專利名稱：C型利鈉肽變體的制作方法
技術領域：
本文的領域大體而言涉及C型利鈉肽(CNP)的變體、包含CNP變體的組合物、制造 CNP變體的方法，及使用CNP變體來治療CNP反應性病癥的方法，這些病癥包括(但不限于) 骨相關病癥，諸如骨骼發育不良(例如軟骨發育不全)，及血管平滑肌病癥。
背景技術：
利鈉肽家族系由三種結構上相關的肽組成心房利鈉肽(ANP) (Genbank登錄號 NP_006163,針對ANP前驅蛋白質NPPA)、腦利鈉肽(BNP) (Genbank登錄號NP_002512，針對BNP前驅蛋白質NPPB)，及C型利鈉肽(CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun.(生物化學生物物理研究通訊)，168 =863-870 (1990) (GenBank登錄號NP_077720，針對CNP前體蛋白質 NPPC) (J. Hypertens.(高血壓雜志)，10 :907-912 (1992))。此等小型單鏈肽(ANP、BNP、 CNP)具有一個17個氨基酸的環結構(Levin等人，N. Engl. J. Med.(新英格蘭醫學雜志)， 339 :863-870(1998))且在多個生物過程中具有重要作用。ANP及BNP結合并活化利鈉肽受體A(NPR-A)(亦稱為鳥苷酸環化酶A(GC-A))，導致細胞內環單磷酸鳥苷(cGMP)含量升高。 同樣，CNP與NPR-B(GC-B)相互作用刺激cGMP的產生(J. Hypertens.(高血壓雜志)，10 1111-1114(1992))。第三類型的受體NPR-C以高親和力結合各利鈉肽且主要用以捕捉來自細胞外代謝區的肽且使這些肽沉積于溶酶體中，這些肽在此處被降解(kience (科學)， 238 :675-678 (1987))。ANP及BNP主要在心肌細胞內產生，且據信其在心血管內穩定中具有重要作用Science(科學)，252 :120-123(1991))。CNP表達更廣泛，包括表達于中樞神經系統、生殖道、骨及血管內皮中(Hypertension (高血壓)，49 =419-426 (2007)) 在人類中，CNP最初自呈126個氨基酸單鏈前原多肽形式的利鈉肽前體C(NPPC) 基因產生(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學生物物理研究通訊)168 863-870(1990))。移除信號肽得到原CNP，且通過內切蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的進一步切割產生53個氨基酸的活性肽(CNP-53)，其經分泌且經未知酶再次切割產生22個氨基酸的成熟肽(CNP-22) (ffu, J.Biol. Chem.(生物化學雜志)278 :25847-852 (2003))。 CNP-53及CNP-22在其分布方面不同，其中CNP-53在組織中居主導，而CNP-22主要見于血漿及腦脊髓液中(J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res.(受體信號轉導研究),26 269-297(2006)) ο軟骨中的主要CNP形式尚未知。CNP-53與CNP-22類似地結合于NPR-B。 此外，其均以劑量依賴性方式及類似方式誘導cGMP產生(VT Yeung, P印tides (肽)，17 : 101-106(1996))。先前已描述天然CNP基因及多肽。美國專利第5，352，770號揭示來自豬腦的在序列方面與人類CNP相同的經分離及純化的CNP-22，及其在治療心血管適應癥中的用途。美國專利第6，034，231號揭示原CNP (126個氨基酸)的人類基因及多肽，及人類CNP-53基因及多肽。細胞外間隙的CNP清除通過迅速降解CNP的膜結合中性內肽酶(NEP)的作用 (Biochem. J.(生物化學雜志)，(第一部分)83-88 (1993))，及經由結合于CNP且使CNP 沉積于溶酶體(CNP在此處降解)中的NPR-C。已顯示CNP在正常人類中具有2. 6分鐘的活體內半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內分泌代謝雜志),78 1428-35 (1994))。 CNP的低血漿濃度(J. Bone Moner. Res.，(骨礦物質研究雜志)19 (增刊1) S20 (2004))及其與NPR-B在許多組織中共表達表明CNP主要經由自分泌/旁分泌機制起作用。如上所述，CNP結合并活化利鈉肽受體B (NPR-B)(亦稱為鳥苷酸環化酶B (GC-B))， 導致細胞內環單磷酸鳥苷(cGMP)含量升高。由cGMP產生所介導的下游信號傳導會影響一系列不同生物過程，包括軟骨內骨化。因此，提高或抑制此路徑中任何組分的含量皆可能會引起骨生長異常。舉例而言，在小鼠模型中敲除CNP或NPR-B產生長骨及椎骨較短的矮化表型的動物。已鑒別出人類NPR-B中阻斷適當CNP信號傳導的突變且其導致侏儒癥(Olney等人，J.Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內分泌代謝雜志)91 (4) :1229-1232(2006) ；Bartels 等人，Am. J. Hum. Genet.(美國人類遺傳學雜志)75 27-34 (2004)) 0相反，工程改造成產生較高含量的CNP的小鼠呈現延長的長骨及椎骨。軟骨發育不全是由成纖維細胞生長因子受體3 (FGFRj)基因的常染色體顯性突變(導致軟骨形成異常)引起。FGFR-3通常對軟骨細胞生長及因此骨生長具有負調節作用。 在軟骨發育不全中，FGFR-3的突變形式具有組成型活性，其引起骨嚴重縮短。軟骨細胞增殖與分化似乎均受到干擾，導致生長板軟骨顯著較短(P. Krejci等人，J. Cell Sci.(細胞科學雜志)118 :5089-510(^200 )。軟骨內骨化為控制長骨縱向生長的過程。生長板存在四個區域靜止區、增殖區、肥大區及鈣化區。在生長板中，NPR-B由增殖細胞表達，而NPR-C 由肥大細胞表達(Yamashite等人，J. Biochem.(生物化學雜志)127 177-179 (2000))。在正常軟骨內骨生長中，軟骨細胞組織成柱狀形式且在生長板增殖區中增殖。在軟骨發育不全患者中，此等柱變得紊亂。另外，在肥大區中，細胞變大且最終凋亡(裂解)，導致骨細胞侵入及礦化。軟骨發育不全患者中肥大軟骨細胞及該區的總體大小比正常患者小得多。CNP 為軟骨細胞及骨生長的正調節劑NPR-B的促效劑。CNP/NPR-B的下游信號傳導在有絲分裂原活化蛋白激酶(MAP K)層面上抑制FGFR-3路徑。在MAP K處的抑制可促進生長板的增殖區及肥大區中軟骨細胞的增殖及分化，使得骨生長。在人類中，FGFR-3的活化突變為遺傳性侏儒癥的主要原因。具有已活化FGFR-3的小鼠充當軟骨發育不全(骨骼發育不良的最常見形式)的模型，且CNP的過度表達拯救此等動物避免矮小。因此，CNP及CNP的功能變體為治療各種骨骼發育不良的潛在治療劑。CNP的治療用途目前受限于其短血漿半衰期，該半衰期在人類中活體內顯示為 2. 6 分鐘(J Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內分泌代謝雜志)，78 :1似8_35 (1994))。為提高CNP濃度高于人類血漿中通常所見的固有含量(約5pM)，在使用全身性給予的CNP的所有人類及動物研究中，必需連續輸注。相較于野生型CNP，具有較長活體內血清半衰期且顯示類似或改良的活性的CNP變體對于可持續治療策略為重要的。人類血漿中縮短CNP半衰期的兩種機制為中性內肽酶(NEP)造成的降解及利鈉肽受體C(NPR-C)造成的清除(GrowthHorm. &IGF Res.(生長激素和IGF研究)，16 :S6_S14 (2006))。據報導，對肽進行修飾可增強對內肽酶及外肽酶裂解的抗性(Amino Acids(氨基酸)，30 :351-367(2006) ；Curr. Opin. Biotech (生物技術目前觀點).，17 =638-642 (2006))。已評估CNP的多種類似物及衍生物的生物活性。據報導，通過以S-甲基Cys取代Cp6與Cys22,肽經由Cys6-Cys22 二硫鍵的環化顯示對CNP刺激cGMP形成的活性重要 (Biochem. Biophys. Res. Comm.(生物化學生物物理研究通訊)，183 :964-969 (1992)，亦使用丙氨酸掃描以鑒別對CNP功能性重要的氨基酸)。據報導，活性的額外顯著增強是氨基酸 1^119、1^81(1及1^1111的組合存在引起的。美國專利第5，434，133號描述包含在氨基酸位置6、 7、9、11或22具有取代的CNP-22的CNP類似物，其中該氨基酸選自位置6的Cys或Pmp (五環巰基丙酸)，位置7的Phe、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4_硝基-Phe或Cha (3_環己基-Ala)， 位置9的Gly、Val、Aib或tLeu，位置11的Leu或lie，及位置22的Cys或Pmp。美國專利公開案第2004/0138134號(現為美國專利7，276，481)描述包含CNP-22 的氨基酸Cys6至Cys22的CNP變體(“CNP-17”)，其包括位置9、10、11、16、17、19或20的另一天然氨基酸的至少一個取代；具有插入及缺失的CNP變體，諸如在Cp6與Wie7之間NEP 裂解的所報導主要位點添加His殘基；及使用此等變體來增大異常骨中骨生長板的尺寸及延長異常骨的方法。然而，如根據cGMP產生所量測，此等變體的活性未得到顯著增強，且如在基于活體外細胞的方法(實施例7)中所觀測，幾乎所有變體的活性均減弱。未提供其它支持性數據，諸如提供活體外穩定性或活體內測定改良的藥物動力學(PK)來證實CNP類似物的所聲稱NEP抗性及NPR-C抗性。美國專利第6，743，425號揭示治療軟骨發育不全的物質，其活化NPR-B/GC-B且為肽或低分子量化合物，包括C型利鈉肽CNP-22及CNP-53。PCT 公開案第WO 94/205 號揭示命名為血管鈉肽(vasonatrin peptide/VNP)的CNP-22與 ANP的5氨基酸C端的嵌合體，亦即有限數目的氨基酸取代及藉由形成二硫鍵或雙鍵產生的環狀嵌合肽。改良其它利鈉肽家族成員的半衰期的方法包括降低ANP對NPR-C的親和力(美國專利第5，846，932號)、利用NPR-C的五肽拮抗劑(W0 00/6163)及共給予NEP抑制劑，諸如塞奧芬(thiorphan)與坎沙曲(candoxatril) (Clin. Exp. Pharma. Physiol. , 25 986-991 (1997)，Hyperten.，30 184-190 (1997))。WO 2004/047871 描述 BNP 及 BNP 變體與聚烷二醇部分、糖部分、聚山梨醇酯部分、聚陽離子部分及其它親水性聚合物部分的偶聯物，其據報導顯示獲改良的循環半衰期且據報導適用于治療急性充血性心臟衰竭。然而，尚無關于制造具有NEP抗性同時保留CNP功能性的CNP的成功策略的公開報導。

發明內容
本文涉及C型利鈉肽(CNP)的變體，其適用于治療骨相關病癥(例如軟骨發育不全)及血管平滑肌病癥。本公開包含血清半衰期增加(例如由于結合于中性內肽酶(NEP) 的能力降低、對NEP的蛋白水解作用的抗性較高及/或對清除利鈉肽受體C(NPR-C)的親和力降低)同時保留CNP功能性的CNP變體。下文闡述人類CNP-22的野生型序列(在本文中稱為” hCNP22，，、，，wtCNP22，， 或” CNP22”)
(N 端)Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Il e14~Gly15-Ser 16-Met 17~Serlg-GlY19-Leu20-Gly21-CyS22 (SEQ ID NO :1)。CNP22的位置6至22藉助于Cys6與Cys22之間的二硫鍵形成環狀域。已顯示17 個氨基酸的環狀結構對CNP結合于NPR-B重要GchiIler，Biochem. Biophys. Res. Commun.， (生物化學生物物理研究通訊)138 =880-886 (1986))。CNP22的位置6至22的氨基酸序列在本文中稱作” CNP17” (SEQ ID NO :2)。CNP 在許多位點易于被 NEP 裂解Cys6_Phe7、Gly8_Leu9、LyslO-LeulU Argl3-Ilel4、Serl6_Metl7及Glyl9_Leu20。在一實施例中，本公開包括一種CNP變體，其 (1)經修飾以使其總體大小或分子量增至例如以下范圍約2. 6kDa或2. SkDa至約4kDa、 4. 2kDa>4. 4kDa>4. 6kDa>4. 8kDa>5kDa>5. 2kDa>5. 4kDa>5. 6kDa>5. 8kDa>6kDa>6. 2kDa>
6.4kDa或至約7kDa、7. 2kDa或約8. 2kDa，及/或( 在某些氨基酸位置經修飾以降低其在
1、2、3、4、5或所有6個上列位點對NEP裂解的敏感性。CNP變體的大小或分子量可藉由多種方式增大，例如藉由將其它氨基酸及/或其它種類的化學(例如天然或合成聚合)基團偶聯至肽序列的例如N端、C端及/或側鏈，及/或藉由使用天然氨基酸、非天然氨基酸及/或具有較龐大側鏈的肽模擬物。視情況進一步使CNP變體偶聯偶聯至其它功能或結構部分。 視情況與本文所述的任何實施例組合，可將突變(例如取代、添加及/或缺失)引入CNP22 的某一(某些)位置以降低CNP變體對NPR-C的親和力。在不影響NEP抗性或CNP活性的情況下，可進行其它修飾，例如保守性取代，或在此項技術中已知的其它修飾。在一實施例中，CNP變體由以下通式表示(X)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Ph G7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys2 2_(z) (SEQ ID NO :5)，其中在對應于一或多個以下CNP殘基的位置Glyl、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、 Leu9、LyslO、LeulU Ilel4、Glyl5、Serl6、Metl7、Glyl9、Leu20 及 Gly21, CNP 變體包含一或多個經修飾的氨基酸，其可產生經修飾的肽鍵(例如經由使用肽鍵等構物)；及(χ)及(ζ)獨立地可不存在或可為來源于利鈉多肽(例如NPPC、ANP、BNP)或非利鈉多肽(例如人類血清白蛋白(HSA)、IgG等)的氨基酸序列。在一實施例中，CNP變體包括(1)在對應于CNP22的位置6、7或8 (Cys6、Phe7或 Gly8)的一的氨基酸位置處的修飾；(2)在位置1-5 (GlyU Leu2、Ser3、Lys4及Gly5)的任何或所有氨基酸的視情況存在的缺失、添加及/或取代；及C3)視情況至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10個在對應于位置6-22的位置處的其它修飾(缺失、添加及/或取代)，其中1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10個修飾可為保守性取代或本文所述或在此項技術中已知的其它取代。應了解，以編號提及特定氨基酸位置(例如CNP22的位置7)指任何CNP變體中對應的氨基酸位置，即使該CNP變體中的位置編號因前述插入或缺失而發生變化亦如此。舉例而言，對于前五個氨基酸已缺失的CNP變體，提及”位置7”或”Phe7”將指相應位置2。類似地，對于一個氨基酸已添加至N端的CNP變體，提及”位置7”指對應位置8。在本文所述的任何實施例中，CNP變體可通過對應于CNP22的6與22位之間的共價鍵環化。考慮使用此項技術中已知的任何方法形成共價鍵。在另一實施例中，CNP變體可經由位于肽的N端或靠近N端的氨基酸與C端或靠近C端的氨基酸(出于此目的稱為，，末端”氨基酸)之間所形成的共價鍵來環化。在一實施例中，在兩個末端氨基酸的側鏈之間或對應于CNP22的6與22的位置的氨基酸之間形成共價鍵。在另一實施例中，在一個末端氨基酸的側鏈與另一末端氨基酸的末端基團之間，或在各末端氨基酸的末端基團之間形成共價鍵。舉例而言，末端氨基酸之間或對應于CNP22的6與22的位置的氨基酸之間所形成的共價鍵可能為頭至尾鍵、側鏈至側鏈鍵、側鏈至頭鍵或側鏈至尾鍵。在一實施例中，本文提供一種對NEP的親和力降低，及/或對NEP裂解的抗性較大及/或活體內血清半衰期增加，同時保留CNP的功能性(例如刺激cGMP產生)的CNP變體。NEP由于其活性位點腔隙的尺寸有限而較佳識別小于約3kDa的底物(Oefner，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，296 :341-349(2000)) ο在一實施例中，例如藉由添加約0. 6kDa 至約5kDa的氨基酸、親水性或水溶性聚合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或碳水化合物來修飾CNP變體，以使其總分子量增至約2. 6kDa或2. 8kDa至約4,4. 6、5、5· 2,5. 8、6、6· 4 或7kDa的范圍。在特定例示性實施例中，CNP變體的分子量在約2. 6kDa與約7kDa之間， 或在約2. 8kDa與6kDa之間，或在約2. 8kDa與約5. 8kDa之間。在某些實施例中，添加至少約 0. 6、0· 8、1、1· 2、1· 4、1. 6 或 1. 8kDa，或至多 2、2· 2、2· 4、2· 6、2· 8、3、3· 2、3· 4、3· 6、3· 8、4、 4. 2,4. 4,4. 6,4. 8或5kDa，以使CNP變體的總分子量增至例如約2. 6或2. 8kDa至約4kDa、 4. 2kDa>4. 4kDa>4. 6kDa>4. 8kDa>5kDa>5. 2kDa>5. 4kDa>5. 6kDa>5. 8kDa>6kDa>6. 2kDa> 7. 2kDa、8. 2kDa或更高的范圍。在一些實施例中，此等CNP變體包含與CNP22的氨基酸6_22 至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%相同或同源的氨基酸序列。在其它實施例中，此等CNP變體包含另一天然或非天然氨基酸或肽模擬物的1、2、3、4、5、6或7個氨基酸的取代、插入或缺失。盡管預想保守性取代與非保守性取代或插入均可在任何位置進行，但可例如藉由保守性取代開始將修飾引入此項技術中已鑒定為與CNP活性或NPR-B結合有關的區域中，而非保守性取代可在先前已顯示容許修飾的那些區域中進行。在另一實施例中，CNP變體包含在Cys6與Cys22之間具有完整環化部分，且具有含有約 1-40、1-20、5-40、5-35、10-35、15-35、5-31、10-31 或 15-31 個氨基酸且為來源于 CNP 多肽及/或非CNP多肽的片段的N端尾及/或C端尾的CNP。在一實施例中，此等CNP變體的分子量在約2. 8kDa至約4,4. 6、5、5· 2,5. 8、6、6· 4或7kDa的范圍內。此等CNP變體的非限制性實施例包括野生型CNP22 ；或具有一或多個氨基酸取代(例如K4R取代)的CNP22， 其具有來源于以下的N端及/或C端延伸人類或其它物種的利鈉肽前體序列(例如ANP、 BNP或CNP)；具有氨基酸取代、添加及/或缺失的利鈉肽前體C(NPPC)變體(例如這些CNP 變體可為CNP-53的截短形式，其產生分子量在約2. SkDa與5. SkDa之間的肽)；或其它非 CNP多肽，諸如血清白蛋白或IgG蛋白(例如這些CNP變體可為含有人類或其它物種的血清白蛋白或IgG的片段的CNP嵌合體)。在一實施例中，總質量特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. SkDa 至約6kDa或7kDa)、經設計以便增強對NEP降解的抗性的CNP變體由以下通式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4 "Gly5-Cy S6-Phe7-Gl y8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :6)，其中(χ)為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團的非限制性實例為聚乙二醇(PEG，亦稱為聚環氧乙烷(ΡΕ0))，且天然聚合基團的非限制性實例為含有1至35個氨基酸且來源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的變體、ANP、BNP,或其它非CNP多肽或肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素(osteocrin)或成纖維細胞生長因子2 (FGF2)；(ζ)可不存在或可為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團的非限制性實例為PEG，且天然聚合基團的非限制性實例為來源于利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或 BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且(b)及(h)可各自獨立地在該位置是野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或經側鏈上不具有反應性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、 Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、6111、6111或％1·)置換。在一實施例中，(b)為Arg。 在另一實施例中，為了改良NEP抗性，(b)不為Gly。在又一實施例中，(h)不為Arg。來源于NPPC或其變體的氨基酸序列的非限制性實例包括Arg ；Glu-Arg ；Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 7)；Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 8)；Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO 9)；Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)；Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO: 11)；Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO: 12)；Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID N0:13)；Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID N0:14)；Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID N0:15)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO 16)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO 17)；Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO 18)；Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 19)；Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 20)；Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 21)；及Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 22)。來源于非CNP多肽(諸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性實例包括Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO 23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO 24)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 25)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 26)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO 27)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO 28)；Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO 29)；Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO 30)；Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID N0:31)；及Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :32)。在一實施例中，CNP22或其變體的N端及/或C端可獨立地偶聯偶聯于含有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個氨基酸的氨基酸延伸。在一實施例中，氨基酸延伸來源于NPPC、CNP53、ANP或BNP。在一特定實施例中，氨基酸延伸為Gln-Glu-His-Pro-Asn-A Ia-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO :33)。在一相關實施例中，將此 15 個氨基酸的延伸添加至N端以提供下式的CNP變體=Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4~G1 y5-Cy S6-Phe7-Gl Y8-Leu9- (h) 10~Leu H-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (ζ) (SEQ ID NO :34)。在一實施例中，CNP變體包含N端及/或C端偶聯與親水性聚合物(例如PEG)偶聯以使其總體分子大小增至約2. 6kDa或2. 8kDa至約4、5、6或7kDa的范圍的wtCNP22或其變體(例如具有添加、缺失及/或取代(諸如K4R取代)的變體)(SEQ ID N0:35)。此等 CNP變體視情況在N端及/或C端進一步偶聯偶聯于包含例如氨基酸、碳水化合物、疏水性酸及/或磷脂的聚合基團，該聚合基團的一非限制性實例為含有1至35個、或5至31個氨基酸的N端氨基酸延伸。在一實施例中，將至少約0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 2,1. 4、1· 6或1. 8kDa 或至多 2,2. 2,2. 4,2. 6,2. 8、3、3· 2,3. 4,3. 6,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8 或 5kDa 的親水性聚合(例如PEG)部分添加至wtCNP22或其變體的N端及/或C端。如本文中所示，約0. 6kDa或更高的親水性或水溶性PEG(或ΡΕ0)聚合物偶聯偶聯于CNP22或其變體一般會顯著增強對NEP裂解的抗性。然而，將PEG(即使小至0. 6kDa) 添加至wtCNP22可能會降低CNP功能性(例如刺激cGMP信號傳導)，且將大于約2kDa或 3kDa的PEG添加至CNP22或其變體可能會以尺寸依賴性方式降低CNP功能活性。但當使約0. 6kDa至約1. 2kDa或可能達約2kDa的PEG (或ΡΕ0)聚合物偶聯與具有N端氨基酸延伸的CNP變體偶聯時，CNP功能性得以保留(至少與wtCNP22的功能性相當)，其中至少一個在生理條件下可能帶正電荷的相對較大氨基酸(例如精氨酸)緊接于對應于CNP22的 Glyl 的位置之前，諸如 GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)、GANPR_CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、R-CNP22 (SEQ ID NO :40) 及 R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)。因此，在一實施例中，聚乙二醇化CNP變體在CNP22或其變體(例如具有K4R取代的變體)的N端包含含有至少1、2、3、4或5個氨基酸的氨基酸延伸，其中使PEG聚合物偶聯與經氨基酸延伸的CNP變體的N端偶聯以產生特征在于本文一般描述的范圍(例如約 2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa)以便增強對NEP裂解的抗性的總質量。在一實施例中，為增強CNP的功能性，此等聚乙二醇化且經氨基酸延伸的CNP變體含有至少一個緊接于對應于CNP22的Glyl的位置之前的在生理條件下可能帶正電荷的相對較大的天然或非天然氨基酸。在一特定實施例中，聚乙二醇化且經氨基酸延伸的CNP變體含有至少一個緊接于對應于CNP22的Glyl位之間的精氨酸殘基。除在N端及/或C端偶聯偶聯親水性或水溶性聚合物(諸如PEG (或ΡΕ0))的CNP 變體外，本發明亦包括在內部位點與這種偶聯聚合物偶聯的CNP變體。本文中為簡明起見， 將使用PEG(或ΡΕ0)作為親水性或水溶性聚合物的代表性實例。CNP變體可能在各種位點聚乙二醇化，包括(但不限于)(1)僅在N端聚乙二醇化；( 僅在C端聚乙二醇化；(3)僅在內部位點(例如Lys4)聚乙二醇化；(4)在N端與C端皆聚乙二醇化；(5)在N端及內部位點聚乙二醇化；及(6)在C端及內部位點聚乙二醇化。為增強對NEP降解的抗性及保留 CNP功能性，在某些實施例中，聚乙二醇化CNP變體的總質量的特征在于本文一般描述的范圍，例如在約2. 6kDa或2. 8kDa至約4、5、6或7kDa的范圍內。在一特定實施例中，CNP17、 CNP22、CNP37 (下文定義)或其變體(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的變體)僅在 N端聚乙二醇化。在另一實施例中，CNP變體僅在內部位點(例如Lys4)聚乙二醇化。在另一實施例中，CNP變體在N端及內部位點(例如Lys4)聚乙二醇化。在又一實施例中，為得到更佳功能性，CNP變體不在環狀域(對應于CNP22的Cys6至Cys22)內的位點(例如 LyslO)聚乙二醇化。為防止在內部位點聚乙二醇化，可用在側鏈上不含反應性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(諸如Gly、kr、Arg、Asn、Gln、Asp、GlU或瓜氨酸(Cit))取代Lys4及/或LyslO。在一特定實施例中，Lys4及/或LyslO經Arg置換。在另一實施例中，LyslO不經Arg置換。本文包括使用可在以下方面不同的親水性或水溶性聚合物(例如PEG分子)類型(例如均聚物或共聚物；無規共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；線性或分支；單分散或多分散)、鍵聯(例如可水解鍵或穩定鍵聯，諸如酰胺、亞胺、胺、伸烷基或酯鍵)、偶聯位點 (例如在N端及/或C端，較佳不在CNP的環化區(對應于CNP22的殘基6-22)中的任何殘基處)，及長度(例如約0. 2,0. 4或0. 6kDa至約2、3、4或5kDa)。親水性或水溶性聚合物可藉助于此項技術中已知的基于N-羥基丁二酰亞胺(NHS)或基于醛的化學或其它化學偶聯至CNP肽。此等CNP變體可使用以下產生例如wtCNP-22 (2. 2kDa)、僅保留wtCNP22 的環化區(殘基6-22)的CNP-17、在CNP22的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP變體，或具有氨基酸取代、添加及/或缺失的變體，例如GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、 GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、R-CNP22 (SEQ ID NO 40)、R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)、ER-CNP22(SEQ ID NO :38)及 ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)。在一實施例中，總質量的特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6或7kDa)的PEG-CNP變體含有經由基于NHS或基于醛的化學偶聯偶聯于N端及/或C端的單分散性線性PEG (或 ΡΕ0)基團，或經由基于NHS的化學偶聯于N端及/或C端的兩臂或三臂分支PEG基團。本文進一步包括經設計以降低腎清除率的帶負電PEG-CNP變體，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物。在一相關實施例中，本文包括PEG-CNP偶聯物，其包含基于NHS或基于醛的式 (CH2CH2O)n的PEG，其中η為12至50的整數，且PEG聚合物的分子量為至多約2. 5kDa。在一特定實施例中，η為12或M。在一實施例中，PEG聚合物的末端羥基經非反應性基團封端。在一特定實施例中，封端基團為烷基，例如低級烷基，諸如甲基。在另一實施例中，PEG聚合物或其衍生物具有約0. 4kDa至約2. 5kDa或約0. 6kDa 至約1.5kDa范圍內的聚合物數目平均分子量。
