一種氨基末端b型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙的制作方法
【專利摘要】本實用新型提供了一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，包括硝酸纖維素NC膜，膠體金墊、樣品墊和吸水紙，所述膠體金墊上含有NT-proBNP標記抗體以及兔IgG標記抗體，所述硝酸纖維素NC膜在沿液體層析方向上依次包被有檢測線、參比線以及質控線，本實用新型通過參比線的設置以及對劃線抗體含量的精確控制，實現對NT-proBNP濃度在300ng/L～900ng/L這一區域的血清樣品進行半定量檢測。
【專利說明】一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙

【技術領域】
[0001]本發明創造屬于人氨基末端B型利鈉肽前體檢測領域，特別涉及一種采用膠體金免疫層析法對人氨基末端B型利鈉肽前體進行半定量檢測的試紙。

【背景技術】
[0002]氨基末端B型利鈉肽前體(ΝΤ-ρι.οΒΝΡ)是由心室分泌的一種激素類多肽。是由心肌細胞合成的具有生物學活性的天然激素，主要在心室表達，同時也存在于腦組織中。當心室功能不全時，由于心肌擴張而快速合成釋放入血，有助于調節心臟功能。心肌細胞所分泌的BNP先以108個氨基酸組成的前體形式存在，當心肌細胞受到刺激時，在活化酶的作用下裂解為由76個氨基酸組成的無活性的直線多肽和32個氨基酸組成的活性環狀多肽，釋放入血循環，分別被稱為NT-proBNP和BNP。
[0003]BNP和NT-proBNP檢測在本世紀初先后進入我國，十年來已經為各級醫院和醫師廣泛用于臨床實踐，成為心血管病尤其是心力衰竭診斷十分有用的生物標志物。我國2007年《慢性心力衰竭診斷治療指南》和2010年《急性性心力衰竭診斷治療指南》也推薦將NT-proBNP和BNP用于心衰的診斷和預后判斷。
[0004]目前臨床上用于NT-proBNP測定的方法有多種。其中，國內電化學發光法采用Roche公司的Elecsys2010電化學全自動免疫分析儀和相應試劑盒。與其它測定方法相比，其檢測線性范圍更寬，精密度更好，測定結果在各種不同的溫度下都有良好的穩定性，可以適合臨床不同的需求。缺點是試劑一般只能配合專門儀器來使用，費用較高，不利于基層醫院開展此項檢測。
[0005]免疫膠體金技術是20世紀70年代初期Faulk和Taylor始創，最初用于免疫電鏡技術。膠體金標記技術是以膠體金作為示蹤標志物或顯色劑，于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術，現在已成功用于電鏡、流式細胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領域。目前金標記技術常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗和免疫層析試驗等。免疫層析試紙條就是此技術用于體外快速診測方式的一個重要發展方向，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。近年來該技術發展迅速，已經在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中的到了廣泛應用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。免疫膠體金技術與ELISA技術同屬于免疫學診斷方法，均是依賴于抗原與抗體的特異性反應，但不需要專門的儀器設備，更適于現場及床旁快速檢測。
[0006]由于床旁檢測(Point of Care testing，P0CT)測定NT-proBNP可以方便快速地提供可靠的檢驗結果，幫助預測心衰，進而使醫生更早制訂治療策略并節省治療費用；將其作為中心實驗室的擴展，也能夠增加檢測能力并減輕實驗室檢驗人員的壓力，管理人員也能更合理地使用資源。研宄表明就診時測定NT-proBNP濃度低于300ng/L，則該患者急性心衰的可能性很小(“排除”截點)；患者年齡介于50?75歲時，測定ΝΤ-ρι.οΒΝΡ濃度高于900ng/L，則該患者急性心衰的可能很大(“診斷”截點)。如檢測值介于上述兩截點之間(“灰區”)，可能是程度較輕的急性心衰，或是非急性心衰原因所致的ΝΤ-ρι.οΒΝΡ輕增高，(如心肌缺血、房顫、肺部感染、肺癌、肺動脈高壓或肺栓塞等)，此時應結合其它檢查結果進行進一步的鑒別診斷。
