘留量的ELISA試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]伏馬毒素(Fumonisins)是一組主要由串珠鍵刀菌ipusarium moniliforme)在一定溫度和濕度條件下繁殖所產生的真菌毒素。1988年，Gelderblom等首次從玉米中分離出伏馬毒素BI。伏馬毒素在自然界中分布廣泛，且危害性大，逐漸引起了國內外學者的高度重視。目前，已發現的伏馬毒素結構類似物主要分為A、B、C、P四類，包括FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FPl 等。
[0003]伏馬毒素(B1，B2，和B3)是由鐮孢菌(霉)屬念珠菌產生的真菌毒素。在世界范圍內都發現了伏馬毒素污染玉米的現象。研究表明伏馬毒素可以誘發老鼠患肝癌，豬的肺水腫和馬的腦脊髓白質病。在一些地區中玉米中伏馬毒素含量很高，在這些地區(比如中國和非洲)人的食道癌具有高發性。
[0004]研究證實伏馬毒素可致馬大腦白質軟化癥(EL-EM )，神經性中毒而表現意識障礙、失明和運動失調等癥狀，嚴重者甚至造成死亡。對豬造成肺水腫綜合征(PPE)，并能造成肝臟和食道損傷。伏馬毒素還可引起靈長類動物的動脈粥樣硬化樣改變，誘發大鼠肝癌，與人類食道癌的發生也密切相關。國際癌癥研究機構與加利福尼亞環境保護機構已宣布伏馬毒素為人類潛在的致癌物質(2B級致癌物)。
[0005]基于伏馬毒素的污染范圍較廣，毒性作用也較大，許多國家和地區對伏馬毒素進行了系統研究。但目前國際上對于食品與飼料中伏馬毒素的限量及檢測方法尚無統一標準。瑞典規定人類食物中伏馬毒素的限量為I mg/kg，美國食品與藥品管理局(FDA)發布了供人類食用的玉米和玉米產品伏馬毒素的最高限量指導性公告，規定人類食用玉米中伏馬毒素最高限量為2 mg/kg。同時，FDA的畜牧醫學中心(CVM)也發布了動物飼料中伏馬毒素的最高限量指導性公告，規定其限量范圍為廣50 mg/kg。在FA0/WH0聯合會上關于食品添加劑的會議(2001年2月)中規定，伏馬毒素對人體的安全限量為每天攝入量按人體體重算FB1、FB2、FB3量不超過2 g/kg。FBI以低于最大限量為最好，對FB2、FB3的限制相對較寬。我國對此的相關法規也正在制定中。在出入境檢驗檢疫行業推薦標準中，液相色譜法對伏馬毒素B1、B2的測定低限均為0.05 mg/kg，而酶聯免疫吸附法則推薦檢測低限為12 g Ag0這些行業標準和檢測方法均可為我國制定國家標準提供一定的依據。
[0006]免疫學技術具有敏感、特異、簡便的特點，近年來已被應用于伏馬毒素殘留檢測。目前伏馬毒素的免疫學檢測試劑盒大多來自進口，而國內有關伏馬毒素的試劑盒的開發還相對落后。本發明旨在建立一種檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法。

【發明內容】

[0007]針對現有技術中存在的問題，本發明提供了檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒，其檢測靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。本發明提供了檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法。
[0008]檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法,包括酶標板、伏馬毒素標準品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0009]檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括以下步驟:酶標板的制備、伏馬毒素標準品的制作、伏馬毒素單克隆抗體及其工作液的制備、伏馬毒素酶標二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
[0010]其進一步特征在于:所述的伏馬毒素包被抗原是將伏馬毒素半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將伏馬毒素抗原稀釋成1:10000比例，100 μ?ν孔，37°C放置2 h,取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0011]所述的伏馬毒素標準品濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL。
[0012]伏馬毒素蛋白質偶聯物單克隆抗體工作液的制備:采用伏馬毒素人工抗原免疫兔所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:40000。
[0013]所述伏馬毒素酶標二抗工作液的制備:用酶標二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0014]伏馬毒素的ELISA試劑盒的檢測方法，基于抗原抗體進行間接競爭酶聯免疫反應，該方法包括以下步驟:
(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有伏馬毒素抗原的酶標板，加標準品/樣本50μ L/孔到對應的微孔中；
(4)加入伏馬毒素酶標二抗工作液，50μ L/孔，然后加入伏馬毒素抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(6)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15~20min ；
(7)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據)；
(8)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中伏馬毒素的含量。[0015]其中，所述處理后的樣品是經過以下處理的樣品:
(1)配制90%的甲醇溶液(每個樣品需要:4mL蒸餾水+36 mL甲醇)；
(2)研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過一個20目的濾網)；
(3)稱量20g研磨過濾后的樣品加入40 mL 90%的甲醇溶液，樣品稀釋比為1:2 (w/
V);
(4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin ；
(5)靜置、用濾紙(Whatman#1)過濾5_10 mL以上處理的液體，收集濾液；
(6)以1:20的比例稀釋濾液(取0.1 mL濾液然后加入1.9 mL的蒸餾水或去離子水)，混勻待測。