在另一實施例中，使WtCNP或CNP變體肽偶聯至包括例如二磷酸鹽、碳水化合物、 疏水性酸(包括脂肪酸)或氨基酸序列的部分。此等氨基酸序列包括例如適用于靶向骨/ 軟骨的聚Asp或聚Glu，或可來源于具有已闡明骨靶向域的骨蛋白或其衍生物，諸如骨橋蛋白(osteopontin)、骨鈣化素(osteocalcin)、涎蛋白(sialoprotein)等的融合蛋白或肽序列。在本文所述的CNP22或其變體連接至骨或軟骨靶向部分的實施例中，這種部分設計成促進經修飾的CNP肽到達骨生長板的軟骨細胞，該肽可在此處結合并活化軟骨細胞上的 NPR-B0在另一實施例中，本文提供具有不太易于被肽酶(包括NEP)切割的肽鍵的CNP變體。本文包括在內肽酶裂解位點包含至少一個經修飾殘基的CNP變體。在一實施例中，CNP 中NEP裂解位點處的Cys6-Phe7肽鍵(-C ( = 0)_ΝΗ_)可經任一以下肽鍵等構物置換-CH2-NH-,-C( = 0)-N(R)-，其中酰氨基經任何以下R基團烷基化甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S(O)n-,其中 η 為 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-，-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，及-NHC ( = 0)ΝΗ-ο在另一實施例中，Phe7經其對映異構體D-Phe取代。在另一實施例中，將D-對映異構體引入wtCNP-22內的一或多個(至多所有22個)位點。在另一實施例中，用β氨基酸(諸如3-氨基-2-苯基丙酸)取代Wie7，這在減小側鏈長度的同時增加主鏈長度。在另一實施例中，本文包括Cys6位置的Cys類似物，包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、 2-巰基丙酸及3-巰基丙酸。即使在Cys6與Wie7之間存在NEP抗性鍵，其它肽鍵(包括Gly8_Leu9、 LyslO-Leull、Argl3-Ilel4、Serl6-Metl7 及 Glyl9_Leu20)亦可能會被 NEP 水解。因此，本文包括在CNP類似物主鏈中多個位置處含有肽鍵等構物的CNP類似物。在一實施例中，CNP 類似物或變體在一個以上肽酶裂解位點處包含修飾。在另一實施例中，此變體包含在結合于NEP活性位點中重要的氨基酸殘基處具有取代從而增強對NEP降解的抗性的CNP。一或多個NEP結合殘基(包括(但不限于)6178、61715、^^18、61719及/或61721)經較大尺寸的天然或非天然氨基酸殘基置換以降低對NEP活性位點的親和力。在另一實施例中，NEP 識別所必需的一或多個疏水性殘基(包括(但不限于)？&7、1^119、1^1111、11614^討17及 Leu20)被降低NEP結合的天然或非天然氨基酸及/或肽模擬物取代。在另一實施例中，CNP 的前五個氨基酸中的一至五個可缺失或經任何其它天然氨基酸或非天然氨基酸或肽模擬物取代，或可將一或多個天然或非天然氨基酸或肽模擬物添加至CNP的前五個位置中的任一位置或所有位置。在另一實施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質量，且由下式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5_ (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10- (g) n_Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :46)，其中(χ)可不存在，或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于具有已闡明骨靶向域的骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的氨基酸序列；降低腎清除率的聚合或非聚合分子，諸如帶電PEG分子；及延伸，包含例如聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或氨基酸，且其中此等氨基酸延伸可含有例如1至31 個，或1至35個，或5至35個，或10至35個，或15至35個氨基酸殘基，且可來源于NPPC、 ANP、BNP、其它非CNP多肽或肽(諸如血清白蛋白或IgG)，或具有取代、添加及/或缺失的上述多肽的變體，或其組合；(ζ)可不存在，或可選自由以下組成的群適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu;來自骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；及來源于非CNP多肽或肽(諸如ANP或BNP)的氨基酸序列；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg ；(b)選自由Cys、及Cys6與Phe7之間的Cys和肽鍵等構物(諸如Cys-CH2-NH)組成的群；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_10環烷基、雜環基、C6_14芳基及雜芳基(實例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自Gly、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser, Thr 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、tBu-Gly、及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且
(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(homoleucine) (Hleu)、Val、叔丁 基-Ala(tBu-Ala)、Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu。在一實施例中，CNP變體在位置 6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、19 及 / 或 20 中一
或多個位置處包含修飾，且可視情況在本文所揭示的任何其它位置處具有修飾。在本文所述的CNP22或其變體可連接至疏水性酸的實施例中，CNP肽可連接至一或多個疏水性酸。疏水性酸的非限制性實例包括直鏈或支鏈、飽和或不飽和C5-C12羧酸(例如戊酸、庚酸等)及天然脂肪酸。疏水性酸可連接至一或多個氨基酸殘基的N端、C端及/ 或側鏈。在一實施例中，疏水性酸偶聯至N端。在一實施例中，CNP22或其變體與疏水性酸的偶聯經過特別設計，以促進經修飾CNP肽與血清白蛋白之間的非特異性相互作用，藉此增大CNP肽的尺寸并保護其避免被蛋白酶(諸如NEP)切割。與疏水性酸偶聯的CNP肽與白蛋白之間的相互作用的設計不能太強，以使經修飾CNP肽可擴散穿過軟骨，到達骨生長板的軟骨細胞，且結合及活化NPR-B。在另一實施例中，本文提供CNP變體，其在活體外或活體內刺激產生cGMP，其產量為相同濃度wtCNP22(例如ΙμΜ)下的cGMP產量的至少約50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % , 100%,110%,120%,130%,140%^ 150%，在位置(b)6、(。)7及/或(山8包含至少一個經修飾氨基酸，且由以下通式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c)廠(d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) n-Asp12-Ai^13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :47)，其中(χ)可不存在，或可為含有1至5個氨基酸且來源于如本文所述的利鈉多肽(例如 NPPC、CNP, ANP或BNP)或非利鈉多肽(例如HSA、IgG、骨靶向蛋白等)的肽序列；(ζ)可不存在，或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨/軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；具有骨靶向域的骨蛋白及其衍生物，諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白的融合蛋白或肽序列；降低腎清除率的分子，諸如帶電PEG ；及如本文所述增強CNP對NEP介導降解的抗性的分子；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg ；(b)可為Cys或去羧基半胱氨酸，或(b)6_(c)7肽鍵(_C( = 0)_NH_)可經任一以下肽鍵等構物置換-CH2-NH-,-C( = O)-N(R)-，其中酰氨基經任何以下R基團烷基化甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S(0)n-，其中 η 為 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-,-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,
-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，或-NHC ( = 0) NH-;(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3-氨基_2_苯基丙酸；Phe的肽鍵等構物，諸如Phe的 N-烷基化衍生物，其中N-烷基系選自由甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基及叔丁基組成的群；及Phe類似物，其中Phe類似物的苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成的群的取代基取代鹵素、羥基、氰基、直鏈或支鏈C^6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3,環烷基、C6_14芳基、 雜環基及雜芳基(實例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3_氯-苯丙氨酸、 3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置換；(d)選自Gly、i^TS-Gly(tBu-Gly)、Val、kr、Thr&Asn ；(e)選自Leu、kr、Thr、及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu ；(f)為側鏈上不具有反應性伯氨基的任何天然或非天然氨基酸或肽模擬物，包括 (但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu，其中在一實施例中，(f)不為Arg;(g)選自Leu及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、tBu-Gly 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu。在另一實施例中，本文包括CNP變體，其在活體外或活體內刺激產生在相同濃度 wtCNP22(例如 ΙμΜ)下所產生的 cGMP 量的至少約 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、 110 %、120 %、130 %、140 %或150 %，具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. SkDa至約6kDa或7kDa)的總質量以增強對NEP降解的抗性，且由以下通式表示 (χ) - (y) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Ai^13-I Ie14-Gly15-Ser16-Met17-S er18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO :48)，其中(χ)為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團的非限制性實例為聚乙二醇(PEG)，且天然聚合基團的非限制性實例為含有1至35個氨基酸且來源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的變體、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素或FGF2;(y)可不存在，或可為一或多個來自Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (對應于CNP22的位置1至幻(SEQ ID NO 1)的氨基酸及/或在一或多個這些位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)；(h)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(h)不為Arg ；且
(z)可不存在，或可為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團的非限制性實例為PEG，且天然聚合基團的非限制性實例為來源于利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP 或BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列。在一實施例中，(x)、(y)與(ζ)總共含有約10至約40個，或約15至約35個氨基酸。在另一實施例中，(X)為包含1至40個氨基酸或1至20個氨基酸的氨基酸序列。還包括在活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22 (例如1 μ Μ)下所產生的 cGMP 量的至少約 50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或 150% 且包含以下序列的CNP變體(y) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22 (SEQ ID NO :138)，其中(y)包含一或多個選自 Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (SEQ ID NO 1)的氨基酸及 / 或在一或多個該位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)，且進一步包含分子量為約0. 6kDa至約5kDa的親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，親水性或水溶性聚合物偶聯至此經氨基酸延伸的CNP變體的N端。在另一實施例中，親水性或水溶性聚合物為 PEG (或 ΡΕ0)。在另一實施例中，本文提供在活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如 ΙμΜ)下所產生的 cGMP 量的至少約 50%,60%,70%,80%,90%UOO%U10%,120%, 130%、140%或150%的CNP變體，其中這些CNP變體包含含有1至15個氨基酸的N端及/ 或C端肽延伸，且偶聯至親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，肽延伸含有5至10個氨基酸。在一特定實施例中，肽延伸含有5個氨基酸。在另一特定實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG (或ΡΕ0)。在另一實施例中，本文的CNP變體在活體外或活體內外刺激產生在相同濃度 wtCNP22 (例如 1 μ Μ)下所產生的 cGMP 量的至少約 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、 110 %、120 %、130 %、140 %或150 %，且包含至少一個來源于利鈉肽前體C (NPPC)的15個氨基酸的片段，其中該片段與含有相同數目氨基酸殘基的野生型NPPC的序列至少70%同源。在又一實施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質量以便增強NEP抗性，且由下式表示(χ) - (b) 6- (c) 7- (d) 8- (e) 9_ (f) 10- (g) n-Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-Ser16- (i) 17_Ser18-Glyi9-(J)20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :4 ，其中(χ)可不存在(亦即，以-NH2基團為N末端)，或可選自由以下組成的群來自肽 Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5(SEQ ID NO :1)的1、2、3、4或5個氨基酸的序列；適用于靶向骨 /軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp或聚Glu ；來自骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素或涎蛋白)的骨靶向域；降低腎清除率的分子，諸如親水性或水溶性聚合物，包括(但不限于)帶電PEG分子；及包含PEG、碳水化合物、疏水性酸、氨基酸或其組合的部分，其中此等部分可為氨基酸延伸，包括(但不限于)來源于NPPC或非CNP多肽或肽(諸如BNP、ANP、血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；(ζ)可不存在，或可選自由以下組成的群適用于靶向骨/軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp或聚Glu ；來源于骨靶向蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素或涎蛋白)的氨基酸序列； 及來源于如本文所述的NPPC或非CNP多肽或肽的氨基酸序列；
(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自=L-Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_10環烷基、C6_14芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自Gly、i^TS-Gly(tBu-Gly)、Val、kr、Thr&Asn ；(e)選自Leu、kr、Thr、及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、tBu-Gly 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡114卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu。在另一實施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質量以便增強NEP抗性，且其由下式表示；(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5_ (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) n-Asp12_Arg13- (h) 14-(i) 15-Ser16-(j) 17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO :50)，其中(x)及(ζ)獨立地可不存在，或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨/軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp或聚Glu ；來源于骨蛋白及其衍生物(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列；降低腎清除率的部分，包括(但不限于)親水性或水溶性聚合物，諸如帶電PEG分子；及包含例如親水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸及/或氨基酸的部分；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg ；(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位經一或多個選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_10環烷基、C6_14芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限于)酪氨酸、
263-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自:Gly、叔丁基-Gly、Thr、kr、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser、Thr 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu、Asn及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Asn 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Ile ；(i)選自Gly、Arg, Ser 及 Asn ；(j)選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及 2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(k)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Arg、Thr, Ser及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu。在另一實施例中，CNP變體可在CNP22的位置1至22中任何一或多個位置具有氨基酸取代。在一實施例中，Glyl經Arg或Glu取代。在另一實施例中，Lys4經Arg置換。 在又一實施例中，Gly5經Arg、Gln或Ser取代。在另一實施例中，Glyl5經kr、Asn、Arg 或Cit取代。在另一實施例中，61719經^^3印或Asn取代。在另一實施例中，Gly21經 kr、Ilir 或 Arg 取代。在一實施例中，CNP變體選自GLSKGC (CH2NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (使用去羧基-Cys 形成)(SEQ ID NO 56)、GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 57)、GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO : 136)、GLSKGCF-(tBuG)-LKLDRIG SMSGLGC(SEQ ID NO :58)、GLSKGC-(3_Cl_Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :137)及 GLSKGC-[NHCH2CH (Ph) CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (使用 3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO: 59)。在另一實施例中，在本文所述任何CNP變體中Cys6、Cys6位置處的去羧基-Cys或另一含巰基半胱氨酸類似物與Cys22之間存在二硫鍵。在另一實施例中，CNP變體在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸， 包括(但不限于)DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，類似物 BL) (SEQ ID NO 60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 64)；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :144)(在實例及圖中有時稱作” CNP27-HSA” 或” HSA-CNP27”)；SPKMVQGSG-CNP17_KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO 68)(具有來源于 BNP 的 N 端及C端尾的CNP17)。在另一實施例中，CNP變體在CNP22的位置4處具有K4R取代。CNP(K4R)變體的非限制性實例包括GANRRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AY) (SEQ ID NO 36)；GANPRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)；RGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ERGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 BA) (SEQ ID NO 39)；GANQQGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CH) (SEQ ID NO 69)；及GANSSGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CG) (SEQ ID NO 70)。在一實施例中，具有PEG (或ΡΕ0)部分及N端氨基酸延伸的CNP變體在緊接于對應于CNP22的Glyl位前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP變體經設計為增強對NEP降解的抗性、降低與血清白蛋白的結合且增強CNP功能活性(例如活化cGMP信號傳導)。聚乙二醇化CNP變體的非限制性實例包括 PE024-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)、PE012-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) , PE024-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO :65)、PE012-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO :65)、 PE024-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :37)、PEOl2-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :37)、PE024-GANPR-CNP22(SEQ ID NO :37)、PE012-GANPR-CNP22(SEQ ID NO: 66)、PE024-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO :64)、PE012-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、 PE024-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、 PE024-ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、PE012-ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、PE024-R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)、PE012_R_CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)、PE024_R_CNP22(SEQ ID NO :40)及 PE012-R-CNP22 (SEQ ID NO :40)，其中 PE024 為單分散性 1. 2kDa PEG 聚合物且 PEO12 為單分散性0. 6kDa PEG聚合物。在一實施例中，PEG (或ΡΕ0)聚合物連接至CNP變體的N端。其它CNP變體包括(但不限于)CNP37的衍生物，這些衍生物在弗林蛋白酶裂解位點(加下劃線)具有突變，旨在提高對弗林蛋白酶的活體內抗性，及/或在谷氨酰胺之前具有甘氨酸(加下劃線)，旨在防止形成焦谷酰胺(pyroglutamine)，這些衍生物包括(但不限于)GQEHPNARIWKGAN￡EGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物⑶)(SEQ ID NO 71) ；GQEHP NARKIGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CT) (SEQ ID NO 72) ；GQEHPNARKYKGANQQGLS KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CU) (SEQ ID NO 73) ；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGS MSGLGC (類似物 CW) (SEQ ID NO 74) ；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CN P37，類似物DB) (SEQ ID NO 75) ；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-C NP37)(SEQ ID NO :145)。