[0007]目前雖然有一些試劑廠商開發出了檢測下限為10pg/mL，但是都需要配合大型儀器才能進行檢測，費時、費力且價格昂貴。且市場上專門針對300ng/L?900ng/L這一臨界范圍的快速檢測產品尚屬空白。因此急需一種能夠對血清中ΝΤ-ρι.οΒΝΡ進行半定量檢測的膠體金試紙，提供斷病依據，以幫助醫務工作人員及時準確的掌握患者病情，降低醫療風險和成本。


【發明內容】

[0008]本發明創造提供一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，能夠高效快速、并且準確半定量地對NT-proBNP進行實時檢測，具有十分重要的經濟和社會價值。
[0009]為解決上述技術問題，本發明創造采用的技術方案是，包括硝酸纖維素NC膜，在所述硝酸纖維素NC膜一端依次向上搭接有膠體金墊、樣品墊，在所述硝酸纖維素NC膜另一端向上搭接有吸水紙，所述膠體金墊上含有NT-proBNP標記抗體以及兔IgG標記抗體，所述硝酸纖維素NC膜在沿液體層析方向上依次包被有檢測線(T線)、參比線(R線)以及質控線(C線)，所述檢測線為與所述NT-proBNP標記抗體配對的NT-proBNP抗體，所述參比線為羊抗兔二抗，所述質控線為羊抗鼠二抗。
[0010]其中，所述NT-proBNP標記抗體為膠體金標記的鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，檢測線上與其配對的NT-proBNP抗體也為鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，二者分別識別NT-proBNP不同的表位，所述兔IgG標記抗體為膠體金標記的兔IgG抗體。
[0011]其中，所述膠體金的顆粒大小為15-25nm，優選為20_22nm。
[0012]其中，所述膠體金墊是將540nm處OD值為1.2-1.4的NT-proBNP標記抗體溶液以及540nm處OD值為0.8-1.0的兔IgG標記抗體溶液以體積比1: 1.2混合后，以2.5 μ I/mm的量點樣而成。
[0013]其中，所述硝酸纖維素NC膜中，檢測線由1.5mg/ml的NT-proBNP標記抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成；參比線由0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成；所述質控線由2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成。
[0014]進一步，所述檢測線(T線)、參比線(R線)以及質控線(C線)間的間隔為0.4cm;所述膠體金墊距T線間的間隔為0.2-1.0cm，優選為0.4-0.6cm。
[0015]其中，所述硝酸纖維素NC膜為孔徑8-12 μ m的多孔樣結構膜，所述樣品墊為玻璃纖維膜或無紡布，所述膠體金墊采用玻璃纖維膜，所述吸水紙為吸水濾紙，以上材料均為常用材料，可市購。
[0016]本發明創造具有的優點和積極效果是:操作方便、反應靈敏、敏感性高，便于攜帶和保存，適用于醫護人員進行實時檢測。并且，本發明通過參比線的獨立設置以及對各劃線抗體種類和含量等的精確控制，實現對NT-proBNP濃度在300ng/L?900ng/L這一區域的血清樣品進行半定量檢測，為醫護人員對心衰等相關疾病進行判斷提供有力的參考依據。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發明創造結構示意圖。
[0018]圖2是本發明創造使用結果判定示意圖。
[0019]其中:
[0020]1-樣品墊；2_膠體金墊；3_硝酸纖維素NC膜；4-T線；5_R線；6_C線-J-吸水紙。

【具體實施方式】
[0021]下面通過具體實施例對本發明創造進行進一步說明，下述詳細的實施方式和具體的操作過程僅為闡述本發明創造方案的目的，并非用于限定本發明創造。
[0022]下述實施例中，未特殊說明的材料或試劑，通常為商用可市購產品，或可經由相關醫療機構從公開的途徑獲得。下述實施例中未注明具體條件和參數的實驗方法，通常按照常規條件和參數，或按照制造廠商所建議的條件和參數。
[0023]實施例1膠體金的制備