[0016]本發明采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法來檢測。用于檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的測定原理:樣品中的伏馬毒素與酶標板上固定的抗原特異性競爭體，加入酶標二抗，與抗體反應，通過酶催化顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中伏馬毒素的含量。如果樣品中的伏馬毒素含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用于大批量樣品的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為伏馬毒素標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0018]檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒,其包括酶標板、伏馬毒素標準品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0019]下面具體描述本發明中檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備。
[0020]伏馬毒素蛋白質偶聯物的制備:
將伏馬毒素半抗原與載體蛋白BSA按12:1的結合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入入碳二亞胺，攪拌I?2h，置室溫反應24 h，最后用0.2 mol/L pH 7.6的PBS透析兩天，除去未反應的半抗原，即可得到伏馬毒素蛋白質偶聯物。
[0021]伏馬毒素抗體的制備:
選用3月齡健康大白兔，通過三次免疫，每次伏馬毒素蛋白質偶聯物免疫原用量為50 μ g/0.05 mL，每次免疫間隔時間為2周。初次免疫分別將免疫抗原與費氏佐劑及不安全佐劑等量混合，勁部皮下多點注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注Λ 25 Pg伏馬毒素蛋白質偶聯物進行加強免疫，免疫后第6 d耳靜脈取血，采用間接競爭ELISA法測定效價。取得較高效價后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后頸動脈采全血，分離抗血清，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，制成凍干粉后于_20°C保存備用。
[0022]酶標伏馬毒素的制備:
將25%戊二醛用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋至5%，稱取5 mg HRP溶于0.5 mL 5%的戊二醛，37°C水浴結合2 h ;加入0.15 mol/L NaCl 1.0 mL，充分混勻后，置4°C預冷10 min ;加入無水乙醇2.4 mL,顛倒混合,立即1000 r/min離心10 min ;棄掉上清，沉淀用冷的75%乙醇洗一次，將離心管倒置，風干；加入0.05 mol/L pH 9.6的CBS 0.5mL溶解沉淀物；將5 mg PEA抗體溶于0.5 mL 0.15 mol/LNaCl，再與醛化HRP溶液混合；力口Λ 1.0 mol/L pH 9.6的CBS溶液，調節pH至9.0?9.5，于4°C下，電磁攪拌結合24 h ;加入
0.1 mL 0.15 mol/L賴氨酸，以封閉殘留的醛基，終止反應，放置于4°C下2 h ;將反應物通過S印hadex G-200凝膠柱，用PBS洗脫，收集第一洗脫峰；或將反應物裝入透析袋，用0.01mol/L pH7.2 PBS，4°C透析過夜并收集；即為酶標記抗體(HRP-伏馬毒素)。
[0023]制備包被有伏馬毒素包被抗原的酶標板:
酶標板包被伏馬毒素抗原，包被抗原是將伏馬毒素半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將伏馬毒素抗原稀釋成1:10000比例，100μ L/孔，37°C放置2 h,取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0024]所述的伏馬毒素標準品配制濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL>20 ng/mL>50ng/mL、150 ng/mL。
[0025]所述的伏馬毒素蛋白質偶聯物單克隆抗體工作液的制備:采用伏馬毒素人工抗原免疫兔所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成I =40000。
[0026]所述伏馬毒素酶標二抗工作液的制備:用酶標二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0027]基于上述制備的試劑，本發明用于檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標板XI塊(包被有偶聯抗原)；
(2)標準液X 6 瓶:(ImL/瓶)O ng/mL>5 ng/mL、10 ng/mL>20 ng/mL、50 ng/mL、150ng/mL ；
(3)酶標二抗工作液7 mL ；
(4)抗體工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)終止液7 mL ；
(8)10X濃縮洗滌液20 mL;
使用本試劑盒時的注意事項:
(1)室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20?25°C)會導致所有標準的OD值偏低；
(2)在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作；
(3)每加一種試劑前需將其搖勻；
(4)反應終止液為2M鹽酸,避免接觸皮膚；
(5)不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑； (6)儲存條件:保存試劑盒于2?8°C，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
(7)試劑變質的跡象:發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。O標準的吸光度(450/630 nm)值小于0.5(A45CI nm<0.5)時,表示試劑可能變質,請勿使用；
(8)該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
[0028]本發明伏馬毒素的ELISA試劑盒在檢測堅果、谷物和谷物產品中的伏馬毒素殘留量中的應用:
本發明的試劑盒用于檢測堅果、谷物和谷物產品中的伏馬毒素殘留量時，通過以下步驟實施:樣品預處理、用本發明試劑盒進行檢測、分析結果。
[0029](I)樣品預處理
配制90%的甲醇溶液(每個樣品需要:4 mL蒸餾水+36 mL甲醇)；研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過一個20目的濾網)；稱量20 g研磨過濾后的樣品加入40 mL 90%的甲醇溶液，樣品稀釋比為1:2(w/v);在密封的容器里混合，震蕩渦旋I min ;靜置、用濾紙(Whatman #1)過濾5_10 mL以上處理的液體，收集濾液；以1:20的比例稀釋濾液(取0.1mL濾液然后加入1.9 mL的蒸餾水或去離子水)，混勻待測。
[0030](2)用本發明試劑盒進行檢測上述樣品中伏馬毒素殘留量