在另一實施例中，CNP變體為包含CNP22及N端肽片段的嵌合體，其包括(但不限于)GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CQ)(富含組氨酸的糖蛋白 (HRGP)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CR) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CX) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CF) (IgG1 (Fc)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CT)(人類血清白蛋白 (HSA)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 80)； GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CE) (HSA 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CZ)(骨織素”NPR C 抑制劑，，片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 82)；及GKRTGQILGSKTGPGH(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 DA) (FGF2” 肝素結合域” 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 83)。在另一實施例中，CNP變體為包含N端肽片段及CNP22 (其中精氨酸取代CNP22的 Lys4( “CNP22(K4R)”))的嵌合體，其包括(但不限于)GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CK) (IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CL) (HSA 片段-CNP22 (K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CM)(纖連蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CN)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CO)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CP)(鋅指片段-CNP22 (K4R) 嵌合體)(SEQ ID NO 89)。在另一實施例中，CNP變體為嵌合體或融合蛋白，其包含CNP肽或變體，及可切割肽或蛋白質，或肽標簽。例示性可裂解蛋白質或肽包括(但不限于)組氨酸(例如六His) 標簽；TAF12 人類轉錄因子TAF12 ；KSI 酮類固醇異構酶；MBP 麥芽糖結合蛋白；β-Gal β -半乳糖苷酶；GST 谷胱甘肽-S-轉移酶；Trx 硫氧還蛋白(thioredoxin) ；CBD 殼多糖結合域；BMPM :BMP-2突變、SUM0、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白、淀粉結合蛋白、內葡聚糖酶A的纖維素結合域、外葡聚糖酶Cex的纖維素結合域、生物素結合域、recA、Flag、 c-Myc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體表位及其片段。在另一實施例中，CNP變體可為單體或二聚體。在一相關實施例中，二聚CNP變體的單體可經由接頭或不經接頭使N端連接至N端，經由接頭或不經接頭使N端連接至C端， 或經由接頭或不經接頭使C端連接至C端。包含IgG片段及CNP22或其變體的嵌合體設計成尤其增強對NEP降解的抗性且降低與血清白蛋白的結合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合體設計成尤其降低免疫原性且降低與血清白蛋白的結合。在N端含有富含組氨酸、無賴氨酸、無精氨酸的陽離子性序列的 HRGP-CNP22及HRGP-CNP22 (K4R)嵌合體經設計為尤其增強對蛋白酶的穩定性。含有骨織素片段的嵌合體經設計以在骨生長板處在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)裂解后釋放骨織素片段，其中該片段將抑制清除受體NPR-C。關于包含FGF2肝素結合片段的嵌合體，結合于片段的肝素經設計以保護嵌合體避免降解，藉此提供較長血清半衰期。含有纖連蛋白、纖維蛋白原或鋅指片段的嵌合體系設計為降低與血清白蛋白的結合，以及其它有利特征。不希望受理論束縛，與wtCNP22相比對NEP降解的抗性增強且具有類似或改良的功能性(例如結合于NPR-B及刺激cGMP信號傳導)的分子量為約2. 6kDa或2. 8kDa至約 6kDa或7kDa的CNP變體若不緊密結合于血漿蛋白(諸如血清白蛋白)，則可能更有效。不緊密結合于血漿蛋白(例如血清白蛋白)的CNP變體可更有效地擴散穿過軟骨，到達骨生長板的軟骨細胞，且結合并活化NPR-B以進行cGMP信號傳導。在一實施例中，經設計為降低與血漿蛋白(例如血清白蛋白)的結合的CNP變體為包含CNP22或其變體及來自IgG的肽片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為降低與血漿蛋白的結合的CNP變體為包含CNP22 或CNP22(K4R)及來自多肽(例如IgG、HSA、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽等)的片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為降低與血漿蛋白的結合的CNP變體包含CNP22或其變體偶聯至親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG (或ΡΕ0)。 在另一實施例中，親水性或水溶性聚合物(例如PEG)經在生理條件下賦予聚合物負電荷的一或多個官能基(諸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其組合)官能化。在本文所揭示的任何實施例中，CNP變體可具有與野生型CNP22實質上相同或比其更佳的生物活性。舉例而言，CNP變體例如就與NPR-B (GC-B)相互作用以刺激產生cGMP 而言，可保留野生型CNP22活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高于CNP22的活性。或者或另外，CNP變體就調節軟骨內骨生長及軟骨細胞活性而言，可保留野生型CNP22活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高于0呢22 的活性，包括(但不限于)軟骨細胞增殖、軟骨細胞分化、有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶 /MEK(Raf-I)激酶信號傳導路徑的抑制，及促進軟骨內骨化。在本文所述的任何實施例中， CNP變體可包含與野生型CNP22的氨基酸6-22或1_22至少40 %、50%、60 %、70 %、80%、 90 %、95 %或更高相同或同源的氨基酸序列。在另一實施例中，本文提供對NPR-C清除受體具有較小親和力，同時保留結合及活化NPR-B的能力的CNP22變體。本文包括自或可自如實施方式中所述基于同源性的 NPR-B/CNP復合物結構模型產生的變體。在另一實施例中，CNP變體在位置1、5、8、15、19及 21的一或多個Gly位點處具有取代以降低構型柔性，此可增強其結合于NPR-B超過NPR-C 的特異性。對NPR-C的親和力可能降低的CNP變體包括(但不限于)具有一或多個以下取代的變體G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、KlOCit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、 L20S、G21S、G21T 及 G21R。在另一實施例中，CNP變體在位置5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20及21中一或多
個位置處具有修飾及/或取代，且視情況可在本文所揭示的任何其它位置具有修飾及/或取代。在另一實施例中，CNP變體可視情況例如在N端及/或C端具有偶聯或延伸以有助于靶向骨/軟骨、降低腎清除率及/或增強對NEP降解的抗性。此(等)偶聯或延伸可包含由以下形成或來源于以下的分子或序列例如，聚Asp、聚Glu、骨或軟骨靶向肽、骨橋蛋白、 骨鈣化素、涎蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP多肽或肽，或其組合。在又一實施例中，CNP變體是藉由標準固相肽合成法，用適當時經取代及/或添加的天然或非天然氨基酸或肽模擬物來制備。在另一實施例中，CNP變體是通過重組合成方法，例如經由含有標簽或載體蛋白的融合蛋白來產生，其中使用標簽或載體蛋白有助于例如檢測、分離及/或純化融合蛋白，且使標簽或載體蛋白自融合蛋白選擇性化學裂解或蛋白水解裂解提供目標CNP變體。在另一實施例中，CNP變體的聚乙二醇化在化學或生物合成之后或作為化學或生物合成的部分進行，其中偶聯反應利用基于NHS或基于醛的化學或此項技術中已知的其它化學來進行。在另一實施例中，CNP變體包含二硫鍵。在一相關實施例中，二硫鍵形成環狀肽。在另一實施例中，在對應于CNP22的位置6與22的位置的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。還包括CNP變體可偶聯至疏水性聚合或非聚合部分，諸如庚酸、戊酸或脂肪酸。疏水部分可偶聯至氨基酸殘基(包括(但不限于)賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸)的側鏈，或可連接至CNP變體的N端及/或C端。在一實施例中，如本文所述的CNP變體具有在約8至約10. 5或約8. 5至約10范圍內的Pi值。在另一實施例中，本文提供一種醫藥組合物，其包含CNP變體、視情況選用的另一生物活性劑，及視情況選用的醫藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。在一些實施例中， 這些組合物為適于非經腸注射的無菌醫藥組合物。在一些實施例中，組合物包含實質上純 (例如至少約90%或95%純)的CNP變體。在一些實施例中，這些組合物含有少于約5%、 4%、3%、2(%、1(%或0.5(%的污染物，諸如其它人類蛋白質、豬蛋白質，或0呢53或其片段 (除所需CNP變體的外)。在某些實施例中，給予個體該無菌組合物以供治療或預防本文所揭示的任何CNP反應性病狀或病癥。本文的CNP變體宜保留CNP活性且顯示增加的血清半衰期。保留CNP活性可顯示為例如保留所需活體內生物作用，或保留在相同濃度(例如Ιμπι CNP肽或高于ED80)下 CNP22的cGMP刺激活性的至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少約100%。在一些實施例中，CNP變體顯示相較于CNP22血清半衰期增至至少約1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5 倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。在一相關實施例中，本文所述的CNP變體與野生型CNP22相比具有增強的NEP抗性且顯示增加的半衰期。在一實施例中，與野生型CNP22相比，CNP變體的半衰期增加約 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或約 100%。在某些實施例中，本文所述的CNP變體增加活體外cGMP產生、增加活體內cGMP產
31生、活體內增加一或多種與軟骨或骨形成或生長相關的生物標記的含量、增強對活體外NEP 裂解的抗性、增加血漿或血清活體內半衰期、增強活體內生物可用性，或增加活體內特定骨的長度，或實現此等增加(增強)的組合，與野生型CNP22相比，增至約1.5倍、約2倍、約 2. 5倍、約3倍、約3. 5倍、約4倍、約4. 5倍或約5倍或更多倍。在另一實施例中，本文提供治療CNP反應性病狀或病癥的方法，其包含給予有需要的個體治療有效量的CNP變體或包含其的組合物。在一實施例中，CNP反應性病癥為骨生長病癥，包括(但不限于)骨骼發育不良及遺傳性骨骼畸形，諸如與成纖維細胞生長因子受體3(FGFR-;3)突變相關的病癥。在一特定實施例中，與FGFR-3突變相關的病癥為軟骨發育不全。在另一實施例中，CNP反應性病癥為與血管平滑肌細胞及組織相關的病癥。在另一實施例中，CNP變體適用于增大骨(例如肢骨)的生長板的尺寸。在另一實施例中，CNP 變體適用于使骨延長或增強長骨生長。在又一實施例中，CNP變體適用于增強軟骨細胞的基質產生、增殖及分化。在某些實施例中，以約5nmol/kg 或 10nmol/kg 至約 300nmol/kg，或約 20nmol/kg 至約200nmol/kg范圍內的劑量給予本文所述的CNP變體。在一些實施例中，以約5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、210、 220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750 或 2000nmOl/kg的劑量或治療醫師認為適當的其它劑量給予CNP變體。在其它實施例中，以約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750 或 800μ g/kg，或約 lmg/kgU. 25mg/kg、 1. 5mg/kg、2mg/kg的劑量或治療醫師認為適當的其它劑量給予CNP變體。本文所述的CNP 變體的劑量可根據本文所述的給藥頻率/給藥頻率來給予，這些頻率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。在另一實施例中，以單次治療或多次劑量形式給予CNP變體。多次劑量可在療程內每日給予，或分多次劑量給予。在某些實施例中，包括以如下頻率給予CNP變體單次劑量或多次劑量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每兩周、每3周、每月、每 6周、每2個月、每3個月，或治療醫師認為適當的頻率。在某些實施例中，調節CNP變體的給予以留出生長期(例如軟骨生成)，接著為恢復期(例如骨生成)。舉例而言，可皮下、靜脈內，或藉由另一模式每日或每周多次給予 CNP變體持續一段時間，接著為無治療時期，接著重復該循環。在一些實施例中，初始治療期(例如每日或每周多次給予CNP變體)持續3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8 周、9周、10周、11周或12周。在一相關實施例中，無治療時期持續3日、1周、2周、3周或4 周。在某些實施例中，CNP變體的給藥療程為每日給藥持續3日，接著3日不給藥；或每日或每周多次給藥持續1周，接著3日或1周不給藥；或每日或每周多次給藥持續2周，接著 1或2周不給藥；或每日或每周多次給藥持續3周，接著1、2或3周不給藥；或每日或每周多次給藥持續4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接著1、2、3或4周不給藥。在其它實施例中，本文提供一種治療CNP反應性病狀或病癥的方法，其包含給予個體CNP肽或變體，及監測個體中(例如來自個體的生物樣品中)至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量，其中骨或軟骨相關生物標記的含量增加或降低表明CNP肽或變體對該個體具有治療作用。在一些實施例中，當生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加時，該生物標記含量的增加表明CNP肽或變體對該個體具有治療作用。在其它實施例中，當生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低時，該生物標記含量的降低表明CNP肽或變體對該個體具有治療作用。在其它實施例中，治療方法進一步包含調節給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率，其中(i)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加的情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量低于目標含量，則增加給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率；或(ii)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加的情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量高于目標含量，則降低給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率；或(iii)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低的情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量高于目標含量，則增加給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率；或(iv)在生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低的情況下，若至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量低于目標含量，則降低給予CNP肽或變體的量(或劑量)或頻率。預期生物標記的目標含量指與個體中治療作用及/或在緩解或改善病癥或病狀的癥狀方面的有益作用相關的生物標記的含量或含量范圍。在某些實施例中，高于或低于目標含量的生物標記含量可能對個體有害。在其它實施例中，本文包括一種評估給予CNP肽或變體對骨或軟骨形成或生長的影響的方法。在一實施例中，該方法提供分析或量測已給予CNP肽或變體的個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量以評估CNP肽或變體在活體內對骨及軟骨形成及生長的影響。在一相關實施例中，至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量增加可表明給予CNP肽或變體對骨或軟骨形成或生長具有積極影響且為適用于與CNP活性降低相關的骨骼發育不良及其它骨或軟骨相關疾病或病癥的治療。例示性骨或軟骨相關生物標記包括(但不限于)CNP (例如內源性含量的CNP-22或CNP-53)、cGMP、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、 I型原膠原的前肽(PINP)及其片段、I型膠原蛋白及其片段、II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素(aggrecan chondroitin sulfate) 及堿性磷酸酶。在其它實施例中，本文包括一種評估CNP肽或變體對個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量的影響的方法，其包含分析或量測來自已給予CNP肽或變體的個體的生物樣品中骨或軟骨相關生物標記的含量。在一些實施例中，該方法進一步包含給予個體CNP 肽或變體，隨后分析或量測骨或軟骨相關生物標記的含量。在某些實施例中，至少一種骨或軟骨相關生物標記選自CNP (例如內源性含量的 CNP-22或CNP-53)、cGMP、II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、I型原膠原的前肽(PINP)及其片段、I型膠原蛋白及其片段、 聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。在與骨或軟骨相關生物標記有關的方法(例如治療方法、診斷方法及分析方法)的一些實施例中，CNP肽或變體為CNP-22、CNP-53,或本文所述的任何CNP肽及變體。在此等方法的某些實施例中，CNP肽或變體不是CNP-22或CNP-53。在其它實施例中，本文提供一種重組產生CNP變體的方法，其包含將包含編碼CNP 變體肽的多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質的多核苷酸的宿主細胞在培養基中在使得由這些多核苷酸編碼的融合多肽得以表達的條件下培養。在一相關實施例中，宿主細胞經包含編碼CNP變體肽的多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質的多核苷酸的表達載體轉化。在一實施例中，載體為質粒。在又一實施例中，質粒選自pET-21a、pjexpress、 pET-31b、pET-15b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pQE-30、pET-SUMO、pET_22b 及 pTYBll。在某些實施例中，可切割肽或蛋白質包含選自由以下組成的群的多肽組氨酸標簽、人類轉錄因子TAF12、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結合域，及ΒΜΡ-2突變，或其片段。在一相關實施例中，可切割肽或蛋白質由切割劑切割。在一些實施例中，切割劑選自甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質自切割(protein self cleavage)、因子)(a、 腸激酶、ftx)TEV及SUMO蛋白酶。其它例示性切割劑包括(但不限于)鈀、梭菌蛋白酶 (clostripain)、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸肽酶、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、枯草桿菌蛋白(subtilisin)、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶(furilisin)、IgA蛋白酶、人類I^ce蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(rerminM凝乳酶(chymosin))、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶(calpain)、木瓜凝乳酶(chymopapain)、無花果酶(ficin) (無花果蛋白酶(ficain))、菠蘿酶(bromelain)(菠蘿蛋白酶(bromelase))、組織蛋白酶B(cath印isin B)、卡斯蛋白酶(caspase)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、內切蛋白酶 Arg-C、內切蛋白酶Glu-C、內切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素(kallikrein)及纖維蛋白溶酶。在某些實施例中，融合多肽表達為可溶蛋白質或包涵體。在一相關實施例中，本文包括自宿主細胞或培養基分離所表達的融合多肽。在另一實施例中，使經分離的融合多肽與如本文所述的切割劑接觸。在一實施例中，本文提供一種包含表達載體的細菌宿主細胞，該載體包含編碼CNP 變體肽的多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質的多核苷酸。在一些實施例中，可切割肽或蛋白質選自組氨酸標簽、人類轉錄因子TAF12、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、 β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結合域，及ΒΜΡ-2突變，或其片段。在另一實施例中，宿主細胞為細菌，諸如大腸桿菌(E. coli)。在一相關實施例中， 大腸桿菌細胞選自BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS、BL21 (DE3) pGro7、ArcticExpress (DE3)、 C41 [亦稱作 C41 (DE3) ]、C43 [亦稱作 C43 (DE3) ]、Origami B (DE3)、Origami B (DE3) pLysS、 KRX及Timer(DE;3)。在另一實施例中，宿主細胞包含如上所述的載體。在一些實施例中，宿主細胞在細胞培養的前經載體轉化。在某些實施例中，包括在培養基中在適于表達由多核苷酸編碼的融合多肽的條件下培養宿主細胞。在一實施例中，融合多肽表達為可溶蛋白質或包涵體。在一相關實施例中，自宿主細胞或培養基分離所表達的融合多肽。在又一實施例中，使經分離的融合多肽與如本文所述的切割劑接觸。


圖1展示大腸桿菌中CNP融合蛋白的表達(圖IA 考馬斯藍染色，圖1B:蛋白質印跡分析)。M 蛋白質標記；T 總細胞溶胞物；S:可溶上清液；P :2yg CNP22 ；KSI KSI-CNP (M/N)融合蛋白表達(不可溶)；N:未誘導的KSI-CNP融合蛋白總溶胞物；KSI ’ KSI-P-CNP融合蛋白表達(不可溶)；Trx =Trx-P-CNP融合蛋白表達(可溶)；MBP MBP-P-CNP融合蛋白表達(可溶)；TAF =TAF-P-CNP融合蛋白表達(不可溶)(BL21) ；TAF’ TAF-P-CNP融合蛋白表達(不可溶)BL21 (DE3)，其中CNP為Gly_CNP37 ；圖2展示TAF-CNP包涵體的甲酸裂解。M 蛋白質標記；1 :Gly_CNP37陽性對照；2 未裂解的TAF-CNP包涵體；3 甲酸裂解的TAF-CNP包涵體，其中CNP為Gly_CNP37 ；圖3A-E描繪大腸桿菌中CNP融合蛋白的表達。M 蛋白質標記；Tu 未經誘導的總細胞溶胞物；Su 未經誘導的可溶上清液；T 誘導的總細胞溶胞物；S 可溶上清液；Cl CNP22 ；C :Gly-wtCNP37 ( “CNP38”)；P 不可溶沉淀。A :KSI :KSI_CNP38 (M/N)融合蛋白表達(不可溶)；KSI，:KSI-Pro-CNP38 (Pro_Gly-wtCNP37 指定為” Pro_CNP38 ”)融合蛋白表達(不可溶)；Trx :Trx-Pro-CNP38融合體表達(可溶)；MBP :MBP-Pro-CNP38融合蛋白表達(可溶)；TAF:來自BL21細胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表達(不可溶)；TAF’ 來自BL21 (DE3)細胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表達(不可溶)。B :TAF-Pro_CNP37及 BMP-Pro-CNP37融合蛋白表達。C :BMP-Pro_CNP38融合蛋白及BMP蛋白質表達。D TAF-Pr o-HSA-CNP ( "Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO :188)指定為”Pro-HSA-CNP，，)融合蛋白表達。E :TAF-Pro-CNP38融合蛋白及TAF蛋白質表達； 圖4A-C描繪TAF-Pro-CNP38包涵體的甲酸切割。A :TAF-Pro_CNP38包涵體的50 % 甲酸切割。M 蛋白質標記；U 未切割的TAF-Pro-CNP38包涵體；25 °C、37 °C、42 °C、55 °C TAF-Pro-CNP38包涵體在50%甲酸中在25°C、37°C、42°C或55°C下切割24小時。37°C -S及 55°C -S 來自37°C及55°C下的切割反應、以ION NaOH中和且在14，OOOrpm下離心15分鐘的可溶上清液。B :TAF-Pro-CNP38包涵體的10%及2%甲酸切割。M 蛋白質標記；U 未切割的TAF-Pro-CNP38包涵體；C 甲酸切割的TAF-Pro_CNP38 ；S 無中和下在14，OOOrpm下離心5分鐘后的可溶上清液；P 無中和下在14，OOOrpm下離心5分鐘后的不可溶沉淀；C 來自TAF-Pro-CNP38包涵體的2%及10%甲酸切割產物的LC/MS分析；圖5A-C描繪在不同溫度及甲酸切割時間下TAF-Pro_CNP38包涵體的甲酸切割。M 蛋白質標記；C :Gly-wtCNP37(‘‘CNP38”)陽性對照；U 未切割的TAF_Pro_CNP38包涵體。A 在 42°C、55°C或 70°C下以 2% 甲酸切割 6、24 或 48 小時的 TAF_Pro_CNP38。B 在 55°C、60°C、 65°C或 70°C下以 2% 甲酸切割 17 或 24 小時的 TAF-Pro_CNP38。C 來自 TAF-Pro_CNP38 包涵體的2%甲酸切割產物的LC/MS分析；圖6為TAF-CNP34融合蛋白表達的SDS-PAGE(考馬斯藍染色)。M 蛋白質標記； C 對照Wly-CNP37(“CNP38”)] ；T 總細胞溶胞物；S 上清液；TI 經誘導的總細胞溶胞物； SI 經誘導上清液；圖 7 為融合蛋白 TAF-NL- (C/A 及 6D/6E) _Pro_CNP38、TAF (C/A 及10D/10E)-Pro-CNP38 及 TAF_Pro_CNP53 表達的 SDS-PAGE(考馬斯藍染色)，其中” Pro-CNP38”表示 Pro-Gly-CNP37。Μ:蛋白質標記；C 對照[Gly-CNP37 ( “CNP38，，)] ；T 總細胞溶胞物；TI 經誘導的總細胞溶胞物；S 上清液；SI 經誘導上清液；圖8為融合蛋白TAF-CNP34及TAF_Pro_CNP53的甲酸切割產物的SDS-PAGE (考馬斯藍染色)。M 蛋白質標記；P:陽性對照[Gly-CNP37(“CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；圖9為展示TAF-CNP3甲酸切割后CNP-34的峰的LC/MS層析圖；圖10為展示TAF-Pro-CNP53甲酸切割后Pro_CNP53的峰的LC/MS層析圖；圖 11 為融合蛋白 TAF (C/A 及 4D/4E) -Pro-CNP38 及 TAF (4D/4E) -Pro-CNP38 表達的SDS-PAGE (考馬斯藍染色)，其中” ft~o-CNP38”表示Pro_Gly-CNP37。M 蛋白質標記；C 對照[Gly-CNP37( “CNP38”)] ；T 總細胞溶胞物；TI 經誘導的總細胞溶胞物；S 上清液； SI 經誘導上清液；圖 12 為融合蛋白 TAF (4D/4E) -Pro_CNP38 及 TAF (C/A 及 4D/4E) -Pro_CNP38 的甲酸切割產物的SDS-PAGE (考馬斯藍染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro_Gly-CNP37。M :蛋白質標記；P 陽性對照[Gly-CNP37( “CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；圖 13 為融合蛋白 TAF-NL-(C/A 及 6D/6E)-Pro_CNP38 及 TAF (C/A 及 10D/10E) -Pro-CNP38的甲酸切割產物的SDS-PAGE (考馬斯藍染色)，其中” Pro-CNP38"表示 ftx)-Gly-CNP37。M 蛋白質標記；P 陽性對照[Gly_CNP37 ( “CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀； 圖14為在BL21 (DE3)細胞的IOL發酵物中產生的TAF-Pro_CNP38融合蛋白的使用抗CNP抗體的蛋白質印跡分析，其中在OD6tltl = 64時及第17小時誘導這些細胞且” Pro-CNP38” 表示 Pro_Gly-CNP37 ；圖15為來自較粗Pro-Gly_CNP37 ( "Pro-CNP38")產物的SP-瓊脂糖陽離子交換管柱層析的洗脫級分的SDS-PAGE(考馬斯藍染色)。A 水中的TAF-Pro-CNP38包涵體 (IB) ；B :甲酸鹽中的IB ；C :甲酸鹽中的IB，經中和；D 中和的沉淀；E 中和的上清液；F TMAE Hi-CAP負載；G 流經的TMAE Hi-CAP/SP-瓊脂糖負載；H 流經的SP-瓊脂糖；SP-瓊脂糖洗脫級分1-47 10微升/泳道；圖16展示N端聚乙二醇化CNP22偶聯物在活體外對中性內肽酶(NEP)的抗性程度；圖17描繪在N端具有氨基酸延伸的CNP變體[“CNP27”為GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)]的NEP抗性程度；圖 18 說明 N 端聚乙二醇化 CNP17 及 GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27”) (SEQ ID NO 36)的NEP抗性程度；圖 19 說明 wtCNP22 及 CNP 變體 Gly_CNP37、GHKSEVAHRFK_wtCNP27 (圖中的” CNP27-HSA”)(SEQ ID NO :144)及 PE012-GANRR-CNP22 (K4R)(圖中的” CNP27-PE012”) (SEQ ID NO 36)的 NEP 抗性程度；圖20展示具有N端氨基酸延伸的CNP變體在NIH3T3細胞中活體外刺激cGMP 產生的能力。這些結果是相對于在ΙμΜ CNP22存在下產生的cGMP含量。”CNP27”為GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO 36)；圖 21 展示 N 端聚乙二醇化 CNP17 及 GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27”) (SEQ ID NO 36)在NIH3T3細胞中刺激cGMP產生的能力；圖22說明CNP22的N端聚乙二醇化對cGMP產生的影響；圖 23 說明 NIH3T3 細胞中由 wtCNP22 及 CNP 變體 Gly_CNP37、 GHKSEVAHRFK-wtCNP27 ( "CNP27-HSA" ) (SEQ ID NO : 1 44)、wtCNP29 及 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27-PE012，，)(SEQ ID NO :36)誘導的 cGMP 產生；圖24A及B展示在活體外信號傳導競爭分析法中，CNP-22及 Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")經由NPR-B、以類似劑量-反應曲線、且以比經由NPR-A高得多的程度刺激cGMP產生，且顯示NPR-B相對于NPR-C選擇性的類似概況；圖25顯示每日一次1小時或每日一次2小時將大鼠軟骨肉瘤細胞暴露于CNP22在逆轉FGF2誘導的軟骨細胞生長停滯方面與連續暴露于CNP22具有實質上類似的有效性；圖^A及B展示來自對CNP22對FGF2停滯的大鼠軟骨肉瘤(RCS)細胞的影響進行的劑量反應研究的結果；圖27A-D展示將CNP22添加至藉由FGF2停滯的RCS細胞中增加基質合成且部分抑制FGF2，如由35S-硫酸鹽及3H-Pro并入基質中或在基質中減少所評估。A及C圖，合成；B及 D圖，降解；A及B圖,3 量測；C及D圖，3H量測。統計學上顯著的差異經突出顯示(AN0VA ； *p < 0. 05，**p < 0. 01)；圖28A-C展示以FGF2及CNP22培養的RCS細胞中聚集蛋白聚糖及纖連蛋白產生的程度(mRNA，圖A及C，及蛋白質，圖B)；圖 29 展示 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R)(圖中的” CNP27-PE024，，) (SEQ ID NO 36)在離體小鼠器官模型中刺激野生型股骨的縱向生長的功效；圖 30 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡野生型小鼠脛骨的縱向骨生長。