[0024]將0.02%氯金酸溶液加熱煮沸，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ;溶液顏色由淺藍色變為深藍，繼續加入出現酒紅色，繼續煮沸1min ;出現透明的酒紅色，停止加熱，繼續攪拌至室溫，獲得粒徑在20nm左右的膠體金溶液。電鏡鏡檢，確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。
[0025]實施例2含標記抗體的膠體金墊的制備
[0026]取1.5mL試管，加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH調整為7.4 ;加入15 μ g/mL NT-proBNP標記抗體，使其達到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ;加入10 μ L的10% BSA，混勾，振蕩20min ;于離心機中8000rpm，離心20min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為1.2-1.4的膠體金免疫復合物；
[0027]另取1.5mL試管，加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH調整為9.0 ;加入10 μ g/mL兔IgG標記抗體，使其達到最小蛋白濃度，混勾，于振蕩儀上快速振蕩20min ;加入10 μ L的10% BSA,混勾，振蕩20min ;于離心機中8000rpm,離心20min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為0.8-1.0的膠體金免疫復合物；
[0028]將上述兩種膠體金免疫復合物按照體積比1: 1.2的比例混合，以2.5 μ 1/mm的量在玻璃纖維膜上點樣，形成膠體金墊，并在適宜的條件下干燥，一般為37°C干燥12小時。
[0029]實施例3硝酸纖維素NC膜的包被
[0030]采用噴膜儀，將1.5mg/ml的NT-proBNP標記抗體以0.001ml/cm均勾劃在硝酸纖維素NC膜上形成T線；將0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃在硝酸纖維素NC膜上形成R線；將2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗體以0.001ml/cm均勻劃在硝酸纖維素NC膜上形成C線，且三條線之間的間隔為0.4cm。然后放入干燥間在適宜的溫度和濕度下干燥。
[0031]實施例4檢測試紙的組裝
[0032]在條件適宜的干燥室內，將實施例2獲得的膠體金墊和實施例3獲得的包被完成的硝酸纖維素NC膜以及樣品墊和吸水紙裁剪成合適的大小，按照圖1所示的結構進行粘接，控制膠體金墊距T線間的間隔為0.4-0.6cm，該間隔可以通過控制包被NC膜的劃線位置、調整裁剪尺寸以及粘接部分大小來實現，膠體金墊與NC膜的粘接部分不小于膠體金墊的1/7，膠體金墊與樣品墊的粘接部分為膠體金墊的1/7?1/2，吸水紙與NC膜的粘接部分不小于吸水紙的1/10。上述相互粘接的各部分可預先或粘接后固定于一個承載板上，所述承載板可以為塑料板。固定完成后將其裁剪至合適的大小即可。所述檢測試紙還可以進而裝入一塑盒中，并在塑料盒上對應樣品墊和硝酸纖維素NC膜劃線部分設置開口，方便攜帶和保存。
[0033]實施例5檢測原理和方法
[0034]本發明創造中利用了免疫層析檢測法中雙抗體夾心顯色的原理，當待測血清中含有一定濃度的NT-proBNP時，將其加入樣品墊后，樣品中的液體溶解膠體金墊中鼠源NT-proBNP單克隆抗體，并且NT-proBNP與該膠體金標記的鼠源NT-proBNP單克隆抗體發生特異性結合，形成抗原-抗體-膠體金復合物，并繼續靠毛細作用向檢測線移動。當樣品到達檢測線時，上述抗原-抗體-膠體金復合物與包被在檢測線上的配對的NT-proBNP抗體進一步結合，形成抗體-抗原-抗體-膠體金雙抗體夾心復合物，并在檢測線上聚集顯色。隨著毛細作用的進一步向前，到達質控線時，由于膠體金墊中NT-proBNP單克隆抗體是鼠源性的，因此無論待測血清中是否含有ΝΤ-ρι.οΒΝΡ，均被固定于質控線的羊抗鼠二抗所捕獲并顯色，這種顯色即保證了整個反應體系是正確的。