取包被有伏馬毒素抗原的酶標板，加標準品/樣本50 μ L/孔到對應的微孔中；加入伏馬毒素酶標二抗工作液，50 μ L/孔，然后加入伏馬毒素抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ;小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260 μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μ L/孔,底物液B 50 μ L/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15?20min ;加入終止液50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據)；對比待測樣品與標準品的吸光度值大小，定量分析待測樣品中的伏馬毒素的殘留量。
[0031](3)分析結果
用上述制備的試劑盒中的6個伏馬毒素標準品濃度O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、50 ng/mL> 150 ng/mL,在 450/630 nm 處測量吸光度值。
[0032]百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，SP
百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0-O ppb標準溶液的平均吸光度值。
[0033]以標準品百分吸光率為縱坐標，以伏馬毒素標準品濃度(ppb)的半對數為橫坐標繪制標準曲線，求出直線方程。標準曲線見附圖1。Y= — 19.495X+101.84，R2=0.9989。將樣本的BziBci值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出所對應樣本的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中伏馬毒素的實際濃度。
【權利要求】
1.檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括酶標板、伏馬毒素標準品、伏馬毒素抗體工作液、伏馬毒素酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
2.檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括以下步驟:酶標板的制備、伏馬毒素標準品的制作、伏馬毒素單克隆抗體及其工作液的制備、伏馬毒素酶標二抗工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
3.根據權利要求2所述伏馬毒素的檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的伏馬毒素包被抗原是將伏馬毒素半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將伏馬毒素抗原稀釋成1:10000比例，100 μ L/孔，37°C放置2 h,取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，180 μ L/孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
4.根據權利要求2所述伏馬毒素的檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的伏馬毒素標準品濃度分別為O ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、150 ng/mL。
5.根據權利要求2所述伏馬毒素的檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的伏馬毒素蛋白質偶聯物單克隆抗體是采用伏馬毒素人工抗原免疫兔所得，該抗體工作液用 抗體稀釋液稀釋成1:40000。
6.根據權利要求2所述伏馬毒素的檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，其特征在于:所述的伏馬毒素酶標二抗工作液用酶標二抗稀釋液稀釋成1:2000比例；所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
7.權利要求2所述的檢測伏馬毒素的ELISA試劑盒的制備及檢測方法，基于抗原抗體進行間接競爭酶聯免疫反應，該方法包括以下步驟: (1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液工作液中； (2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20~25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻； (3)取包被有伏馬毒素抗原的酶標板，加標準品/樣本50μ L/孔到對應的微孔中； (4)加入伏馬毒素酶標二抗工作液，50μ L/孔，然后加入伏馬毒素抗體工作液，50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ； (5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)； (6)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15~20 min ； (7)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據)； (8)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中伏馬毒素的含量。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述處理后的樣品是經過以下處理的樣品: (1)配制90%的甲醇溶液(每個樣品需要:4mL蒸餾水+36 mL甲醇)； (2)研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過一個20目的濾網)；(3)稱量20g研磨過濾后的樣品加入40 mL 90%的甲醇溶液，樣品稀釋比為1:2(w/V); (4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin ； (5)靜置、用濾紙(Whatman#1)過濾5_10 mL以上處理的液體，收集濾液； (6)以1:20的比例稀釋濾液(取0.1 mL濾液然后加入1.9 mL的蒸餾水或去離子水)，混勻待測。
【文檔編號】G01N33/531GK103792356SQ201210433003
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月4日 優先權日:2012年11月4日
【發明者】杜道林, 洪霞 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司