相對于處理前(第0日)的量測值校正結果。 數據以平均值士 SEM (n = 8)的形式表示；圖 31 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡軟骨發育不全FGFR3aeh小鼠脛骨的縱向骨生長。相對于處理前(第0日)的量測值校正結果。數據以平均值士 SEM (n = 7-8)的形式表示；圖 32 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡野生型小鼠股骨的縱向骨生長。相對于處理前(第0日)的量測值校正結果。 數據以平均值士 SEM (n = 8)的形式表示；圖 33 展示每兩日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的2-3日齡FGFR3aeh小鼠股骨的縱向骨生長。相對于處理前(第0日)的量測值校正結果。數據以平均值士 SEM (n = 3-7)的形式表示；圖34Α-Ι描繪每兩日離體處理的FGFR3aeh小鼠股骨中的CNP37生物分布。圖A-C 說明股骨遠端中的分布，圖D-F說明關節軟骨細胞中的分布且圖G-I說明肥大軟骨細胞中的分布；圖35A-C描繪在每兩日以CNP22或CNP37處理野生型及FGFR3aeh小鼠股骨持續8 日之后生長板中增殖柱的細胞結構。㈧無處理，⑶處理后每柱的細胞數，(C)處理后的形態學研究。圖35C(i)至C(Vi)中的圖對應于圖35B中所述的樣品順序。數據以平均值士 SEM (n = 4-8)的形式表示；圖36A-C描繪在每兩日以CNP22或CNP37離體處理野生型及FGFR3aeh小鼠股骨持續8日之后的軟骨細胞肥大。(A)無處理，(B)處理后的細胞尺寸，(C)處理后的形態學研究。圖36C(i)至C(vi)中的圖對應于圖36B中所述的樣品順序。數據以平均值士SEM(n =4-9)的形式表示；圖37A-I描繪經活體內處理的FGFR3aeh小鼠脛骨中的CNP37生物分布。圖A-C展示股骨遠端中的分布，圖D-F說明關節軟骨細胞中的分布且圖G-I說明肥大軟骨細胞中的分布；圖38A-C說明CNP37對FGFR3aeh小鼠脛骨生長板的活體內作用㈧總生長板厚度，(B)增殖區厚度，及(C)肥大區厚度。數據以平均值士SEM(n = 7-15)的形式表示；圖 39 展示來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27-PE024，，) (SEQ ID NO 36)離體處理的野生型小鼠股骨的條件培養基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖 40 展示來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)離體處理的FGFR3aeh小鼠股骨的條件培養基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖 41 描繪來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)離體處理的野生型小鼠脛骨的條件培養基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖 42 展示來自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)離體處理的FGFR3aeh小鼠脛骨的條件培養基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；圖43顯示使野生型及FGFR3aeh小鼠股骨離體暴露于CNP22、CNP37或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)使條件培養基中切割的第II型膠原蛋白的含量增加(P < 0. 05)；圖44描繪自野生型小鼠及FGFR3Y367G小鼠(嚴重軟骨發育不全的小鼠模型)分離且以載體或ΙμΜ Pro-Gly-CNP37 ( "ProCNP38 ”)離體處理6日的股骨肥大區，表明 Pro-Gly-CNP37處理使得生長板中的骨生長及擴展增強；圖 45 展示靜脈內(i. v.)給予大鼠的 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在血漿中具有比CNP22長得多的半衰期及高得多的生物可用性；圖 46 說明皮下(s. c.)給予大鼠的 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在血漿中亦具有比CNP22長得多的半衰期及高得多的生物可用性；圖 47 顯示靜脈內給予的 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在大鼠中刺激比CNP22高得多的cGMP產生量；圖 48 展示皮下給予的 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)及(以較低程度)CNP37實質上比CNP22更有效地在大鼠中刺激cGMP產生；圖 49 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的野生型小鼠的體重量測值；圖 50 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的野生型小鼠的尾長量測值；圖 51 說明以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 FGFR3adl小鼠對身長的影響(ρ = 0.02，單尾t-檢驗，不等變異)；
38
圖 52 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對 FGFR3ach 小鼠尾長的影響；圖 53A 及 B 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對 FGFR3aeh小鼠的遠程長骨(A，尺骨；B，脛骨)長度的影響(ρ < 0. 01，單尾t_檢驗，不等變異)；圖 54A 及 B 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對 FGFR3aeh小鼠的近端骨(A，肱骨；B，股骨)長度的影響(ρ < 0. 01，單尾t_檢驗，不等變異)；圖55說明給予CNP37矯正近端肢骨短小(近端肢長不成比例)，如由在FGFR3aeh 小鼠中觀察到的股骨脛骨比率所評估(P < 0.01，單尾t-檢驗，不等變異)；圖 56 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對 FGFR3ach 小鼠頭長的影響(P <0.01，單尾t-檢驗，不等變異)；圖57展示以CNP37處理FGFR3aeh小鼠使外耳道(EAM)尺寸增加(P = 0. 03，單尾 t-檢驗，不等變異)；圖 58 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)對軟骨發育不全小鼠的脊椎長度的影響，其表達為椎骨體(例如腰椎5)延伸；圖 59 展示以 CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 FGFR3ach 小鼠使得給藥后15分鐘cGMP血漿含量增加；圖 60 說明以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 5 周
的FGFR3aeh小鼠中切割的第II型膠原蛋白的血清含量；圖 61 展示以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 5 周
的FGFR3aeh小鼠中骨鈣化素的血清含量；圖 62 展示來自以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理的野生型小鼠的給藥后15分鐘的cGMP血漿含量(ρ < 0. 05)；圖 63 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)處理 5 周的野生型小鼠中切割的第II型膠原蛋白的血清含量；圖64-66展示在給予野生型小鼠載體或20nmol/kg或70nmol/kg Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")之后cGMP、切割的第II型膠原蛋白及堿性磷酸酶的含量；圖67及68描繪在依據不同給藥療程給予載體或Pro_Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38") 之后，切割的第II型膠原蛋白及總堿性磷酸酶含量；圖69說明在兩個個別研究(Si及S2)中在第37日相對于第1日，經 Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")及載體處理的動物的身長的相對增加；圖70A及B展示在給予Pro-Gly_CNP37 (“ft~0-CNP38”)之后骨密度(A)及骨礦質含量⑶的變化；圖71展示第36日在最后一次皮下給予CNP變體之后15分鐘的血漿cGMP含量，其中在圖 71-73 中，Gly-wtCNP37 為” CNP38”，Pro-Gly-wtCNP37 為” Pro_CNP38”，且 GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO :144)為，，HSA-CNP27” ；圖 72 展示以 Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37 或 GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO :144) 處理的小鼠的切割的第II型膠原蛋白的血清含量；圖 73 展示以 Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37 或 GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO :144)處理的小鼠的堿性磷酸酶的血清含量；圖74A及B描繪在以1 μ M Gly_CNP37短期㈧或長期⑶處理后cGMP反應的脫敏；圖 75A 顯示以 200nmol/kg Pro_Gly-CNP37 ( “Pro_CNP38”)每日處理野生型小鼠持續8日不使cGMP反應脫敏。圖75B展示一日一次以200nmol/kg Pro_Gly-CNP37處理小鼠持續連續兩日增強cGMP反應；圖76A-D展示以200nmol/kg Gly_CNP37處理野生型小鼠刺激股骨遠端(軟骨及骨)(A)、股骨皮層(骨)(B)、耳翼(軟骨)(C)及腎臟⑶中的cGMP分泌。圖76E-H展示肝(E)、心臟(F)、肺(G)及腦(H)組織在所研究時點相對于載體對照并未顯示響應于 Gly-CNP37的顯著cGMP分泌；圖77-82展示來自在經每日皮下注射載體或10 μ g/kg或36 μ g/kg Pro-Gly-CNP37的正常幼年獼猴中正進行的研究的結果。兩種劑量的Pro_Gly-CNP37均具有增加的生長板寬度(圖77)、增加的左脛骨及右脛骨長度(圖78A及B)、增加的腿長(圖 79)、增加的臂長(圖80)、增加的身長(圖81)，及增加的堿性磷酸酶血清含量(圖82)；及圖83描繪Gly_CNP37制劑的降解速率常數(K。bs)在pH 3-8及5°C、25°C及40°C 下隨PH值變化的觀察曲線圖。
具體實施例方式本發明涉及CNP的新穎變體，其對NEP及/或NPR-C具有降低的親和力，且對NEP 的切割作用及/或NPR-C的清除作用具有降低的敏感性；包含此等CNP變體的醫藥組合物； 及使用此等CNP變體來治療CNP反應性病癥的方法，這些病癥包括(但不限于)骨相關病癥(諸如軟骨發育不全)及與血管平滑肌細胞及組織相關的病癥。A.定義除非另作說明，否則本申請案(包括說明書及申請專利范圍)中所用的以下術語具有下文給出的定義。除非上下文另有明確規定，否則如說明書及隨附申請專利范圍中所用，不定冠詞” 一”及定冠詞”該/這些”包括復數個以及單數個所指物。術語”約”或”大約”指如一般技術者所測定的特定值具有可接受的誤差，其部分視量測或測定該值的方式而定。在某些實施例中，術語”約”或”大約”指在1、2、3或4個標準偏差內。在某些實施例中，術語”約”或”大約”指在指定值或范圍的30^^25^^20%, 15%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%>0. 5%或 0. 05% 以內。每當術語”約” 或”大約”置于一系列兩個或兩個以上數值中的第一個數值之前時，應了解術語”約”或”大約，，適用于該系列中的每個數值。術語”環境溫度”及”室溫”在本文中可互換使用且指周圍環境(例如進行反應或儲存組合物的空間)的溫度。在某些實施例中，環境溫度或室溫為約15°C至約^°C，或約 15°C至約25°C，或約20°C至約28 V，或約20 V至約25°C，或約22°C至約28 V，或約22°C至約25°C的范圍。在其它實施例中，環境溫度或室溫為約15°C、16°C、17V、18°C、19°C、20°C、 21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C或 28°C。標準化學術語的定義可見于參考著作中，包括Carey及Sundberg，AdvancedOrganic Chemistry (高等有機化學)第3版，A及B卷(Plenum Press,紐約1992)。除非另有規定，否則本發明的實施可采用在此項技術的技能內的合成有機化學、質譜分析、制備型及分析型層析、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學的某些習知方法。例如參看 Τ· E· Creighton，Proteins :Structures and Molecular Properties (蛋白質結構禾口分子特性)(W. H. Freeman 和公司，1993) ；A. L Lehninger, Biochemistry (生物化學)(Worth 出版公司，第 4 版，2004) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)(第 2 版，1989) ；Methods In Enzymology (酶學方法)(S. Colowick 及 N. Kaplan編，Academic Press,Inc.) ；Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington 藥典)第 18 片反(Easton，Pennsylvania :Mack Publishing Company, 1990)。本文中(無論上文或下文)所引用的所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用的方式并入本文中。本文通篇使用以下氨基酸縮寫丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg (R)天冬酰胺Asn (N)天冬氨酸Asp (D)半胱氨酸Cys (C)谷氨酰胺Gln (Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly (G)組氨酸His(H)異亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)賴氨酸Lys (K)甲硫氨酸Met (M)苯丙氨酸Phe (F)脯氨酸Pro(P)絲氨酸Ser (S)蘇氨酸Thr(T)色氨酸Trp (W)酪氨酸Tyr⑴纈氨酸Val (V)“多肽”及”蛋白質”指由經由肽鍵或肽鍵等構物連接的氨基酸殘基、其天然存在的相關結構變體及非天然存在的合成類似物構成的聚合物。合成多肽可例如使用自動化多肽合成器來合成。術語”多肽”及”蛋白質”不限于產物的最小長度。術語”蛋白質”通常指較大多肽。術語”肽”通常指較短多肽。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體及其類似物均包括于該定義內。該定義包括全長蛋白質與其片段。術語”多肽”及”蛋白質”亦包括多肽或蛋白質的表達后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化及其類似修飾。此外，出于本文的目的，”多肽” 可包括對原生序列的”修飾”，諸如缺失、添加、取代(其性質上可具有保守性，或可包括用以下取代人類蛋白質中通常存在的20種氨基酸中的任一者，或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或非典型氨基酸)及化學修飾(例如添加肽模擬物或以肽模擬物取代)。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發，或經由氨基酸的化學修飾以移除或連接化學部分，或可為意外的，諸如經由產生蛋白質的宿主引起的突變，或經由因PCR擴增所致的錯誤。在本文中使用習知符號來描繪多肽序列多肽序列的左手端為氨基端；多肽序列的右手端為羧基端。“保守性取代”系指多肽中的氨基酸經功能上、結構上或化學上類似的天然或非天然氨基酸取代。在一實施例中，以下群組各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸(1)丙氨酸(A)、絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴；(2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；(5)亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。在另一實施例中，以下群組各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸(1)甘氨酸(G)、丙氨酸㈧；(2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、賴氨酸⑷；(5)亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)；(6)丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；及(7)絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴、半胱氨酸(C)。在另一實施例中，氨基酸可如下所述來分組。(1)疏水性Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp ；(2)中性親水性=Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；(3)酸性Asp、Glu ；(4)堿性His、Lys、Arg ；(5)影響主鏈取向的殘基Gly、Pro ’及(6)芳族Trp、Tyr、Phe、Hi s。在一實施例中，本文所述的肽或多肽系使用編碼CNP變體的多核苷酸經由重組方式產生。因此，本文包括編碼本文所述的任何CNP變體的多核苷酸，包含此等多核苷酸視情況連接至表達控制序列的宿主細胞或載體，及使用此等多核苷酸、載體或宿主細胞來產生本文的CNP變體的方法。由此等多核苷酸表達的CNP變體可藉由包括以下的方法產生在適于表達編碼CNP變體的多核苷酸的條件下，使宿主細胞在培養基中生長，及自宿主細胞或培養基分離表達產物。實際表達產物可視任何轉譯后加工而與所編碼的蛋白質產物略微不同。“多核苷酸”系指由核苷酸單元構成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，諸如脫氧核糖核酸(“DNA”)及核糖核酸(“RNA”)以及核酸類似物。術語”核酸”通常系指較大多核苷酸。術語”寡核苷酸”通常系指一般不超過約50個核苷酸的較短多核苷酸。應了解，當將核苷酸序列以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示時，核苷酸序列亦包括”U”置換”Τ” 的RNA序列(亦即A、U、G、C)。”cDNA”系指與mRNA互補或相同的呈單股或雙股形式的DNA。“表達控制序列”指調控其所可操作地連接的核苷酸序列的表達的核苷酸序列。” 可操作地連接”系指兩個部分之間的功能關系，其中一部分的活性(例如調控轉錄的能力) 引起對另一部分的作用(例如序列的轉錄)。表達控制序列可包括(例如且不限于)啟動子(例如誘導性或組成性啟動子)、強化子、轉錄終止子、起始密碼子(亦即ATG)、內含子的拼接信號及終止密碼子的序列。“重組多核苷酸”指具有在天然狀態下并不聯接在一起的序列的多核苷酸。經擴增或組裝的重組多核苷酸可包括于適合載體中，且該載體可用于轉化適合宿主細胞。將包含重組多核苷酸的宿主細胞稱作”重組宿主細胞”。接著于重組宿主細胞中表達基因以產生例如”重組多肽”。重組多核苷酸亦可提供非編碼功能(例如啟動子、復制起點、核糖體結合位點等)。如本文中所用，”嵌合體”指包含至少兩個異源多核苷酸或多肽序列(亦即，來源于不同來源或彼此無關的天然存在的序列)的多核苷酸或多肽，這些異源多核苷酸或多肽序列系使用此項技術中通常已知的技術(例如重組表達或化學交聯)直接或間接連接在一起。在一實施例中，異源序列可包含蛋白質或肽直接或間接連接至CNP肽或變體，包括可自 CNP肽或變體切割的蛋白質或肽。在一相關實施例中，CNP變體為如本文所述的嵌合體。在某些實施例中，嵌合體包括包含可切割載體蛋白或肽標簽的CNP融合蛋白。術語”可切割載體蛋白”或”切割可切割肽標簽”指可直接或經由接頭間接融合至異源多肽序列，且可使用使切割可切割肽或多肽自異源多肽或蛋白質切割或分離的試劑自異源序列移除的肽或多肽序列。在一些實施例中，可切割載體蛋白或肽標簽改良融合蛋白或異源多肽的產生、純化及/或偵測。例示性可切割載體蛋白及肽標簽包括(但不限于)人類轉錄因子 TAF12(TAF12)、酮類固醇異構酶(KSI)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、 谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、殼多糖結合域(CBD)、BMP-2突變(BMPM)、 SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白Α、鏈球菌蛋白、淀粉結合蛋白、內葡聚糖酶A的纖維素結合域、外葡聚糖酶Cex的纖維素結合域、生物素結合域、recA、Flag、C-MyC、聚(His)、聚(Arg)、 聚(Asp)、聚(Gin)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體表位及其片段。“切割劑”為適用于自異源多肽或蛋白質切割或分離例如可切割肽或多肽的試劑。 例示性切割劑包括(但不限于)鈀、溴化氰(CNBr)、甲酸、羥胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸激酶(腸肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子)(a蛋白酶、枯草桿菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人類I^ce蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶、木瓜凝乳酶、無花果酶(無花果蛋白酶)、菠蘿酶(菠蘿蛋白酶)、組織蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內切蛋白酶Arg-C、內切蛋白酶Glu-C、內切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纖維蛋白溶酶。在兩個或兩個以上多核苷酸或多肽序列的情形中，術語”相同”或”相同性”百分比系指當比較及對準以獲得最大對應性時，如使用一種以下序列比較算法或藉由目測來量測，兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基。在兩個核酸或多肽的情形中，詞組”實質上同源”或”實質上相同”一般指當比較及對準以獲得最大對應性時，如使用一種以下序列比較算法或藉由目測所量測，兩個或兩個以上序列或子序列具有至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %核苷酸或氨基酸殘基相同性。在某些實施例中，實質同源性或相同性存在于長度為至少約25、50、100或 150個殘基的序列的區域上。在另一實施例中，這些序列在比較生物聚合物中任一者或兩者的整個長度上實質上同源或相同。對于序列比較，通常以一個序列充當參考序列，用于與測試序列相比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入計算機，必要時指定子序列坐標，且指定序列算
43法的程序參數。接著由序列比較算法依據所指定的程序參數，計算測試序列相對于參考序列的序列相同性百分比。供比較的序列的最佳對準可由以下來進行例如Smith及Waterman，Adv. Appl. Math.(高等應用數學)，2 :482(1981)的局部同源性算法、Needleman及mmsch， J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，48 443 (1970)的同源性對準算法、Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA,85 :2444(1988)的相似性搜尋法、此等算法的計算機化實施 (Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 及 TFASTA，Genetics Computer Group (遺傳學計算機組)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或目測。適用算法的一實例為 PILEUP,其使用 Feng 及 Doolittle，J. Mol. Evo 1.(分子進化學雜志)，35 :351-360 (1987) 的漸進式對準法的簡化形式且類似于Higgins及Sharp，CABI0S，5 :151-153(1989)所描述的方法。適用于產生序列多重對準的另一算法為Clustal W(Thompson等人，Nucleic Acids Research (核酸研究)，22 :4673-4680 (1994))。適用于測定序列相同性及序列相似性百分比的算法實例為BLAST算法(Altschul等人，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)， 215 :403-410(1990) ；Henikoff 及 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :10915(1989)； Karlin 及 Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5787 (1993))。執行 BLAST 分析的軟件可經由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information) 公開獲得。如下所述，兩個核酸序列或多肽實質上同源或相同的另一指標為第一核酸所編碼的多肽可與第二核酸所編碼的多肽發生免疫交叉反應。因此，例如當一多肽與第二多肽不同的處僅在于保守性取代時，該兩種多肽通常實質上相同。如本文所述，兩個核酸序列實質上相同的另一指標為兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。“實質上純”或”經分離”指目標物質為主要存在物質(亦即以摩爾濃度計，比組合物中任何其它個別大分子物質的豐度高)，且實質上純化的部分為目標物質占所存在的所有大分子物質的至少約50% (以摩爾濃度計)的組合物。在一實施例中，實質上純的組合物指，以摩爾濃度或重量計，相關物質占組合物中所存在大分子物質的至少約70%、75%、 80^^85%,90^^95^^98%或更高。若組合物基本上由單一大分子物質組成，則目標物質經純化至基本均質(藉由習知偵測方法在組合物中不可偵測到污染物質)。出于此定義的目的，溶劑物質、小分子(< 500道爾頓)、穩定劑(例如BSA)及元素離子物質不被視為大分子物質。在一實施例中，本文的化合物為實質上純或經分離。在另一實施例中，本文的化合物相對于其制造中所用的大分子起始物質為實質上純或經分離。在另一實施例中，本文的醫藥組合物包含實質上純或經分離的CNP變體與一或多種醫藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑及視情況與另一生物活性劑混合。如應用于目標的”天然存在”指該目標可見于自然界的事實。舉例而言，存在于生物體(包括病毒)中且未經人類在實驗室中有意修飾的多肽或多核苷酸序列為天然存在的。在一實施例中，”天然存在的”物質具有人類來源。“野生型” (Wt)為提及物種的多核苷酸、多肽或蛋白質的天然形式(包括序列)的術語。野生型形式有別于自遺傳突變產生的多核苷酸、多肽或蛋白質的突變形式。 在一實施例中，作為第二多肽的”類似物”或”變體”或”衍生物”的第一多肽為與該第二多肽具有至少約50^^60%或70%序列同源性但小于100%序列同源性的多肽。此等類似物、變體或衍生物可包含非天然存在的氨基酸殘基(包括(但不限于)高精氨酸、鳥氨酸、青霉胺及正纈氨酸)以及天然存在的氨基酸殘基。此等類似物、變體或衍生物亦可由一個或復數個D-氨基酸殘基構成，且亦可含有肽模擬物或肽鍵等構物，諸如兩個或兩個以上氨基酸或肽模擬物殘基之間的非肽鍵。在另一實施例中，若第一多肽不為第二多肽的已知切割產物或不為第二多肽的已知前體，則即使第一多肽與第二多肽具有100%序列同源性或其具有野生型序列，第一多肽仍為該第二多肽的”類似物”、，，變體”或”衍生物”。在一實施例中，如本文中所用，術語”來源于”系指多肽或肽序列系基于野生型或天然存在的多肽或肽序列且可具有天然氨基酸、非天然氨基酸或肽模擬物的一或多個缺失、添加及/或取代。在一實施例中，衍生序列與野生型或天然存在的序列共享至少約 40 %、50 %、60 %或70 %但小于100 %的序列相似性。在另一實施例中，衍生物可為多肽的片段，其中該片段與野生型多肽在至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸的長度上實質上同源(例如至少約70%、75%、80%、85%、90%或95%同源)。在又一實施例中，若多肽具有野生型多肽上所不存在的部分(例如聚合物，諸如PEG)與其直接或間接連接，則即使該兩種多肽的氨基酸序列共享100%同源性，該多肽仍”來源于”該野生型多肽。如本文中所用，”NPPC來源的”多肽系指來源于利鈉肽前體C(NPPC)多肽的多肽， 其為1 個氨基酸的單鏈前原多肽且在切割后最終產生wtCNP22。將信號肽自NPPC移除得到原CNP，且以內切蛋白酶弗林蛋白酶進一步切割產生53個氨基酸的活性肽(CNP-53)，其經分泌且經未知酶再切割，產生22個氨基酸的成熟肽(CNP或CNP-22)。因此，CNP22本身因來源于NPPC而為”NPPC來源的”多肽。在一實施例中，NPPC來源的多肽與野生型NPPC 在相同數目的氨基酸殘基上至少約40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 % 同源。進一步預期，NPPC來源的肽可包含NPPC多肽的約1至約53個，或1至37個，或1 至35個，或1至31個，或1至27個，或1至22個，或10至35個，或約15至約37個殘基。 在一實施例中，NPPC來源的肽可包含具有來源于NPPC多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52 或 53 個氨基酸的序列。術語”有效量”指足以對個體的健康狀況、病理學或疾病產生所需結果或用于診斷目的的劑量。所需結果可包含劑量接受者的主觀或客觀改良。”治療有效量”指對健康有效產生預定有利作用的藥劑量。任何個別情況下的適當”有效”量均可由一般技術者使用常規實驗來決定。應了解，用于任何特定患者的特定劑量濃度及給藥頻率均可改變且將視多種因素而定，包括所用特定化合物的活性；該化合物的生物可用性、代謝穩定性、排泄速率及作用時長；化合物的給予模式及時間；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食；及特定病狀的嚴重度。“治療”指預防性治療或治療性治療或診斷性治療。在某些實施例中，”治療”指出于治療、預防或診斷目的給予個體化合物或組合物。“預防性”治療為出于降低產生病變的風險的目的給予未顯示疾病征兆或僅顯示疾病早期征兆的個體的治療。可以預防性治療的形式給予本文的化合物或組合物以降低產生病變的可能性或若已產生則將病變的嚴重度降至最小。“治療性”治療為給予顯示病變征兆或癥狀的個體以用于減弱或消除彼等征兆或癥狀的目的的治療。這些征兆或癥狀可為生化、細胞、組織、功能或身體、主觀或客觀征兆或癥狀。本文的化合物亦可以治療性治療的形式給予或給予用于診斷。“診斷”指鑒別病理學病狀的存在、程度及/或性質。診斷方法在其特異性及選擇性方面不同。盡管特定診斷方法可能不提供病狀的確診，但該方法若能提供有助于診斷的正面指示則已足夠。“骨或軟骨相關生物標記”或”骨或軟骨相關標記”指生長因子、酶、蛋白質或其它可偵測生物物質或部分，其含量與例如軟骨更新(cartilage turnover)、軟骨形成、軟骨生長、骨吸收、骨形成、骨生長或其組合相關而增加或降低。