同時，本發明創造為了半定量的目的，在膠體金墊中還加入了膠體金標記的兔源IgG抗體，并在檢測線與質控線間設置能與其發生特異性反應的羊抗兔二抗參比線，無論待測血清中有無NT-proBNP，都會在經過膠體金墊時帶動兔IgG標記抗體向前涌動，并在參比線位置發生顯色反應，且其顯色水平被設置為相當于NT-proBNP濃度在900ng/L時的顯色水平，這樣，就能很方便的通過直觀的觀察來獲得待測血清中ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的濃度信息。由于兔IgG抗體具有易獲得、穩定期長、特異性好、敏感性高等優點，在發生特異性結合時能夠穩定地發揮特定濃度下的顯色水平，且不會對其他特異性反應產生干擾，因此成為本發明創造作為顯色參比物的最佳選擇。
[0035]檢測時，將提取的血清樣本平衡至室溫，在樣品墊上滴入被檢樣本，1min后觀察T線、R線、C線的顯色情況。C線顯色，T線與R線出線顏色相同，表明樣本中NT-proBNP等于900ng/L(見附圖2a) ；C線顯色，T線出線顏色弱于R線出線顏色，表明樣本中的NT-proBNP水平在300-900ng/L之間(見附圖2b) ;C線顯色，T線出線顏色強于R線出線顏色，表明樣本中的NT-proBNP大于900ng/L(見附圖2c) ;C線、R線顯色，T線不顯色，表明樣本中的NT-proBNP水平小于300ng/L(見附圖2d) ;C線或R線不顯色(見附圖2e、2f、2g)，表明實驗失敗，需重新測試。
【權利要求】
1.一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，包括硝酸纖維素NC膜，在所述硝酸纖維素NC膜一端依次向上搭接有膠體金墊、樣品墊，在所述硝酸纖維素NC膜另一端向上搭接有吸水紙，所述膠體金墊上含有NT-proBNP標記抗體以及兔IgG標記抗體，所述硝酸纖維素NC膜在沿液體層析方向上依次包被有檢測線、參比線以及質控線，所述檢測線為與所述NT-proBNP標記抗體配對的NT-proBNP抗體，所述參比線為羊抗兔二抗，所述質控線為羊抗鼠二抗。
2.根據權利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，其特征在于:所述NT-proBNP標記抗體為膠體金標記的鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，檢測線上與其配對的NT-proBNP抗體也為鼠抗人NT-proBNP單克隆抗體，二者分別識別NT-proBNP不同的表位，所述兔IgG標記抗體為膠體金標記的兔IgG抗體。
3.根據權利要求2所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，其特征在于:所述膠體金的顆粒大小為15-25nm。
4.根據權利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，其特征在于:所述膠體金墊是將540nm處OD值為1.2-1.4的NT-proBNP標記抗體溶液以及540nm處OD值為0.8-1.0的兔IgG標記抗體溶液以體積比1: 1.2混合后，以2.5 μ 1/mm的量點樣而成。
5.根據權利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，其特征在于:所述硝酸纖維素NC膜中，檢測線由1.5mg/ml的NT-pix)BNP標記抗體以0.0Olml/cm均勾劃線而成；參比線由0.8mg/ml羊抗兔多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成；所述質控線由2.0mg/ml羊抗鼠多克隆抗體以0.001ml/cm均勾劃線而成。
6.根據權利要求1所述的一種氨基末端B型利鈉肽前體免疫層析半定量檢測試紙，其特征在于:所述檢測線、參比線以及質控線間的間隔為0.4cm ;所述膠體金墊距檢測線間的間隔為 0.2-1.0cm0
【文檔編號】G01N33/68GK204188623SQ201420672841
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】岳曉燕, 魏金枝, 林濤 申請人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司