此等生物標記可在給予如本文所述的CNP變體之前、期間及/或之后量測。例示性骨或軟骨相關生物標記包括(但不限于) CNP、cGMP、第II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、I型膠原蛋白的前肽及其片段、I型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。可在任何適當生物樣品(包括(但不限于)組織、血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液及尿)中量測軟骨及骨相關生物標記。在一些實施例中，在來自經歷功效/藥效學活體內研究的動物及/或來自離體研究的條件培養基的血液、血漿或血清中量測生物標記。在某些實施例中，量測至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量，且可根據所量測生物標記含量來調節給予個體的CNP變體的給予量或頻率。在一些實施例中，生物標記的含量”低于目標含量”或”高于目標含量”。生物標記的目標含量為在接受CNP變體的個體中觀察到治療作用時生物標記的含量或含量范圍。在某些實施例中，患有CNP反應性病癥或病狀的個體的生物標記目標含量為在未受影響的正常個體中觀察到的生物標記的含量或含量范圍。在其它實施例中，為指示治療作用，生物標記的目標含量不需要與在正常個體中觀察到的生物標記的含量或含量范圍相等，但可在未受影響的個體中觀察到的生物標記的”正常”含量或含量范圍的例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%或5%以內。舉例而言，若生物標記含量與骨或軟骨形成或生長相關而增加，則指示治療作用的生物標記的目標含量可高于未經給予CNP變體的患CNP反應性病癥的患者中生物標記的含量，且可視情況低于未患該病癥的個體中生物標記的”正常”含量、大致等于該生物標記的”正常”含量，或高于該生物標記的”正常”含量。在一實施例中，若生物標記的含量低于目標含量，則表明治療作用不足，可能需要增加所給予CNP變體的給予量或頻率。在一相關實施例中，若生物標記高于目標含量，則表明已給予多于必要量的CNP變體，可能需要降低所給予CNP變體的給予量或頻率。再舉一實例，若生物標記的含量與骨或軟骨形成或生長相關而降低，則指示治療作用的生物標記的目標含量可低于未經給予CNP變體的患CNP反應性病癥的患者中生物標記的含量，且可視情況高于未患該病癥的個體中生物標記的”正常”含量、大致等該生物標記的”正常”含量，或低于該生物標記的”正常”含量。在該種情況下，可能適用上述調節CNP 變體給予量及頻率的相反情況。“醫藥組合物”指在個體動物(包括人類及哺乳動物)中適用于醫藥用途的組合物。醫藥組合物包含治療有效量的CNP變體、視情況選用的另一生物活性劑，及視情況選用的醫藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。在一實施例中，醫藥組合物包含包含以下的組合物活性成分，及構成載體的惰性成分，以及經由任何兩種或兩種以上成分的組合、復合或聚集，或經由一或多種成分的解離，或經由一或多種成分的其它類型的反應或相互作用直接或間接產生的任何產物。因此，本文的醫藥組合物包括混合本文的化合物與醫藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑所制得的任何組合物。“醫藥學上可接受的載體”指任何標準醫藥載體、緩沖劑及其類似物，諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、5%葡聚糖水溶液，及乳液(例如油/水或水/油乳液)。賦形劑的非限制性實例包括佐劑、黏合劑、填充劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、助流劑、甜味劑、 調味劑及著色劑。適合醫藥載體、賦形劑及稀釋劑描述于Remington藥典(Remington藥典)第19版(Mack Publishing Co.，Easton，1995)中。較佳醫藥載體視活性劑的預定給予模式而定。典型給予模式包括經腸(例如經口)或非經腸(例如皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內注射；或表面、經皮或經黏膜給予)。“醫藥學上可接受的鹽”為可調配為醫藥用化合物的鹽，包括(但不限于)金屬鹽 (例如鈉、鉀、鎂、鈣等)及氨或有機胺的鹽。“醫藥學上可接受”或”藥理學上可接受”指并非在生物學上或其它方面不合需要的物質，亦即該物質可給予個體而不會引起任何不合需要的生物作用，或不會以有害方式與含其的組合物中的任何組分或與個體的身體上或體內所存在的任何組分相互作用。術語”單位劑型”系指適于以單一劑量形式用于人類及動物個體的實體不連續單元，各單元以足以產生所需作用的量計算含有預定量的本文的化合物，視情況與醫藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑、載體或載體結合。本文的新穎單位劑型的規格視以下而定所用特定化合物及欲達成的效果，及宿主中與各化合物相關的藥效學。“生理狀況”指動物(例如人類)體內的狀況。生理狀況包括(但不限于)體溫， 及生理性離子強度的水性環境、PH值及酶。生理狀況亦包括特定個體體內不同于大多數個體中存在的”正常”狀況的狀況，例如這些狀況不同于約37°C的正常人類體溫或不同于約 7.4的正常人類血液pH值。“生理pH值”或”生理學范圍內的pH值”指在包括約7. 0至8. 0在內的范圍內、較通常在包括約7. 2至7. 6在內的范圍內的pH值。如本文中所使用，術語”個體”包括哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物的實例包括 (但不限于)哺乳動物綱的任何成員人類、非人類靈長類動物(諸如黑猩猩)，及其它猿及猴物種；農畜，諸如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜，諸如兔、犬及貓；實驗動物，包括嚙齒動物， 諸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其類似動物。非哺乳動物的實例包括(但不限于)鳥類、魚及其類似動物。該術語不指定特定年齡或性別。除非另有指示，否則術語”聚乙二醇”、”PEG”、”聚環氧乙烷”及”ΡΕ0”在本文中可互換使用。經由氨基偶聯至與數值η相關的”PEOn”聚合物的CNP肽(CNP22或其變體)一般具有式CH3-[-0-CH2CH2-]n-C( = 0)-NHR，其中η為環氧乙烷單元的數目且R表示肽的剩余部分。"PEOn”聚合物可視情況在羰基碳與重復的環氧乙烷單元之間具有伸烷基(CH2)m，其中 m為1至5的整數。該種"PEOn”(例如PE012或PE024)聚合物具有單分散性，亦即，其為具有特定分子量的單一不連續聚合物。類似地，經由氨基偶聯至與數值nK相關的"ΡΕ&ιΚ”聚合物的CNP肽一般具有式CH3-[-O-CH2CH2-]P-C( = 0)_NHR，其中ρ為大于1的整數。"ΡΕ&ιΚ” 聚合物亦可視情況在羰基碳與重復的環氧乙烷單元之間具有伸烷基(CH2)m，其中m為1至 5的整數。然而，該種” PEGnK” (例如PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物具有多分散性，亦即含有具有分子量分布的聚合物的混合物，其中數值nK表示聚合物的數目平均分子量(Mn)(以千道爾頓為單位)。舉例而言，偶聯至CNP肽的”PEGI”表示具有數目平均分子量為約2kDa的聚合物的多分散性PEG聚合物。除非另作明確指示，否則當指定聚合物(例如PEG)的質量范圍(例如以kDa為單位)時，該范圍指聚合物數目平均分子量的范圍，而非多分散性混合物中多種聚合物的分子量的范圍。術語”鹵素”、，，鹵化物”或”鹵基”系指氟、氯、溴及/或碘。術語”烷基”指直鏈或支鏈飽和單價烴基，其中烷基可視情況經一或多個如本文所述的取代基Q取代。在某些實施例中，烷基為具有1至20個(C1-JU至15個(CV15)U至 12個(CV12)U至10個(C1,)或1至6沁_6)個碳原子的直鏈飽和單價烴基，或具有3至 20 個(C3_J、3 至 15 個(C3_15)、3 至 12 個(C3_12)、3 至 10 個(C3_10)或 3 至 6 (C3_6)個碳原子的支鏈飽和單價烴基。如本文中所使用，直鏈Ch6及支鏈c3_6烷基亦稱為”低碳烷基”。烷基的實例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基(包括所有異構形式，包括正丙基及異丙基)、 丁基(包括所有異構形式，包括正丁基、異丁基、仲丁基及叔丁基)、戊基(包括所有異構形式)及己基(包括所有異構形式)。舉例而言，Ch6烷基指具有1至6個碳原子的直鏈飽和單價烴基或具有3至6個碳原子的支鏈飽和單價烴基。術語”烷氧基”指-0-烷基。在某些實施例中，烷氧基可視情況經一或多個如本文所述的取代基Q取代。術語”鹵代烷基”指經一或多個鹵原子取代的烷基。在某些實施例中，鹵代烷基系經一、二、三、四、五或六個鹵原子取代。在某些實施例中，鹵代烷基可視情況經一或多個如本文所述的其它取代基Q取代。術語”環烷基”指可視情況經一或多個如本文所述的取代基Q取代的環狀飽和橋聯及/或非橋聯單價烴基。在某些實施例中，環烷基具有3至20(C3_J、3至15(C3_15)、3至 12 (C3_12)、3至10 (C3_1Q)或3至7 (C3_7)個碳原子。環烷基的實例包括(但不限于)環丙基、 環丁基、環戊基、環己基、環庚基、十氫萘基及金剛烷基。術語”雜環基”或”雜環”指單環非芳族環系統或含有至少一個非芳族環的多環系統，其中一或多個非芳族環原子為獨立地選自0、S或N的雜原子，且其余非芳族環原子為碳原子。在某些實施例中，雜環基或雜環基團具有3至20個、3至15個、3至10個、3 至8個、4至7個或5至6個環原子。在某些實施例中，雜環基為單環、雙環、三環或四環系統，其可包括稠合或橋聯的環系統，且其中氮或硫原子可視情況經氧化，氮原子可視情況經季銨化，且一些環可為部分或完全飽和，或為芳族。雜環基可于使得產生穩定化合物的任何雜原子或碳原子處連接至主結構。雜環基團的實例包括(但不限于)吖啶基、氮雜草基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并異嚼唑基、苯并異_嗪基、苯并二噪烷基、苯并間二氧雜環戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基(benzonaphthofuranyl)、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氫呋喃基、苯并四氫噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并苯硫基、苯并三唑基、苯并硫代吡喃基、苯并嚼嗪基、苯并嘿唑基、苯并噻唑基、β -咔啉基、咔唑基、色滿基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氫異喹啉基、二苯并呋喃基、二氫苯并異噻嗪基、二氫苯并異_嗪基、二氫呋喃基、二氫吡喃基、二氧戊環基、二氫吡嗪基、二氫吡啶基、二氫吡唑基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氧戊環基、1，4-二噻烷基、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、吲哚啉基、吲嗪基、吲哚基、異苯并四氫呋喃基、異苯并四氫噻吩基、異苯并噻吩基、異色滿基、異香豆素基、異吲哚啉基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑烷基、異噻唑基、異嚼唑烷基、異B惡唑基、嗎啉基、萘啶基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、η惡二唑基、_唑烷酮基、卩惡唑烷基、嚼唑并吡啶基、嚼唑基、 環氧乙烷基(oxiranyl)、萘嵌二氮苯基、菲啶基、菲咯啉基(phenathrolinyl)、吩吡嗪基、 吩嗪基、吩噻嗪基基、吩_嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡嗪基、批唑烷基、批唑基、噠嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎寧環基、四氫呋喃基(tetrahydrofuryl)、四氫呋喃基 (tetrahydrofurany 1 )、四氫異喹啉基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、四唑基、噻二唑并嘧啶基、 噻二唑基、噻嗎啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基及1，3，5-三噻烷基。在某些實施例中，雜環基團可視情況經一或多個如本文所述的取代基Q取代。術語”芳基”指含有至少一個芳族烴環的單環芳族基團或多環單價芳族基團。在某些實施例中，芳基具有6至20個(C6_2。)、6至15個(C6_15)或6至10(C6_10)個環原子。芳基的實例包括(但不限于)苯基、萘基、弗基、奧基、蒽基、菲基、芘基、聯苯及三聯苯。芳基亦指至少一個環為芳族且其它環可為飽和、部分不飽和或芳族的雙環或三環碳環，例如二氫萘基、茚基、二氫茚基及四氫萘基(萘滿基)。在某些實施例中，芳基可視情況經一或多個如本文所述的取代基Q取代。術語”雜芳基”指含有至少一個芳族環的單環芳族基團或多環芳族基團，其中至少一個芳族環含有一或多個獨立地選自0、s及N的雜原子。雜芳基的各環可含有一或兩個0 原子、一或兩個S原子及/或一至四個N原子，限制條件為各環中雜原子的總數為四或四以下且各環含有至少一個碳原子。雜芳基可于使得產生穩定化合物的任何雜原子或碳原子處連接至主結構。在某些實施例中，雜芳基具有5至20個、5至15個或5至10個環原子。單環雜芳基的實例包括(但不限于)吡咯基、批唑基、批唑啉基、咪唑基、嗯唑基、異嗯唑基、 噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、嘴二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基及三嗪基。雙環雜芳基的實例包括(但不限于)吲哚基、苯并噻唑基、苯并P惡唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、噴嗪基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、色原酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、噴唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氫異吲哚基及四氫喹啉基。三環雜芳基的實例包括(但不限于) 咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基及咕噸基。在某些實施例中，雜芳基可視情況經一或多個如本文所述的取代基Q取代。術語”視情況經取代”意欲指基團(包括烷基、烷氧基、鹵代烷基、環烷基、 雜環基、芳基及雜芳基)可經一或多個取代基Q(在一實施例中，一、二、三或四個取代基Q)取代，其中各Q獨立地選自由以下組成的群氰基、鹵基、氧、硝基、(；_6烷基、 CV6烷氧基、鹵基-CV6烷基、C3_7環烷基、雜環基、C6_14芳基、雜芳基、-C (0) Re、-C (0) ORe、-C(O) NRfRg, -C (NRe) NRfRg、-ORe、-OC(O) R% -OC(O) 0R% -OC(O)NRfRg, -OC ( = NRe) NRfRg, -OS(O) R% -OS(O)2Re, -OS (0) NRfRg, -OS (0) 2NRfRg、-NRfRg, -NReC (0)Rf、-NReC (0) 0Rf, -NReC (0) NRfRg, -NReC ( = NRh) NRfRg, -NReS (0) Rf、-NReS (0) 2Rf、-NReS(O) NRfRg、-NReS (0) 2NRfRg、-SRe、-S (0) Re、-S (0) 2Re 及-S (0) 2NRfRg，其中各 Re、Rf、Rg 及 Rh 獨立地為氫、CV6烷基、C3_7環烷基、雜環基、C6_14芳基或雜芳基；或Rf及Rg連同其所連接的N原子一起形成雜環基。B. GNP 變體CNP22作為治療劑的用途受限于其在血漿中的短半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.(臨床內分泌代謝雜志)，78 1428-35 (1994))。在人類血漿中，CNP22的濃度通常小于5皮摩爾。在人體中，CNP22由NEP及NPR-C降解且自循環中清除(Growth Hormone&IGF Res. , 16 :S6-S14)。在使用全身性給予的CNP22的所有人類及動物研究中，均已使用連續輸注來增加個體體內的CNP22濃度。具有較長半衰期及至少類似程度功能性的CNP肽將有益于基于CNP的治療策略。CNP變體亦揭示于相關國際申請案第PCT/US08/84270號(以引用的方式明確并入本文中)中。本文提供對NEP及/或NPR-C具有降低的親和力，且對NEP的切割及NPR-C的清除作用具有降低的敏感性，但具有與野生型CNP22相比實質上類似或更佳的功能性的CNP變體。CNP變體對NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的敏感性降低將使變體的血漿或血清半衰期增加，藉此增加變體分布至目標組織及部位且實現所需藥理學作用的機會。在某些實施例中，與wtCNP22相比，本文所述的CNP變體對NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的活體外或活體內敏感性至少降至約1/1. 5、1/2、1/2. 5、1/3、1/3. 5、1/4、1/4. 5或1/5，且與 wtCNP22相比，活體內血漿或血清半衰期至少增至約1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、 4. 5倍或5倍，同時保留wtCNP22功能性的至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %，或具有wtCNP22功能性至少約1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、4. 5倍或5倍大的功能性。可在活體外或活體內研究中就一或多種與軟骨或骨形成或生長相關的生物標記(例如 cGMP)的含量、在離體或活體內研究中就特定骨的長度等來評估CNP功能性。NEP的天然底物較小且利鈉肽(約2. 2kDa至約3. 2kDa)為最大的天然底物。根據X射線結晶學分析，NEP活性位點深埋于中央腔隙內部，從而有效限制底物分子大小不超過約3kDa (Oefner等人，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，四6 :341-349 (2000))。基于 NPR-B信號傳導研究，CNP-22的變體(諸如CNP_17(僅保留CNP22的環狀域Cys6-Cys22) 及CNP-53 (在N端具有31個氨基酸的延伸的CNP-22))仍可類似于2. 2kDa wtCNP-22結合并活化NPR-B。因此，本文包括在CNP22或其變體的N端及/或C端偶聯至天然聚合物(例如肽)及/或合成聚合物(例如PEG)的CNP變體，其顯示NEP抗性增強，但保留結合及活化NPR-B信號傳導受體的能力。在一實施例中，本文包括由以下通式表示的CNP變體(χ) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (z) (SEQ ID NO :139)，或(χ) -Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :140)，其中(χ)及(ζ)各自獨立地為本文所述的天然聚合物(例如含有至少一個氨基酸的肽序列)及/或合成聚合物(例如PEG)，使得CNP變體的總質量的特征在于本文一般描述的范圍，例如在約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的范圍內。在一實施例中，Cys6至Cys22 的殘基形成環狀部分。在一實施例中，(χ)及/或(ζ)包含來源于NPPC或非CNP多肽(例如ANP、BNP、IgG等)的氨基酸延伸，其中該延伸含有1至40個、1至35個、1至31個、5至 35個、5至31個或5至15個氨基酸。在另一實施例中，CNP變體在CNP22的一或多個以下
50位置包含一或多個另一天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模擬物及/或肽鍵等構物的修飾及 / 或取代=GlyU Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、LyslO、LeulU Ilel4、Glyl5、Serl6、 Metl7、Glyl9、Leu20 及 Gly21。 在另一實施例中，總質量特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. SkDa 至約6kDa或7kDa)，經設計為增強對NEP降解的抗性的CNP變體系由以下通式表示
(χ) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9- (h) !O-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (z) (SEQ ID NO :141)，或(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4 "Gly5-Cy S6-Phe7-Gl y8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :6)，其中(χ)為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團的非限制性實例為 PEG(PEO)，且天然聚合基團的非限制性實例為含有1至35個氨基酸且來源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的變體、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，諸如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、骨織素或成纖維細胞生長因子2(FGF2)；(ζ)可不存在或可為合成或天然聚合基團，或其組合，其中合成聚合基團的非限制性實例為PEG，且天然聚合基團的非限制性實例為來源于利鈉多肽(例如NPPC、CNP、ANP或 BNP)或非利鈉多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且(b)及(h)可獨立地為該位置的野生型Lys，或可經由保守性氨基酸取代或經側鏈上不具有反應性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、 6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Glu或義！·)置換。在一實施例中，(b)為Arg。在另一實施例中，為提高NEP抗性，(b)不為Gly。在另一實施例中，(h)不為Arg。來源于NPPC或其變體的氨基酸序列的非限制性實例包括Arg,Glu-Arg,Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 7),Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 8),Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO 9),Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)，Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO :11)，Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO :12)，Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO :13)，Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO :14)，Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO :15)，Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO :16)，Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO :17)，Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO :18)，Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 19)，Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ IDNO 20)，Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO :21)，及Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 22)。來源于非CNP多肽(諸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性實例包括Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO 23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO 24)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 25)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 26)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO 27)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO 28)；Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO 29)；Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO 30)；Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID NO 31)；Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :32)。在一實施例中，如本文所述，具有(χ)及/或(ζ)基團的任何CNP變體的N端(χ) 基團及/或C端(ζ)基團獨立地包含含有少量(若存在)天然或非天然酸性氨基酸(例如 Asp或Glu)的氨基酸序列。在另一實施例中，(χ)及/或(ζ)富含天然或非天然堿性氨基酸(例如Lys、Arg或His)，以維持類似CNP22的pi值(pi 8. 9)的堿性pi值。在一實施例中，CNP變體的pi值在約8至約10. 5的范圍內，旨在使得CNP變體可更容易擴散穿過包圍骨生長板的軟骨細胞的細胞外基質。在較窄的實施例中，CNP變體的pi值為約8. 5至約 10. 5，或約8. 5至約10，或約9至約10。在另一實施例中，(χ)及/或(ζ)富含天然或非天然極性氨基酸，旨在增強水溶性。 在又一實施例中，(X)及/或(Z)含有少量(若存在)天然或非天然疏水性氨基酸(例如 Ala、Val> Leu> Ile 或 Met)。在另一實施例中，CNP變體的N端以至少一個甘氨酸殘基終止，其設計在于增加血清半衰期。在相關實施例中，為防止形成焦谷氨酰胺，CNP變體的N端以甘氨酸殘基終止，或者以谷氨酰胺終止。在一實施例中，(χ)基團含有延伸的氨基酸，其N端以至少一個甘氨酸殘基終止。在另一實施例中，(χ)及/或(ζ)不含兩個相鄰天然或非天然堿性氨基酸(例如Lys-Lys或Arg-Arg)，旨在降低對弗林蛋白酶切割的敏感性。在一實施例中，(χ)不含緊接于對應于CNP22的Glyl的位置之前的兩個相鄰堿性氨基酸。在又一實施例中，CNP變體的(χ)基團及/或(ζ)基團包含來源于NPPC (例如來源于CNP53)的氨基酸序列。在一實施例中，(χ)包含來源于ANP或BNP的N端尾的氨基酸序列。在另一實施例中，(ζ)包含來源于ANP或BNP的C端尾的氨基酸序列。在另一實施例中，(χ)及/或(ζ)包含來源于非利鈉多肽的氨基酸序列，諸如，例如IgG、人類血清白蛋白 (HSA)、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、TOF-2及骨靶向蛋白(例如骨織素、骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)。在本文所述的CNP22或其變體可具有N端(χ)基團及/或C端(ζ)基團的任何實施例中，(X)及/或(Z)可獨立地含有來源于骨形態發生蛋白(BMP)的功能域的氨基酸序列。藉由增加CNP變體的總質量以使其特征在于本文一般描述的范圍(例如約2.6kDa或 2. SkDa至約6或7kDa的范圍)，來源于BMP的功能域的N端及/或C端氨基酸延伸可增強 NEP抗性，且因此增加CNP變體的血清半衰期。另外，因為某些BMP為誘導骨及軟骨形成的生長因子及細胞因子，所以來源于BMP的功能域的片段可通過不同于以CNP22或其變體的環狀域活化NPR-B的鳥苷酸環化酶功能的機制促進軟骨細胞、軟骨或骨生長。促進骨形成及發育、軟骨形成及發育及/或成骨細胞分化的BMP的非限制性實例包括BMP1、BMP2、BMP3、 BMP5、BMP7及BMP8a。在一實施例中，CNP22或其變體的N端及/或C端獨立地偶聯至來源于BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7或BMP8a的C端部分中最后140個氨基酸的氨基酸序列。在一實施例中，CNP變體在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸，包括(但不限于)DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，類似物 BL) (SEQ ID NO 60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 64)；GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :144)；及SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (類似物 CD)(具有來源于 BNP 的 N 端及 C 端尾的 CNP17) (SEQ ID NO 68)。在另一實施例中，CNP變體在CNP22的位置4具有K4R取代。CNP (K4R)變體的非限制性實例包括GANRRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AY) (SEQ ID NO 36)；GANPRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)；RGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ERGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 BA) (SEQ ID NO 39)；GANQQGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CH) (SEQ ID NO 69)；及GANSSGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CG) (SEQ ID NO 70)。在其它實施例中，CNP變體為包含CNP22或其具有氨基酸添加、缺失及/或取代的變體，及位于CNP肽N端的來源于除CNP外的多肽或蛋白質的肽片段，或完整非CNP多肽或蛋白質的嵌合體，其中CNP22或其變體可視情況具有一或多個氨基酸殘基的N端氨基酸延伸。在某些實施例中，CNP嵌合體包含CNP22或其具有一或多個氨基酸殘基的N端氨基酸延伸的變體。在某些實施例中，CNP嵌合體在緊接于CNP22或其變體的第一位置(在CNP22 的情況下為Gly)之前含有賴氨酸-賴氨酸(KK)殘基或GANKK殘基。在其它實施例中，CNP 嵌合體在緊接于CNP22或其變體的第一位置之前含有一或兩個不同于賴氨酸-賴氨酸的殘基。可緊接于CNP22或其變體的第一位置之前的殘基的非限制性實例包括KP、PK、PR、 PQ、QK、QQ、RR、SS、GANKP(SEQ ID NO :200)、GANPK(SEQ ID NO :201)、GANPR(SEQ ID NO :9)、 GANPQ(SEQ ID NO :202)、GANQK(SEQ ID NO :203)、GANQQ(SEQ ID NO :10)、GANRR(SEQ ID NO 8)及 GANSS(SEQ ID NO :11)。在另一實施例中，CNP變體為包含CNP22及N端肽片段的嵌合體，包括(但不限于)GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CQ)(富含組氨酸的糖蛋白 (HRGP)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CR) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CX) (HRGP 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CF) (IgG1 (Fc)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CT)(人類血清白蛋白 (HSA)片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 80)；GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CE) (HSA 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 CZ)(骨織素”NPR C 抑制劑，，片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 82)；及GKRTGQILGSKTGPGH(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(類似物 DA) (FGF2” 肝素結合域” 片段-CNP22 嵌合體)(SEQ ID NO 83)。在另一實施例中，CNP變體為包含N端肽片段及CNP22 (其中精氨酸取代CNP22的 Lys4( “CNP22(K4R)”))的嵌合體，包括(但不限于)GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CK) (IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CL) (HSA 片段-CNP22 (K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CM)(纖連蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CN)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CO)(纖維蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CP)(鋅指片段-CNP22 (K4R)嵌合體)(SEQ ID NO 89)。包含IgG及CNP22或其變體的嵌合體經設計為尤其增強對NEP降解的抗性且減少與血清白蛋白的結合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合體經設計為尤其降低免疫原性且減少與血清白蛋白的結合。在N端含有富含組氨酸、無賴氨酸、無精氨酸的陽離子性序列的 HRGP-CNP22及HRGP-CNP22 (K4R)嵌合體經設計為尤其增強對蛋白酶的穩定性。含有骨織素片段的嵌合體經設計以在骨生長板處在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)切割后釋放骨織素片段，其中該片段將抑制清除受體NPR-C。關于包含FGF2肝素結合片段的嵌合體，結合于片段的肝素經設計以保護嵌合體避免降解，從而提供較長血清半衰期。含有纖連蛋白、纖維蛋白原或鋅指片段的嵌合體經設計為減少與血清白蛋白的結合，以及其它特征。不希望受理論束縛，如與wtCNP22相比，對NEP降解的抗性增強且具有類似或改良的功能性(例如結合于NPR-B及刺激cGMP信號傳導)的分子量為約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的CNP變體若不緊密結合于血漿蛋白(諸如血清白蛋白)，則可能更有效。 不緊密結合于血漿蛋白(例如血清白蛋白)的CNP變體可更有效地擴散穿過軟骨，到達骨生長板的軟骨細胞，且結合并活化NPR-B以進行cGMP信號傳導。在一實施例中，經設計為減少與血漿蛋白(例如血清白蛋白)的結合的CNP變體為包含CNP22或其變體及來自IgG 的肽片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為減少與血漿蛋白的結合的CNP變體為包含 CNP22或CNP22(K4R)及來自多肽(例如IgG、HSA、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽等) 的片段的嵌合體。在另一實施例中，經設計為減少與血漿蛋白的結合的CNP變體包含CNP22 或其變體偶聯至親水性或水溶性聚合物。在一實施例中，親水性或水溶性聚合物為PEG (或 ΡΕ0)。在另一實施例中，親水性或水溶性聚合物(例如PEG)經一或多個在生理條件下賦予聚合物負電荷的官能基(諸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其組合)官能化。在另一實施例中，本文的CNP變體包括介于人類CNP-17(hCNP_17)至人類 CNP-53 (hCNP-53)的范圍內，且具有來源于hCNP-53的野生型氨基酸序列的截短CNP肽。此等截短CNP肽包括DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；LRVDTKSRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO 146)；RVDTKSRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO 147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO
148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49) (SEQ ID NO
149)；TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO:
150)；KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO:
151)；SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46) (SEQ ID NO:152)；RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)；AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)；AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO 60)；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO :161)；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO :162)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO :163)；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33) (SEQ ID NO :164)；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)；KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)；KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)；GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO 1)；LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)；SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)；KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)；GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18) (SEQ ID NO :178)；及CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQ ID NO :2)。在某些實施例中，CNP變體不包括CNP-17、CNP-22或CNP-53。在另一實施例中，介于hCNP-17至hCNP-53范圍內的截短CNP肽可在特定截短CNP 肽的任一或多個氨基酸位置含有如本文所述天然或非天然氨基酸或肽模擬物(例如肽鍵等構物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。在另一實施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、 缺失及/或取代的截短CNP肽可在N端、C端及/或內部位點偶聯至本文所述的任何部分， 包括(但不限于)靶向骨或軟骨的部分(例如二磷酸鹽、靶向骨或軟骨的肽序列(例如聚 Asp、聚Glu)、來源于骨蛋白(例如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白)的骨靶向域的肽序列)、來源于骨形態發生蛋白(例如BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、BMP8a)的功能域的肽序列、來源于利鈉多肽(例如NPPC、ANP、BNP)的肽序列、來源于非利鈉來源多肽(例如血清白蛋白、IgG、富含組氨酸的糖蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、含鋅指多肽、FGF-2、骨織素)的肽序列、降低腎清除率的部分(例如帶負電PEG部分)、親水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物(例如由骨生長板的細胞表面上的受體識別的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸、天然脂肪酸)、磷脂及其組合。在一實施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代且視情況在N端、C端及/或內部位點偶聯至一或多個部分的截短CNP肽具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質量。在另一實施例中，CNP變體為CNP37的衍生物，該CNP37為 QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO 60)。CNP37 變體可在 CNP37 的 37 個位置中任一或多處含有天然或非天然氨基酸或肽模擬物(例如肽鍵等構物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。 依據CNP22的編號，CNP37中可進行的取代的非限制性實例包括K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、 G15S、S16Q、M17N、G19R及其組合。在一實施例中，CNP37衍生物含有天然氨基酸(例如天冬酰胺)或非天然氨基酸或肽模擬物對Metl7的取代，旨在部分避免甲硫氨酸的硫原子被氧化。在另一實施例中，CNP37變體含有天然或非天然非堿性氨基酸或肽模擬物對Lys8、 LyslO、Lysl4及/或Lysl5 (依據始于CNP37的N端的編號)的取代，旨在部分減少白蛋白
纟口口。除氨基酸添加、缺失及/或取代的外或替代氨基酸添加、缺失及/或取代，CNP37 衍生物可在N端、C端及/或內部位點偶聯至本文所述的任何部分，這些部分包括(但不限于)靶向骨/軟骨的部分(例如骨靶向肽域)、降低腎清除率的部分(例如帶負電PEG部分)、親水性聚合物(例如PEG)、包含一或多個氨基酸的氨基酸序列(例如骨織素” NPR-C 抑制劑”片段)、碳水化合物(例如由骨生長板的細胞表面上的受體識別的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸及天然脂肪酸)，及其組合。在一實施例中，CNP變體為經修飾的CNP37肽，其在弗林蛋白酶切割位點具有突變 /取代(加下劃線)，旨在提高對弗林蛋白酶的活體內抗性，及/或在N端含有甘氨酸(加下劃線)，旨在提高血漿穩定性及防止形成焦谷氨酰胺。此等CNP37變體包括(但不限于)GQEHPNARIWKGAN￡EGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物⑶)(SEQ ID NO 71)；GQEHPNARKIGAN巡GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CT) (SEQ ID NO 72)；GQEHPNARKIGAN通GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CU) (SEQ ID NO 73)；GQEHPNARKIGANEEGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 CW) (SEQ ID NO 74)；GQEHPNARKIGANEKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37，類似物 DB) (SEQ ID NO: 75) ’及PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145)。在另一實施例中，本文的CNP變體包括可通過本文所述的融合蛋白方法產生的 CNP肽及其變體。可用本文所述的融合蛋白方法使用化學或蛋白水解切割或切割蛋白質自切割產生的CNP變體的非限制性實例包括 GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP53) (SEQ ID NO 179)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO :75)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP37) (SEQ ID NO :60)；
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (HSA 片段 _wtCNP27) (SEQ ID NO
144)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO 36)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP53(M48N)] (SEQ ID NO 180)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N) ](SEQ ID NO: 181)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO 182)；GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO: 183)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO :184)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP53) (SEQ ID NO 185)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO:
145)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP37)(SEQ ID NO 186)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP34)(SEQ ID NO 187)；P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO 188)；PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :189)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP53) (SEQ ID NO 190)；MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO: 191)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP37)(SEQ ID NO 192)；M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA_wtCNP27)(SEQ ID NO 193)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met_CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO 194)。其它CNP變體(包括介于hCNP-17至hCNP_53范圍內且具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代的截短CNP肽)亦可通過本文所述的融合蛋白方法產生，只要融合蛋白的化學或蛋白水解切割的預定位點不存在于目標CNP變體本身的氨基酸序列內。作為一非限制性實例，可采用本文所述的融合蛋白方法使用甲酸切割來產生截短wtCNP34。在其它實施例中，對于具有天冬酰胺(Asn/N)殘基及/或谷氨酰胺(Gln/Q)殘基的本文所述的任何CNP肽及CNP變體，無論其是否具有野生型序列或非天然氨基酸序列，任何Asn殘基及/或任何Gln殘基均可獨立地經任何其它天然或非天然氨基酸取代，包括保守性取代，諸如Asn經取代為Gin。此等取代系部分地旨在最小化或避免天冬酰胺及/或谷氨酰胺發生任何可能脫酰胺作用。任何Asn殘基及/或任何Gln殘基均可獨立地經任何其它天然或非天然氨基酸取代(包括保守性取代，諸如Asn經取代為Gln)的CNP肽及變體的非限制性實例包括 wtCNP34、wtCNP37、Gly_wtCNP37、Pro_wtCNP37、Pro_Gly-wtCNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO 144)、Pro-GHKSEVAHRFK_wtCNP27(SEQ ID NO :188)、 PE012-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)及 PE024-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)。 在某些實施例中，本文所述的CNP肽及CNP變體的天冬酰胺殘基未經谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。在某些實施例中，本文所述的CNP肽及CNP變體的谷氨酰胺殘基未經天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。作為一非限制性實例，Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 145)的天冬酰胺殘基7及/或15可獨立地經任何其它天然或非天然氨基酸(包括谷氨酰胺)取代以避免天冬酰胺殘基脫酰胺為天冬氨酸或異天冬氨酸的任何可能性。在某些實施例中，Pro-Gly-wtCNP37的天冬酰胺殘基7及/或 15未經谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。然而應了解，本文包括如下CNP變體其中任一或多個(至多所有)易于發生脫酰胺或類脫酰胺反應(例如異構化)的殘基均可經由脫酰胺或類脫酰胺反應以任何程度(依據轉化的殘基，至多轉化100%)轉化為其它殘基。在某些實施例中，本文包括CNP變體，其中(1)任一或多個(至多所有)天冬酰胺(Asn/N)殘基可經由脫酰胺作用轉化為天冬氨酸或天冬氨酸鹽，及/或轉化為異天冬氨酸或異天冬氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% ；或(2)任一或多個(至多所有)谷氨酰胺(Gln/Q)殘基可經由脫酰胺作用轉化為谷氨酸或谷氨酸鹽，及/或轉化為異谷氨酸或異谷氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約5 %、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(3)任一或多個(至多所有)天冬氨酸或天冬氨酸鹽(Asp/D)殘基可經由類脫酰胺反應(亦稱為異構化)轉化為異天冬氨酸或異天冬氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約 5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(4)任一或多個(至多所有)谷氨酸或谷氨酸鹽(Glu/E)殘基可經由類脫酰胺反應(亦稱為異構化)轉化為異谷氨酸或異谷氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約5%、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(5)上述各項的組合。作為一非限制性實例，本文包括CNP變體，其中Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKG ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO :145)的任一或多個(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經由脫酰胺或類脫酰胺反應分別轉化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、(2)谷氨酸/谷氨酸鹽及/或異谷氨酸/異谷氨酸鹽、( 異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或(4)異谷氨酸/異谷氨酸鹽，如上所述，依據轉化的殘基，至多轉化約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90% 或 100%。作為另一實例，本文包括CNP變體，其中ftx)-Gly-(SEQ ID NO :145)的任一或多個 (至多所有)天冬酰胺及 / 或 wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC]天冬氨酸殘基可經由脫酰胺或類脫酰胺反應分別轉化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、及/或( 異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作為另一實例，本文包括CNP 變體，其中 Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :75)]的任一或多個(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經由脫酰胺或類脫酰胺反應分別轉化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、( 谷氨酸/谷氨酸鹽及/或異谷氨酸/異谷氨酸鹽、(3)異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或(4)異谷氨酸/異谷氨酸鹽，依據轉化的殘基， 至多轉化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作為又一實例，本文包括CNP 變體，其中 wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLD RIGSMSGLGC(SEQ ID NO60)]的任一或多個(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及 /或谷氨酸殘基可經由脫酰胺或類脫酰胺反應分別轉化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/ 或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、( 谷氨酸/谷氨酸鹽及/或異谷氨酸/異谷氨酸鹽、(3) 異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或(4)異谷氨酸/異谷氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作為另一實例，本文包括CNP變體，其中HSA-wtCNP27嵌合體GHKSpAHRFKGApK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 144)的任一或多個(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經由脫酰胺或類脫酰胺反應分別轉化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、(2)異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或( 異谷氨酸 /異谷氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約5 %、10%、20 %、30%、40 %、50%、60 %、70%、 80%、90% 或 100%。作為又一實例，本文包括CNP變體，其中Pro-HSA-wtCNP27嵌合體PGHKSgVAHRFKG ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :188)的任一或多個(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸殘基可經由脫酰胺或類脫酰胺反應分別轉化為(1)天冬氨酸/天冬氨酸鹽及/或異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽、(2)異天冬氨酸/異天冬氨酸鹽，及/或( 異谷氨酸/異谷氨酸鹽，依據轉化的殘基，至多轉化約5^^10^^20^^30^^40^^50^^60%, 70%、80%、90% 或 100%。另外，本文包括CNP變體，其中任一或多個(至多所有)甲硫氨酸(Met/M)殘基可氧化為任何化學上可行的氧化形式(例如亞砜及/或砜)，依據氧化的殘基，至多轉化約 5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。在另一實施例中，CNP變體包含CNP22或其變體在N端及/或C端偶聯至有助于變體移位穿過細胞膜或細胞障壁的部分。在一實施例中，CNP變體在N端及/或C端偶聯至有助于輸送變體穿過細胞膜或細胞障壁(包括經由活性肽轉運體)的肽序列。在另一實施例中，使CNP22或其變體的N端及/或C端偶聯至化學部分，諸如天然及/或合成聚合物，以將經修飾的CNP肽的總質量增加至本文一般描述的范圍，例如約 2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的范圍。在一實施例中，化學部分為生物兼容性親水性或水溶性天然(例如肽、碳水化合物)或合成(例如PEG(或PEO))聚合物。在另一實施例中，使CNP22或其變體的N端及/或C端偶聯至PEG (或ΡΕ0)聚合物以產生特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或7kDa)的總質量。CNP22或其變體的聚乙二醇化旨在尤其降低免疫原性及藉由降低腎清除率及增強蛋白酶抗性來提高半衰期。PEG部分可連接至本文所述的CNP22或任何變體的N端及/或 C端，該變體包括(但不限于)CNP-17 (CNP22的Cys6_Cys22環化部分)、CNP37，及CNP17、 CNP22或CNP37的具有N端及/或C端氨基酸延伸、氨基酸取代及/或氨基酸缺失的變體。在一實施例中，CNP17、CNP22或CNP37或其變體的Lys4及/或LyslO殘基經側鏈上不含反應性伯胺的天然或非天然氨基酸(例如Arg、Gly, Ser, Gin、Glu或Cit)或肽模擬物取代， 以排除此等賴氨酸殘基的任何可能的聚乙二醇化。在一實施例中，CNP肽的Lys4及/或 LyslO殘基經Arg取代。在另一實施例中，LyslO殘基未經Arg取代。在另一實施例中，具有PEG(或ΡΕ0)部分及位于N端的氨基酸延伸的CNP變體(包括CNP22及其變體)在緊接于對應于CNP22的Glyl的位置之前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP變體經設計為增強對NEP降解的抗性、減少與血清白蛋白的結合及增強CNP功能活性(例如活化cGMP信號傳導)。聚乙二醇化CNP變體的非限制性實例包括 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :36)、PE024-GANRR-CNP22(SEQ ID NO 36)、PE012-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO 36)、PE024-GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :37)、PE012-GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :37)、PE024-GANPR-CNP22(SEQ ID NO :37)、PEOl2-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO 37), PE024-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、PE012-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、 PE024-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、 PE024-ER-CNP22 (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (SEQ ID NO :39)、PE024-R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :41)、PE012-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :41)、PE024-R-CNP22 (SEQ ID NO :41) 及 PE012-R-CNP22 (SEQ ID NO :41)，其中 PE024 為單分散性 1. 2kDa PEG 聚合物且 PEO12 為單分散性0. 6kDa PEG聚合物。在一實施例中，PEG(或ΡΕ0)聚合物系偶聯至CNP變體的N 端。本文包括使用以下方面可不同的親水性或水溶性聚合物(例如PEG)類型(例如同聚物或共聚物；隨機共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；線性或分支；單分散或多分散)、 鍵聯(例如可水解鍵聯或穩定鍵聯，諸如酰胺、亞胺、胺、亞烷基或酯鍵)、偶聯位點(例如在 N端及/或C端，較佳不在CNP的環化區(對應于CNP22的殘基6-2 中任何殘基處)，及長度(例如約0. 2、0. 4或0. 6kDa至約2、3、4或5kDa)。親水性或水溶性聚合物可藉助于此項技術中已知的基于N-羥基丁二酰亞胺(NHS)或基于醛的化學或其它化學偶聯至CNP肽。此等CNP變體可使用以下產生例如wtCNP22(2. 2kDa)、僅保留wtCNP22的環化區(殘基6_22) 的CNP17、在CNP22或CNP17的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP變體，或具有氨基酸取代、添加及 / 或缺失的變體，諸如 GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、GANPR_CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、R-CNP22 (SEQ ID NO :40)、R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :41)、ER-CNP22 (SEQ ID NO 38)及ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :39)。在一實施例中，總質量的特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6或7kDa)的PEG-CNP變體含有經由基于NHS 或基于醛的化學偶聯于N端及/或C端的單分散性線性PEG (或ΡΕ0)部分，經由基于NHS 的化學偶聯于N端及/或C端的兩臂或三臂分支PEG部分。本文亦包括經設計以降低腎清除率的帶負電PEG-CNP變體，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物(Caliceti， Adv. Drug Deliv. Rev.(高等藥物傳遞綜述)，55 :1洸1_77 Q003) ；Perlman, J. Clin. Endo. Metab.(臨床內分泌代謝雜志)，88 :3227-35(2003) ；Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo. ,29 440-444(1986) ；Vehaskari,Kidney Int，1 (國際腎臟)，22 :127-135 (1982))。在一實施例中，PEG (或ΡΕ0)部分含有羧基、硫酸根及/或磷酸根。在另一實施例中，本文所述的偶聯至CNP變體的N端、C端及/或內部位點的PEG(或ΡΕ0)部分含有一或多個在生理條件下帶正電荷的官能基。此等PEG部分尤其旨在改良此等聚乙二醇化CNP變體于軟骨組織的分布。在一實施例中，此等PEG部分含有一或多個一級、二級或三級氨基、季銨基及/或其它含胺(例如脲)基團。在一實施例中，本文包括經由基于NHS或基于醛的化學偶聯至式(CH2CH2O)nW PEG (或ΡΕ0)的CNP22或其變體，其中η為約6至約100的整數，且PEG聚合物為約0. 3kDa 至約5kDa。在另一實施例中，η為約12至約50的整數，且PEG聚合物為約0. 6kDa至約 2. 5kDa。在另一實施例中，η為約12至約對，且PEG聚合物為約0. 6kDa至約1.2kDa。在又一實施例中，PEG聚合物的末端羥基經非反應性基團封端。在一特定實施例中，封端基團為烷基，例如低級烷基，諸如甲基。在另一實施例中，本文提供具有一或多個對肽酶(包括中性內肽酶(NEP))切割的敏感性降低的肽鍵或肽鍵等構物的CNP變體。NEP為切割較大疏水性殘基的氨基端的底物肽鍵的膜結合鋅依賴性內肽酶。因此，將NEP的切割位點處的肽鍵修飾為非天然肽鍵或非肽鍵可排除NEP切割或降低NEP切割的效率。對于ANP及CNP，報導NEP切割首先發生于環化區內的CyS6_Phe7鍵，接著發生于遍及結構的其余部分的其它處。對于BNP，報導切割首先發生于肽N端，接著發生于環狀結構內。盡管報導CNP上的主要NEP切割位點為Cys6-Phe7鍵，但當將wtCNP22于活體外暴露于NEP消化維持2. 5分鐘時，所有可能位點均意外水解，其中Cys6-Phe7及Gly8_Leu9肽鍵略微最不穩定，如實例2中所述。NEP的底物特異性主要由兩個底物結合子位點Si，及S2’決定(Oefner等人， J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)296 :341-349 (2000))。Sl，位點接受N端肽鍵經受水解的較大疏水性ΡΓ殘基(例如Phe,Leu.Ile及Met)。S2，位點一般優選稱為P2，的較小殘基 (例如Gly或Ser)。在CNP的情況下，報導Phe7為NEP Si，位點的較佳Pl，殘基，而Gly8 為S2’位點的較佳P2’殘基。由于此兩個子位點一起僅可容納特定總側鏈尺寸，因此CNP 的ΡΓ -P2’殘基的總尺寸的任何增大可能會潛在地破壞NEP結合。舉例而言，將氯原子添加于Pl，Phe7芳族環的3位(亦即3-Cl-Phe7)可潛在地修飾CNP與NEP切割位點(例如在Si’子位點)之間的相互作用(例如使這些相互作用不穩定)。將叔丁基添加至較小P2’ 殘基GlyS (亦即tBu-Gly8)可潛在地破壞CNP與S2’子位點之間的相互作用。因此，在一實施例中，本文的CNP變體包括ΡΓ -P2，殘基(諸如Wie7-Gly8)尺寸增大以干擾活性位點處的底物識別，從而降低對NEP切割的敏感性的CNP。天然氨基酸、非天然氨基酸及/或肽模擬物部分可取代一或多個較大ΡΓ疏水性殘基(包括(但不限于) Phe7、Leu9、Leull、Ilel4、Metl7&Leu20)及/或一或多個較小P2，殘基(包括(但不限于)Cys6、Gly8、Glyl5、Serl6 及 Glyl9)。本文包括在至少一個牽涉于底物識別及/或NEP切割的殘基處包含至少一個經修飾氨基酸及/或至少一個經修飾肽鍵的CNP變體，其中這些經修飾氨基酸及經修飾肽鍵可為天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模擬物及/或肽鍵等構物。在一實施例中，CNP上在Cys6 與Wie7之間的NEP切割位點經修飾。在一相關實施例中，Cys6與Wie7之間的肽鍵(_C(= 0)-ΝΗ-)經一個以下肽鍵等構物置換-CH2-NH-,-C( = O)-N(R)-，其中酰氨基系經任何以下R基團烷基化甲基、乙基、正丙基、異
62丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S (0) n_，其中 η 為 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-，-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，或-NHC ( = 0)ΝΗ-ο在另一實施例中，CNP變體系由下式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5- (b) 6_ (c) 7~ (d) 8-Leu9-LyS10-Leu11-Asp12-Arg13-I Ie H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :90)，其中(χ)及(ζ)獨立地可不存在或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，例如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列(Wang等人，Adv. Drug Delivery Rev.，57 1049-76 (2005))；降低腎清除率的聚合分子及非聚合分子，諸如帶負電PEG ；及藉由使CNP變體的總質量增至本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. 8kDa至約6kDa或 7kDa)來增強CNP變體對NEP降解的抗性的天然聚合物(例如含有氨基酸、脂肪酸及/或碳水化合物的天然聚合物)及合成聚合物(例如PEG)；(b)及(c)可為野生型Cys6及Wie7、另一天然氨基酸或非天然氨基酸，或可含有如本文所述的肽鍵等構物以增強對NEP切割的抗性；且(d)可為野生型Gly8，或可為較大天然或非天然(例如t-Bu-Gly)氨基酸或肽模擬物以減少與NEP的結合。在一實施例中，此等CNP變體在(b)、(C)及/或(d)處含有至少一個經修飾氨基酸。即使CNP22或其變體在CyS6_Phe7具有抗NEP的肽鍵或肽鍵等構物，但CNP內的其它肽鍵(包括 Gly8-Leu9、Lysl0-Leull、Argl3_Ilel4、Serl6-Metl7 及 Glyl9-Leu2O 鍵) 亦可能會被切割。因此，本文包括除Cys6-Phe7鍵外亦在一或多個其它NEP切割位點具有肽鍵等構物的CNP變體，其中這些肽鍵等構物包括本文所述者。在另一實施例中，本文包括在Cys6及/或Cys22具有半胱氨酸類似物(包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、2-巰基丙酸及3-巰基丙酸)的CNP變體。在一實施例中，此等CNP變體具有由野生型Cys6或類似物與Cys22或類似物之間的二硫鍵所形成的環狀域。在另一實施例中，CNP22或其變體的一或多個殘基(至多所有殘基)經D-氨基酸取代。以D-氨基酸取代L-氨基酸基本上將側鏈自其原始位置移動約120度，藉此可能破壞CNP肽與NEP的結合。在一特定實施例中，Phe7處的L-Phe經其D-對映異構體D-Phe取代。在又一實施例中，β氨基酸(諸如3-氨基-2-苯基丙酸(或2-苯基-β-丙氨酸))置換野生型α-氨基酸I^e7。使用氨基酸將肽主鏈長度有效增加一個亞甲基單元。蛋白酶抗性可因底物構型的變化或氨基酸側鏈之間的距離增加而引起。具有非天然α -氨基酸、β -氨基酸或肽鍵等構物的CNP22變體的非限制性實例包括GLSKGC (CH2NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (類似物 A) (SEQ ID NO 56)、GLSKGC- (N-Me-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 B) (SEQ ID NO 57)、GLSKGC- (D-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 E) (SEQ ID NO 136)、GLSKGCF- (tBu-Gly) -LKLDRIGSMSGLGC (類似物 F) (SEQ ID NO 58)、GLSKGC- (3_Cl_Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 G) (SEQ ID NO 137)，及GLSKGC-[NHCH2CH(Ph) CO] -GLKLDRIGSMSGLGC (類似物 H，使用 3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO :59)。在另一實施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. SkDa至約6kDa或7kDa)的總質量，旨在增強對NEP降解的抗性，且這些變體由下式表示(x) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10- (g) H-Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :46)，其中(χ)及(ζ)獨立地可不存在或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；降低腎清除率的聚合及非聚合部分，諸如帶負電PEG ；含有例如氨基酸、疏水性酸及/或碳水化合物的聚合物；及合成親水性聚合物，諸如PEG;(a)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg ；(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位系經一或多個選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_1Q環烷基、雜環基、C6,芳基及雜芳基(實例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自Gly、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser, Thr 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu ；(f)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(f)不為Arg ；(g)選自Leu及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu ；
(h)選自Ile、tBu-Gly、及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(j)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu。在另一實施例中，CNP變體具有特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或 2. SkDa至約6kDa或7kDa)的總質量，旨在增強對NEP切割的抗性，且高等變體由下式表示(x) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) H-Asp12-Arg13- (h) 14-(i) 15-Ser16-(j) 17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :143)，其中(x)及(ζ)獨立地可不存在或可選自由以下組成的群合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；適用于靶向骨或軟骨的氨基酸序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白及其衍生物(諸如骨橋蛋白、骨鈣化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列； 降低腎清除率的部分，包括(但不限于)親水性或水溶性聚合物，諸如帶電PEG分子；及包含例如PEG、氨基酸、碳水化合物及/或疏水性酸的部分；(a)可為該位置的野生型Lys，或可經保守性氨基酸取代或在側鏈上不具有反應性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置換，其中在一實施例中，(a)為Arg ；(b)選自Cys、及Cys6與Phe7之間的肽鍵等構物，諸如Cys-CH2-NH ；(c)選自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe類似物， 其中Phe類似物的苯環的一或多個鄰位、間位及/或對位系經一或多個選自由以下組成的群的取代基取代商素、羥基、氰基、直鏈或支鏈Cp6烷基、直鏈或支鏈CV6烷氧基、直鏈或支鏈鹵基-Cp6烷基、C3_1Q環烷基、C6,芳基、雜環基及雜芳基(實例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe類似物的苯環可經另一芳基(非限制性實例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或雜芳基(非限制性實例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置換；(d)選自:Gly、叔丁基-Gly, Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)選自Leu、Ser, Thr 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Leu ；(f)選自Lys、Arg、Gly、6_ 羥基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln 及 Ser ；(g)選自Leu、Asn及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu ；(h)選自Ile、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Asn 及肽鍵等構物，諸如 N-Me-Ile ；⑴選自Gly、Arg、Ser 及 Asn ；(j)選自僅討、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及 2-氨基-異丁酸(Aib)； 且(k)選自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Arg、Thr、Ser及肽鍵等構物，諸如N-Me-Leu。為改良CNP變體傳遞至骨相關病癥(例如骨骼發育不良)的目標部位，可將CNP 變體連接(例如在N端及/或C端)至靶向骨/軟骨的部分。靶向骨/軟骨的部分的非限制性實例包括二磷酸鹽；羥基磷灰石；葡糖胺；膠原蛋白(例如X型膠原蛋白) ’聚Asp ；聚 Glu;及來源于骨蛋白(諸如骨織素、骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列。除較不易為NEP切割的外，CNP變體亦可能具有降低的對NPR-C清除受體的親和力，同時保留CNP功能性。除NEP介導的降解外，CNP22的半衰期亦受清除受體NPR-C 影響，該NPR-C與NPR-B的細胞外肽結合域共享58%的序列同源性。CNP22不僅緊密結合于NPR-B(7-30pM親和力)，而且亦緊密結合于NPR-C(ll_140pM) (Bennett, B. D.等人， J. Biol. Chem.(生物化學雜志)J66 :23060-67(1991) ；Koller K. J.及 Goeddel，D. V.， Circulation (循環)，86 :1081-88(1992) ；Suga, S.等人，Endocrinology (內分泌學)，130 229-39 (1992))。盡管NPR-B晶體結構尚有待報導，但NPR-C與NPR-A晶體結構之間的序列同源性以及相似性(He，X. -L.等人，Science (科學)，四3(55；35) :1657-62(2001) ；Ogawa, H.等人，J. Biol. Chem.(生物化學雜志)，279 Q7) :28625-31(2004) ；He, X.-L.，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，361(4) :698-714(2006))表明NPR-B可能呈現類似的總體結構折迭。因此，依據基于結構的序列比對及以下相關系統的結晶結構來建立NPR-B同源性模型結合于NPR-C的CNP、結合于NPR-A的ANP，及結合于NPR-C的ANP (He，X. -L.等人， Science (科學)，293(5535) :1657-62(2001) ；Ogawa, H.等人，J. Biol. Chem.(生物化學雜志)，279 07) =28625-31(2004) ；He，X.-L.，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，361 (4) 698-714 Q006))。依據受體似乎決定所結合肽的構型，且就一級結構及功能特性而言NPR-B 最接近類似于NPR-A的觀察結果，以NPR-A/ANP晶體結構作為模型來建立NPR-B/CNP同源性模型。使用公開的CNP變體的信號傳導數據(美國專利第5，434，133號及美國專利申請公開案第2004/0138134A1號)及不再結合于NPR-C的功能性ANP變體的信號傳導數據 (Cunningham, EMBO 13 (11) 2508-15，1994)來改進及解釋 NPR-B/CNP 模型。本文包括依據NPR-B/CNP復合物的基于同源性的結構模型，經設計以改良NPR-B 選擇性的CNP變體。組合結合于各種受體的利鈉肽的實驗及計算結構數據與公開的功能性數據，產生仍舊結合于NPR-B但可潛在地降低對NPR-C清除受體的親和力的CNP變體。舉例而言，NPR-C在環結構中于肽結合位點中具有獨特插入，從而使得與NPR-A及NPR-B中的各別環殘基相比，該NPR-C的環殘基處于更靠近諸如CNP Gly8(或ANP Gly9)的肽殘基的位置。早期研究表明，ANP中的G9T突變有助于降低對NPR-C的親和力，藉此改良NPR-A選擇性(Cunningham，EMBO J. ,13(11) :2508-15 (1994))。因此，產生 CNP 變體以用較大殘基 (Ser, Val、Thr或Asn)置換相應Gly8殘基，以在不影響CNP與NPR-B的結合的情況下，破壞其與NPR-C的結合。此外，依據對受體/肽復合物的詳細結構分析，將一或多個突變引入預期與受體特異性殘基相互作用的CNP的C端(包括Glyl5至Gly21)。舉例而言，CNP22 中的G19R突變不會引起NPR-B信號傳導活性的顯著損失。然而，不能在不改變鄰近殘基的構型的情況下，于NPR-C/CNP的可用晶體結構中模擬此突變。此等觀察結果表明，G19R突變可能會選擇性破壞CNP與特定受體(諸如NPR-C)的結合。在一實施例中，CNP變體在位置1、5、8、15、19及21的一或多個Gly位點具有取代， 以降低構型柔性且藉此增強受體特異性。對結合于NPR-C及NPR-A的ANP的晶體結構的比較分析(0gawa,H.等人，J. Biol. Chem.(生物化學雜志),279 =28625-31 (2004) ；He,X. -L.，J. Mol. Biol.(分子生物學雜志)，361 =698-714 (2006))表明ANP的構型柔性可在決定受體選擇性方面起到重要作用。在一實施例中，對NPR-C的親和力可能降低的功能性CNP變體具有一或多個以下氨基酸取代GlR、GlE、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、 L20S、G21S、G21T 及 G21R。在一實施例中，CNP 變體在位置 1、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、
20及/或21具有多點取代，且可視情況在變體的肽序列的任何其它位置具有修飾。在另一實施例中，可將本文所述的CNP變體在N端、C端及/或內部位點偶聯至部分，直至總質量的特征在于本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa或2. SkDa至約6kDa或 7kDa)，以有助于靶向骨/軟骨、降低NPR-C及腎清除率、增強對NEP降解的抗性，及/或改良CNP功能性。在一實施例中，CNP變體未在環狀區域(對應于CNP22的Cys6至Cys22) 內的位點偶聯至聚合部分。可偶聯至CNP變體的聚合或非聚合部分的非限制性實例包括合成骨靶向化合物，諸如二磷酸鹽；骨/軟骨靶向肽序列，諸如聚Asp及聚Glu ；來源于骨蛋白 (諸如骨橋蛋白、骨鈣化素及涎蛋白)的骨靶向域的肽序列；來源于骨形態發生蛋白(諸如 BMP2、BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a)的功能域的肽序列；來源于利鈉來源的多肽(例如NPPC、 ANP及BNP)的肽序列；其它天然聚合或非聚合部分，諸如碳水化合物、脂肪酸及磷脂；生物兼容性合成親水性聚合物，諸如PEG (或ΡΕ0)；疏水性聚合或非聚合部分，諸如庚酸及戊酸； 及其組合。例如就刺激cGMP產生及信號傳導而言，本文所述的CNP變體可具有與CNP22相比實質上類似或更佳的功能活性。在一實施例中，CNP變體于活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22 (例如1 μ Μ)下所產生的cGMP量的至少約50%。在某些實施例中，CNP 變體保留野生型CNP22活體外或活體內的cGMP刺激活性的至少約50%、60%、70%、80%、 90 %、95 %或100 %。在另一實施例中，與CNP22相比，CNP變體具有改良的cGMP刺激活性。 在某些實施例中，CNP變體于活體外或活體內刺激產生在相同濃度wtCNP22(例如1 μ m)下所產生的 cGMP 量的至少約 110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、 400%、450%、500% 或更高。本文中視情況排除本文中所參考的任何先前公開案中特定揭示的任何利鈉(例如CNP)肽、片段及變體，及實際產生的任何利鈉(例如CNP)肽、片段及變體，這些先前公開案包括(但不限于):U. S. 5，434，133、U. S. 6，034，231、U. S. 6，020，168、U. S. 6，743，425、 U. S. 7，276，481、WO 94/20534、WO 02/047871、WO 2005/098490、WO 2004/047871、EP 0497368,EP 0466174，及 Furuya 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm.(生物化學生物物理通訊)183 :964-969(1992)).所有此等文獻均以全文引用的方式并入本文中。在一實施例中，本文視情況排除所有已知野生型CNP-53、野生型CNP-22、野生型CNP-17、野生型BNP及人類來源及非人類來源的野生型ANP。舉例而言，在一實施例中，本文視情況排除人類CNP-17、人類CNP-22、雞CNP_22(對應于hCNP-22 (Leu9Val))、 鱒魚及鰻魚 CNP-22 (對應于 hCNP-22 (Leu2Trp、Ser3Asn、Lys4Arg))、蛙 CNP22-I (對應于 hCNP-22 (Leu2Tyr、Lys4Arg、Leu9Val、Serl6Ala、Metl7Phe))、蛙 CNP22-II (對應于 hCNP-22 (Leu2Thr、Serl6Ala))、人類 CNP-53，及豬及大鼠 CNP-53 (對應于 hCNP-53(Glnl7HiS、Ald8Gly))。在另一實施例中，本文視情況排除藉由在人類及非人類動物中活體內蛋白水解切割產生的NPPC、原CNP及CNP-53的片段。在另一實施例中，本文視情況排除野生型人類CNP-53的以下截短片段CNP-50、CNP-46、CNP-44、CNP-39、CNP-30、 CNP-29、CNP-28、CNP-27 及 CNP-26。在另一實施例中，本文視情況排除自鯊魚物種皺唇鯊(Triakis scyllia)及小點貓鯊(Scyliorhinus canicula)分離或搜尋到的CNP肽及其片段(例如參看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454(1994))，其包括RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :204)；LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :205)；KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :206)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :207)。在另一實施例中，本文視情況排除自鯊魚物種鼠鯊(Lamna ditropis)分離或搜尋到的CNP肽及其片段(例如參看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454 (1994))，其包括RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :208)；LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :209)；KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :210)；FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :211)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :212)。在又一實施例中，本文視情況排除自鯊魚物種白斑角鯊(Squalus acanthias)分離的CNP肽及其片段(例如參看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454 (1994))，其包括RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :213)；及 GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :214)。在另一實施例中，本文視情況排除自青鏘(medaka)及河豚(puffer fish)分離的 CNP 肽，其在 K. Inoue 等人，Proc. Nat. Acad. Sci.，100 (17) 10079-10084 (2003)中命名為 ” CNP-I ”、” CNP-2 ”、” CNP-3 ” 及” CNP-4 ” GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (青鏘及河豚 CNP-1) (SEQ ID NO :215)；PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC (青鏘 CNP-2) (SEQ ID NO :216)；GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC (河豚 CNP-2) (SEQ ID NO :217)；GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC (青鏘 CNP-3) (SEQ ID NO :218)；GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC (河豚 CNP-3) (SEQ ID NO :219)；GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (青鏘 CNP-4) (SEQ ID NO :220)；及GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (河豚 CNP-4) (SEQ ID NO :221)。在另一實施例中，本文視情況排除自鴨嘴獸(platypus)毒液分離的CNP_39 及其 CNP-22 片段，其在 G. de Plater 等人，Toxicon.，36 (6) :847-857(1998)中命名為” ovCNP-39” 及” ovCNP-39 (18-39) ” LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39)(SEQ ID NO 222)；及GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39(18-39)(SEQ ID NO :223)。在另一實施例中，本文視情況排除以下如US 2007/0197434中特定揭示的肽Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Met-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :224)；
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :225)；Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Ala-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :226)；Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-M et-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :227)；Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-S er-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO :228)；及Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-A sn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO :229) 在另一實施例中，本文視情況排除US 2007/0197434中一般性揭示的SEQ ID NO: 10的肽，其中此等肽為在位置4、5、6、11、12、14及/或15具有特定天然氨基酸取代的 CNP-17變體。在又一實施例中，本文視情況排除對應于以下的肽hCNP-53 6er47Ala)、 hCNP-53(Met48Gln)、hCNP-53 (Met48Ala)及 hCNP-53(C 端)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr 在一實施例中，本文視情況排除如US 7,276,481中特定揭示的SEQ ID NO :1_4 及6-71的肽。在另一實施例中，本文視情況排除US 7，276，481中一般性揭示的SEQ ID NO 5 的肽，其中此等肽為在 Leu9、LyslO、LeulU Serl6、Metl7、Glyl9 及 / 或 Leu20 具有至少一個天然氨基酸取代的CNP17變體。在又一實施例中，視情況排除CNP17或其變體含有N-Me-Phe7或N-Me-Phe7及N-Me-Leull的CNP17變體。在另一實施例中，本文視情況排除融合或偶聯至生長激素(GH)、類胰島素生長因子I(IGF-I)或甲狀腺激素(TH)的如US 7，276，481中揭示的SEQ ID NO :5的CNP17變體。在另一實施例中，視情況排除CNP22融合至GH、IGF-I或TH或經由接頭(例如肽接頭)連接至GH、IGF-I或TH的CNP22變體。在又一實施例中，視情況排除CNP17或其變體在N端或C端偶聯至生物素或熒光素的CNP17變體。在另一實施例中，本文視情況排除如US 5，434，133中特定揭示的化合物第1_27 號及SEQ ID N0:l-17、22-24、30、31及40-42的肽。在另一實施例中，本文視情況排除US 5，434，133中一般性揭示的SEQ ID NO :18-21及25-29的肽。在又一實施例中，本文視情況排除如WO 94/20534中特定揭示的SEQ ID NO :1_4及9的肽。然而，在一些實施例中，本文仍包括本文中視情況排除的利鈉(例如CNP)肽、片段及變體的使用方法，以及包含此等利鈉(例如CNP)肽、片段及變體的醫藥組合物(包括無菌醫藥組合物)。C. CNP變體的合成及純化在一些實施例中，本文所述的CNP變體藉由重組表達，使用此項技術中已知的某些技術(在某些實施例中)來產生。例如參看Sambrook，Fritsch及Maniatis，Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實驗手冊)，第2版。冷泉灣實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)) ；DNA Cloning A Practical Approach (DNA 克隆實驗方法)，第 I 及第 II 卷，D. N. Glover 編(1985)；及 Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學目前方法)，John Wiley&Sons, Inc. (1994)。
在某些實施例中，藉由重組方法產生本文所述的CNP變體，該重組方法包含將包含編碼CNP變體多肽的第一多核苷酸連接至編碼切割可切割肽或蛋白質的第二多核苷酸的宿主細胞在培養基中在使得由這些多核苷酸編碼的融合多肽得以表達的條件下培養，其中該融合多肽包含CNP變體多肽直接連接至切割可切割肽或蛋白質或經由接頭與其間接連接。在一些實施例中，用包含編碼CNP變體多肽的多核苷酸連接至編碼切割可切割肽或蛋白質的多核苷酸的表達載體來轉化宿主細胞。在某些實施例中，融合多肽表達為可溶蛋白質或包涵體。可自宿主細胞或培養基分離所表達的融合多肽，且可使經分離的融合多肽與切割切割劑接觸以釋放CNP變體。用以產生CNP變體的宿主細胞可為細菌、酵母、昆蟲、非哺乳動物脊椎動物或哺乳動物細胞。細菌細胞包括(但不限于)大腸桿菌(E.coli)細胞株及菌株。大腸桿菌細胞株及菌株的非限制性實例包括BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 (DE3)pGro7、 ArcticExpress (DE3)、C41 [亦稱作 C41 (DE3) ]、C43 [亦稱作 C43 (DE3) ]、Origami B (DE3)、 Origami B (DE3) pLysS、KRX 及 I\mer (DE3)。在一實施例中，使用 BL21 (DE3)細胞來產生 CNP 變體及CNP融合蛋白。哺乳動物細胞包括(但不限于)倉鼠、猴、黑猩猩、犬、貓、牛、豬、小鼠、大鼠、兔、綿羊及人類細胞。宿主細胞可為永生化細胞(細胞株)或非永生化(原生或次生)細胞，且可為多種細胞類型中的任一種，諸如(但不限于)成纖維細胞、角質細胞、上皮細胞(例如乳腺上皮細胞、腸上皮細胞)、卵巢細胞(例如中國倉鼠卵巢或CHO細胞)、內皮細胞、神經膠質細胞、神經細胞、血液的形成成分(例如淋巴細胞、骨髓細胞)、軟骨細胞及其它骨源性細胞，及此等體細胞類型的前體。在適于細胞生長、表達DNA或RNA及鑒別/ 選擇表達CNP變體的細胞的條件下培養含有CNP變體DNA或RNA的宿主細胞。在一些實施例中，使宿主細胞在約10°C至約40°C，或約20°C至約40°C，或約30°C 至約40°C的溫度下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞在約20°C、22°C、 25 °C ,28 30 °C、35°C或37 °C下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞在約 35°C或37°C下生長或培養一段時間。使編碼CNP變體多肽(包括CNP融合蛋白)的重組多核苷酸于包含含有表達控制序列可操作地連接至待表達核苷酸序列的重組多核苷酸的表達載體中表達。表達載體包含足夠用于表現的順式作用組件；其它用于表達的組件可由宿主細胞或活體外表達系統供應。表達載體包括此項技術中已知的所有表達載體，包括(但不限于)黏質體、質體(例如裸質體或含于脂質體中的質體)及并有重組多核苷酸的病毒。經由轉化或轉染將表達載體插入適當宿主細胞中以便表達編碼多肽的多核苷酸(例如參看Sambrook等人(同上文))。預期用于產生CNP變體(包括可切割CNP融合蛋白)的表達載體的非限制性實例包括 pjexpress、pjexpress401、pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、 pET-32a、pET-41a、pMAL、pMAL_c2X、pQE-30、pET-SUMO 及 pTYBll。特定構建體的表達可產生呈包涵體形式的可溶CNP變體(包括CNP融合蛋白)或不可溶CNP變體(包括CNP融合蛋白)。在一些實施例中，使用異丙基β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導性載體來增強編碼CNP變體或CNP融合蛋白的多核苷酸的表達。在一些實施例中，使宿主細胞在IPTG 存在下，在約10°C至約40 V，或約20 V至約40 V，或約30 V至約40 V的溫度下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞在1 16存在下，在約201、221、251、281、301、35°C或37°C下生長或培養一段時間。在某些實施例中，使宿主細胞，在ImM IPTG存在下，在約35°C或37°C下生長或培養一段時間。在其它實施例中，使宿主細胞與濃度為約0. 4mM至約2mM，或約0. 4mM至約1. 5mM, 或約0. 4mM至約ImM的IPTG—起培養。在某些實施例中，IPTG濃度為約0. 4,0. 5,0. 6,0. 7、 0. 8,0. 9、1、1. 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9 或 2mM。在一實施例中，IPTG 濃度為約 ImM。在某些實施例中，本文所述的CNP變體重組表達為包含CNP變體多肽及可切割載體蛋白或可切割標簽(例如肽標簽)的融合蛋白，其中該融合蛋白包含CNP變體多肽直接連接至可切割載體蛋白或標簽或經由接頭與其間接連接。使用載體蛋白或標簽有助于例如檢測、分離及/或純化融合蛋白。可切割載體蛋白及標簽包括(但不限于)組氨酸(例如六His)標簽；人類轉錄因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12 (C/A)、TAF12 (D/E)、TAF12 (4D/4E)、TAF12 (6D/6E)、TAF12 (10D/10E)、 TAF12 (C/A 及 D/E)、TAF12 (C/A 及 4D/4E)、TAF12 (C/A 及 6D/6E)、TAF12 (C/A 及 10D/10E)； 酮類固醇異構酶(KSI)；麥芽糖結合蛋白(MBP) ； 半乳糖苷酶(β-Gal)；谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)；硫氧還蛋白(Trx)；殼多糖結合域(CBD) ；ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-2突變體、ΒΜΡ-2 (C/A)； SUMO ；及其突變體及片段。表達構建體可表達包含CNP變體及載體蛋白或標簽的融合蛋白。標簽可為賦予融合蛋白適用特性的氨基酸序列。在一實施例中，標簽為配位體結合域，其可用以藉由將融合蛋白施加至含有該配位體的分離介質來純化融合蛋白。舉例而言，可將包含谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)域的融合蛋白施加至含有連接有谷胱甘肽的分離介質的層析管柱。作為另一實例，可將包含麥芽糖結合蛋白(MBP)作為標簽的融合蛋白施加至含有麥芽糖的分離介質。作為另一實例，可將包含聚組氨酸標簽的融合蛋白施加至鎳柱，藉此聚組氨酸標簽螯合于鎳柱有助于純化融合蛋白。在另一實施例中，標簽為配位體。舉例而言，融合蛋白可包含谷胱甘肽作為標簽且施加至含有連接有谷胱甘肽-S-轉移酶的分離介質的層析管柱。適用于融合蛋白的載體蛋白及標簽的非限制性實例包括(但不限于)人類轉錄因子 TAF12(TAF12)、酮類固醇異構酶(KSI)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、 谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、硫氧還蛋白(Trx)、殼多糖結合域(CBD)、BMP_2突變體(BMPM)、 SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白Α、鏈球菌蛋白、淀粉結合蛋白、內葡聚糖酶A的纖維素結合域、外葡聚糖酶Cex的纖維素結合域、生物素結合域、recA, Flag、聚(His)、聚(Arg)、聚 (Asp)、聚(Gin)、聚(Phe)、聚(Cys)、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、抗體表位，及其突變體及片段。為產生目標CNP變體，載體蛋白或標簽可藉助于化學切割、蛋白酶切割或切割蛋白質自切割自融合蛋白切割。例示性化學及蛋白水解切割切割劑(切割位點在括號中)包括(但不限于)甲酸(Asp-Pro)、溴化氰(CNBr) (Met-X)、羥胺(Asn-Gly)、因子 fe(IEGR-X) (SEQ ID NO :230)、腸激酶(DDDDK-X) (SEQ ID NO 231), ProTEV(EXXYXQ-G) (SEQ ID NO: 232)，及SUMO蛋白酶。由于特定種類化學切割的性質，因此使用甲酸來進行切割可產生 Pro-CNP, CNBr可產生Met經取代為Asn的CNP，且羥胺可產生Gly-CNP。或者，藉由使用不表達為融合蛋白的CNP變體的特定構建體(例如pET-21a-CNP)，可避免化學或蛋白酶切割。 pET-21a-CNP的表達可產生Met-CNP。或某些融合蛋白(例如含有內含肽CBD的融合蛋白)可經歷自切割來產生CNP。在其它實施例中，融合蛋白在CNP變體與載體蛋白或標簽(例如肽標簽) 之間包含切割可切割肽接頭。在某些實施例中，切割可切割肽接頭選自Asp-Pro、 Asn-Gly、Met-X、Val-Asp-Asp-Arg (SEQ ID NO 233), Gly-Ser-Asp-Arg (SEQ ID NO: 234)、Ile-Thr-Asp-Arg(SEQ ID NO :235) , Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO :236)、 Ile-Glu-Gly-Arg-X(SEQ ID NO :230) , Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X (SEQ ID NO :231)、 Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly(SEQ ID NO :232), Ala-Phe-Leu-Gly-Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO 237)，及 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTCDDDDKHMD (pET_15b 接頭)(SEQ ID NO :95)，其中 X 表示氨基酸。在一些實施例中，切割可切割肽接頭系藉由選自由以下組成的群的切割切割劑切割鈀、溴化氰(CNBr)、甲酸、羥胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、羧肽酶、腸激酶(腸肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子)(a蛋白酶、枯草桿菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、變種枯草桿菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人類I^ace蛋白酶、膠原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白質炎病毒2Apro蛋白酶、 脊髓灰白質炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皺胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、鈣蛋白酶、木瓜凝乳酶、無花果酶(無花果蛋白酶)、菠蘿酶(菠蘿蛋白酶)、組織蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、內切蛋白酶 Arg-C、內切蛋白酶Glu-C、內切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纖維蛋白溶酶。在某些實施例中，可切割載體蛋白、標簽(例如肽標簽)或肽接頭系使用甲酸來切割以自融合蛋白釋放CNP變體。在一些實施例中，甲酸濃度為約至約20%，或約至約15%，或約2%至約15%，或約至約10%，或約2%至約10%，或約至約5%，或約2%至約5%。在某些實施例中，甲酸濃度為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%、11%、12%、13%、14%或15%。在某些實施例中，甲酸濃度為約2%、5%或10%。在其它實施例中，在甲酸存在下，在約20°C至約80°C，或約30°C至約75°C，或約 40°C至約75°C，或約50°C至約75°C，或約50 V至約70 V，或約55°C至約70°C，或約50 V至約60°C的溫度下進行CNP融合蛋白切割。在一些實施例中，在甲酸存在下，在約20°C、22°C、 25°C、30°C、35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或 80°C下進行切割。在某些實施例中，在甲酸存在下，在約501、551、601、651或701下進行切割。在某些實施例中，在甲酸存在下，在約55°C或70°C下進行切割。在其它實施例中，甲酸存在下CNP融合蛋白的切割進行約3小時至約48小時，或約5小時至約48小時，或約5小時至約36小時，或約5小時至約M小時，或約5小時至約 18小時，或約20小時至約M小時，或約6小時至約10小時的時段。在某些實施例中，甲酸存在下的切割進行約5小時、6小時、12小時、15小時、18小時、20小時或M小時。在一些實施例中，CNP融合蛋白的切割在約2 %、5 %或10 %甲酸存在下，在約55°C 下進行約20小時至約36小時，或在約60°C下進行約15小時至約M小時，或在約65°C下進行約10小時至約21小時，或在約70°C下進行約6小時至約18小時。在某些實施例中， CNP融合蛋白的切割在約2%甲酸存在下，在約55°C下進行約20小時至約M或36小時，或在約60°C下進行約15小時至約M小時，或在約65°C下進行約10小時至約18小時，或在約70°C下進行約6小時至約10小時。本文提供使用甲酸來切割CNP融合蛋白以得到高CNP變體產率的溫和條件。本文所述使用甲酸來切割融合蛋白的條件亦適用于切割包含除CNP外的多肽或蛋白質的融合蛋白，其中這些融合蛋白含有Asp-Pro肽鍵。在其它實施例中，在CNP融合蛋白的化學切割(例如使用甲酸)或蛋白水解切割之前，先以緩沖液及/或去污劑處理可溶性CNP融合蛋白或CNP融合蛋白包涵體。緩沖液的非限制性實例包括B-PER II;經稀釋B-PER II (例如1/20稀釋度)；B-PER ;B_PER磷酸鹽緩沖液；含有Tris的緩沖液(例如25mM Tris, pH 7. 5)；含有Tris及NaCl的緩沖液(例如25mM TrisU50mM NaCl, pH 7.9)；及PBS。在一實施例中，緩沖液為B-PER II。去污劑的非限制性實例包括辛基蔗糖、Triton X-100、Tween-20、NP-40及CA-630。去污劑可位于緩沖液中(例如，含去污劑的25mM Tris緩沖液(pH 7.5))。在某些實施例中，去污劑為 Triton X-100 或 CA-630。應了解，上述任何方法及條件可與上述任何其它方法及條件組合使用來產生本文所揭示的CNP變體。在其它實施例中，本文所述的CNP變體系使用肽合成器合成且根據此項技術中已知的方法，例如根據Atherton^SSkppardjSolid Phase Peptide Synthesis :a Practical Approach (固相肽合成實驗方法)JRL Press (Oxford, England (1989))的方法進行純化。肽可基于例如CNP的以下肽序列來合成=G1LSOi或R)GC6F7G8L(K或R或Nle或 6-0H-Nle)LDRIGSMSGLGC 2。例示性CNP變體包括(但不限于)類似物A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO :56)通過將 C6 的主鏈”-C =0”基團轉化為”-CH2”基團來制得；類似物B (GLSKGC (N-Me-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 57 通過將 F7 的主鏈” -NH”基團轉化為” -N-CH3"基團來制得；類似物E (GLSKGC (D-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO : 136)通過在 F7 使用 D-Phe來制得；類似物F(GLSKGCF(tBu-Gly)LKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO :58)通過在 G8 使用叔丁基-Gly來制得；類似物G(GLSKGC (3-Cl-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 137)通過將氯原子添加至F7的苯環的間位來制得(類似變體可通過以Cl、F、Br、OH及/或CH3對W1W的苯環進行鄰位、間位及/或對位取代來產生)；且類似物H (GLSKGC [NHCH2CH (Ph) CO] GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 59)通過在 F7 使用(士)-3-(氨基)-2-苯基丙酸來制得。具有例如氨基酸延伸、天然或非天然氨基酸或肽鍵等構物的取代，及/或與聚合物或疏水部分的偶聯的CNP變體的實例包括(但不限于)類似物J C6-CH2-NH、N-Me-L9、N-Me-L20(SEQ ID NO :91)類似物K N-Me-L9、N-Me_L20(SEQ ID NO :92)類似物L N-Me-L9、N-Me-L11、N-Me-L20(SEQ ID NO :93)類似物M N-Me_L9、N-Me-Lll (SEQ ID NO :94)類似物Z K4R、F7Y(SEQ ID NO :95)類似物AAK4R、G8V (SEQ ID NO :96)
類似物ABK4R、G8S (SEQ ID NO 97)類似物ACK4R、G8T (SEQ ID NO 98)類似物ADK4R、L9T (SEQ ID NO 99)類似物AEK4R、G15R(SEQ ID NO :100)類似物AFK4R、G15Cit(SEQ ID NO :101)類似物AGK4R、M17V(SEQ ID NO :102)類似物AHK4R(SEQ ID NO :35)類似物AJK4R、L20V (SEQ ID NO 103)類似物AKK4R、L20t-Bu_Ala(SEQ ID NO :104)類似物ATG1E、K4E (SEQ ID NO 105)類似物AVG1E、K4E-戊酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 106)類似物AWG1E、K4E-庚酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 107)類似物AXCNP17 ( Δ N 端)(SEQ ID NO 2)類似物AYGANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)類似物AZR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)類似物 BBGlE-庚酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 108)類似物BCGlE-戊酸(連接于 N 端)(SEQ ID NO 109)類似物BFK4R、KlOCit (SEQ ID NO :110)類似物BGK4R、KlOQ (SEQ ID NO :111)類似物BHK4R、KlOR (SEQ ID NO :112)類似物BJK4R、Gl5N (SEQ ID NO 113)類似物BKK4R、G15S(SEQ ID NO :114)類似物BLCNP-37 (SEQ ID NO :60)CNP-53(SEQ ID NO 4)類似物CAAAWARLLQEHPNA-CNP22 (SEQ ID NO :61)類似物CBAAWARLLQEHPNAR-CNP22 (SEQ ID NO :62)類似物CCDLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (SEQ ID NO :63)類似物CDSPKMVQGSG-CNPI7-KVLRRH (N 端及 C 端 BNP 尾)(SEQ ID NO 68)類似物CEGERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (HSA-CNP22) (SEQ ID NO :81)類似物CFGQPREPQVYTLPPS-CNP22 (SEQ ID NO :79)PEG (24K) -CNP22PEG (20K) -CNP22PEG (5K) -CNP22PEG (2K) -CNP22PEG(2K) -CNP17PEG (IK)-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :36)PEG(IK) -CNP22PE04- (PE012) 3 (分支)-CNP22PE012-CNP22
PE012-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO 36)PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)；及SEQ ID NO :1至6及；34至144，及其包含至多1、2、3、4或5個其它修飾的變體。在一實施例中，CNP變體經由在Cys6與Cys22之間形成二硫鍵來環化。Cys6可為半胱氨酸類似物，諸如高半胱氨酸或青霉胺。在另一實施例中，CNP變體可通過頭至尾、側鏈至側鏈、側鏈至頭或側鏈至尾形成的共價鍵來環化。在一實施例中，在位于或靠近肽的N 端的氨基酸與位于或靠近肽的C端的氨基酸(在此上下文中稱作”末端”氨基酸)之間形成共價鍵。在另一實施例中，在兩個末端氨基酸的側鏈之間形成共價鍵。在另一實施例中， 在一個末端氨基酸的側鏈與另一末端氨基酸的末端基團之間，或在兩個末端氨基酸的末端基團之間形成共價鍵。末端胺與末端羧基的頭至尾環化可使用多種方法來進行，例如使用對硝基苯酯、 2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、疊氮化物法、混合酸酐法、HATU、碳二亞胺(例如DIC、EDC或 DCC)及催化劑(諸如 HOBt、HONSu 或 HoAt)，或樹脂上環化(on-resin cyclization)。另外，環狀結構可經由涉及CNP變體的氨基酸殘基的側鏈及/或末端氨基酸殘基的橋聯基團形成。橋聯基團為允許肽的兩個部分環化的化學部分。橋聯基團的非限制性實例包括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、磺酰胺及其類似物。此項技術中已知并入具有此等橋聯基團的單元的多種方法。舉例而言，可在N端氨基或側鏈氨基與C端羧酸或側鏈(例如賴氨酸或鳥氨酸的側鏈，及谷氨酸或天冬氨酸的側鏈)羧基之間形成內酰胺橋(亦即環狀酰胺)。可在C端羧基或側鏈羧基與半胱氨酸或半胱氨酸類似物的側鏈硫醇基之間形成硫酯。或者，可藉由摻入羊毛硫氨酸(硫代二丙氨酸)殘基以連接藉由硫醚鍵共價鍵合在一起的丙氨酸殘基來形成交聯。在另一方法中，諸如二羧酸(例如辛二酸(suberic acid/octanedioic acid))的交聯劑可連接氨基酸側鏈的官能基(諸如游離氨基、羥基及硫醇基)。亦可使用酶催化環化。舉例而言，已報導可使用短桿菌酪肽(tyrocidine)合成酶的硫酯酶域來環化硫酯前體，可使用枯草桿菌蛋白突變體來環化肽羥乙酸苯丙氨酰基酰胺酯，且可使用抗體連接酶16G3來環化對硝基苯基酯。關于肽環化的回顧，請參看Davies， J. Peptide Sci.(肽科學雜志)，9 :471-501 (2003)，其以全文引用的方式并入本文中。在某些實施例中，最終環化產物具有至少約70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 96%、97%、98%或至少約99%的純度。D.經化學修飾的CNP變體CNP22或其變體的化學修飾可可能賦予經修飾CNP肽以有利特性，諸如穩定性及半衰期增加及免疫原性降低(有關對治療蛋白的化學修飾的一般論述，請參看 Wmrmazie (藥物)，57(1) :5_29 (2002))。舉例而言，使天然或合成的聚合或非聚合部分 (例如PEG)連接至CNP肽以將CNP肽的總質量增至本文一般描述的范圍(例如約2. 6kDa 或2. 8kDa至約6kDa或7kDa的范圍)可降低經修飾肽對外肽酶及/或內肽酶(例如 NEP)活體內切割的敏感性。除聚乙二醇化、糖基化及其它化學衍生化程序(例如藉由磷酸化、酰胺化、羧基化、乙酰化、甲基化及產生酸加成鹽來進行修飾)外，酰胺、酯及N-酰基衍生物亦可潛在地遮蔽免疫原性區域及/或蛋白水解敏感區域Science (科學)，303 480-482(2004))ο化學修飾的實例包括(但不限于)用于改良穩定性及蛋白酶抗性且降低免疫原性的Bednarsaki的聚合物添力口法及Altus Corporation的交聯法。Bednarsaki顯示聚合物添加可改良蛋白質的溫度穩定性(J. Am. Chem. Soc.(美國化學學報)，114(1) 378-380(199 )，且Altus Corporation發現戊二醛交聯可改良酶穩定性。多肽的化學修飾可以非特異性方式(產生衍生物質的混合物)，或以位點特異性方式(例如基于野生型大分子反應性引導的衍生化，及/或使用定點突變誘發與化學修飾的組合的位點選擇性修飾)，或者使用所表達蛋白質連接法來進行(Curr.Opin. Biotechnol.(生物技術目前觀點)，I3 (4) =297-303 (2002)) 聚乙二醇化CNP變體在一實施例中，為增強穩定性(例如對NEP降解的抗性)，使CNP22或其變體(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的變體)偶聯至親水性天然或合成聚合物，以將經修飾 CNP肽的總質量增至約2. 6kDa或2. 8kDa至約4、5、6、7kDa或7kDa以上的范圍。在某些實施例中，所添加的親水性聚合物具有約0. 6,0. 8、1、1. 2,1. 4,1. 6,1. 8、2、2. 2,2. 4,2. 6,2. 8、 3,3. 2,3. 4,3. 6,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8kDa 或約 5kDa 的總質量。在一實施例中，親水性聚合物具有水溶性，以便與其偶聯的CNP肽在水性(例如生理)環境下不會沉淀出來。此外，親水性聚合物具有生物兼容性，亦即不會在活體內引起損傷、毒性或免疫反應。親水性聚合物可為分支或未分支聚合物。在一實施例中，親水性聚合物未分支。CNP22或其變體可能與親水性聚合物在各種位點偶聯，包括(但不限于)(1)僅在N端；⑵僅在C端；(3)僅在內部位點(例如Lys4) ； (4)在N端與C端；(5)在N端及內部位點；及(6)在C端及內部位點。在一實施例中，CNP22或其變體僅在N端偶聯至親水性聚合物。在另一實施例中，僅在內部位點(例如Lys4)偶聯。在另一實施例中，在N端及內部位點(例如Lys4)偶聯。在又一實施例中，為達成更佳功能性，CNP肽不在環狀域(對應于CNP22的Cys6至Cys22)內的位點(例如LyslO)偶聯至親水性聚合物。若與親水性聚合物的偶聯系基于與CNP肽上的反應性伯氨基形成鍵，則可藉由以側鏈上不含反應性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模擬物(諸如Gly、Ser, Arg、Asn、Gin、Asp、Glu或瓜氨酸 (Cit))取代Lys4及/或LyslO來防止在內部位點(例如Lys4及/或LyslO)偶聯。在一特定實施例中，Lys4及/或LyslO經Arg置換。在另一實施例中，LyslO未經Arg置換。親水性聚合物的非限制性實例包括自帶有羧酸的單體(例如甲基丙烯酸(MA) 及丙烯酸(AA))形成的聚合物；聚乙烯醇；自帶有羥基的單體(例如甲基丙烯酸羥乙酯 (HEMA)、甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)、羥丙基甲基丙烯酰胺，及甲基丙烯酸3-三甲基硅烷基丙酯(TMSPMA))形成的聚合物；聚環氧烷；聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)；聚(乙二醇) (PEG)；聚(丙二醇)；單C1-Cltl烷氧基-PEG(例如單甲氧基-PEG)；三氟乙磺酰基單甲氧基-PEG ；芳氧基-PEG ；PEG丙烯酸酯(PEGA) ；PEG甲基丙烯酸酯；PEG丙醛；雙丁二酰亞氨基碳酸酯PEG ;2_甲基丙烯酰氧基乙基-磷酸膽堿(MPC)與N-乙烯基吡咯啶酮(VP)的共聚物；羥基官能性聚(N-乙烯基吡咯啶酮)(PVP) ；SIS-PEG(SIS為聚苯乙烯-聚異丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物)；聚苯乙烯-PEG;聚異丁烯-PEG ；PCL-PEG(PCL為聚己內酯)； PLA-PEG(PLA為聚乳酸)；PMMA-PEG(PMMA為聚(甲基丙烯酸甲酯))；PDMS-PEG(PDMS為聚二甲基氧環己酮(polydimethyloxanone)) ；PVDF-PEG(PVDF 為聚偏二氟乙烯)；PLUR0NIC 界面活性劑(聚環氧丙烷-共-聚乙二醇) ’聚(伸丁二醇) ’聚(L-賴氨酸-g-乙二醇)(PLL-g-PEG)；聚(L-賴氨酸-g-透明質酸)(PLL-g-HA)；聚(L-賴氨酸-g-磷酰膽堿)(PLL-g-PC) ’聚(L-賴氨酸-g-乙烯基吡咯啶酮)(PLL-g-PVP)；聚(乙亞胺-g-乙二醇)(PEI-g-PEG)；聚(乙亞胺-g_透明質酸)(PEI-g-HA)；聚(乙亞胺-g-磷酰膽堿) (PEI-g-PC)；聚(乙亞胺-g-乙烯基吡咯啶酮)(PEI-g-PVP) ；PLL-共-HA、PLL-共-PC、 PLL-共-PVP、PEI-共-PEG、PEI-共-HA、PEI_ 共 _PC、PEI_ 共-PVP、纖維素及其衍生物(例如羥乙基纖維素)；聚葡萄糖；糊精；透明質酸及其衍生物(例如透明質酸鈉)；彈性蛋白； 殼聚糖；丙烯酸硫酸酯；丙烯酸磺酸酯；丙烯酸氨基苯磺酸酯；甲基丙烯酸硫酸酯；甲基丙烯酸磺酸酯；甲基丙烯酸氨基苯磺酸酯；其聚合物及共聚物；及其組合的聚合物及共聚物。在一特定實施例中，親水性聚合物為聚(乙二醇)(PEG)，亦稱聚(環氧乙烷) (PEO)。如本文中所用，術語”PEG”或”ΡΕ0”包括可用于衍生多肽的PEG的所有形式(分支及未分支)，包括(但不限于)單(C1-Cltl)烷氧基-PEG及芳氧基-PEG。在一實施例中，PEG-CNP偶聯物包含式(CH2CH2O)n的PEG(或ΡΕ0)聚合物，其中η 為約6至約100的整數，且PEG聚合物為約0. 3kDa至約5kDa。在另一實施例中，η為約12 至約50的整數，且PEG聚合物為約0.6kDa至約2. 5kDa。在另一實施例中，η為約12至約 24，且PEG聚合物為約0. 6kDa至約1. 2kDa。在另一實施例中，PEG聚合物的末端羥基經非反應性基團封端。在一特定實施例中，封端基團為烷基，例如低級烷基，諸如甲基，以使PEG 聚合物以烷氧基終止。在一實施例中，PEG聚合物未分支。在另一實施例中，CNP22或其變體僅在N端偶聯至PEG聚合物。PEG及PEO視其制備方式而可能包括具有分子量分布的分子，亦即，其可能具有多分散性。聚合制劑的大小/質量分布在統計學上可由其重量平均分子量(Mw)及其數目平均分子量(Mn)表征，其比率系稱作多分散性指數(Mw/Mn)。Mw及Mn可藉由質譜法量測。偶聯至大于1. 5kDa的PEG部分的PEG-CNP變體可因母體PEG分子的多分散性質而顯示分子量范圍。舉例而言，在mPEGI (Sunbright ME-020HS, NOF Co.)的情況下，PEG分子的分子量分布于約1. 5kDa至約3kDa的范圍內，多分散性指數為1. 036。相反，使用皮爾斯生物技術 (Pierce Biotechnology)(洛克福德，伊利諾斯州)的 MS (PEG)n 試劑(n = 4、8、12 或 24， 表示為例如”ΡΕ012”或”ΡΕ0Μ”)偶聯至CNP22或其變體的PEG具有單分散性，具有不連續鏈長及規定分子量。用于產生包含PEG部分的多肽的方法為此項技術中所已知(例如參看美國專利 5，824，784)。制備聚乙二醇化CNP肽的方法一般包含以下步驟(a)使CNP22或其變體與聚乙二醇化試劑在適于將PEG連接至CNP肽(例如在N端)的條件下反應，及(b)獲得反應產物。因為對CNP肽進行聚乙二醇化可顯著改變其與NPR-B的結合，所以可視PEG部分的大小及聚乙二醇化的位置而定，探索不同種類的PEG及聚乙二醇化反應條件。可用于對 CNP肽進行聚乙二醇化的化學包括使用甲氧基-PEG(0-[(N- 丁二酰亞氨基氧基羰基)-甲基]-0’-甲基聚乙二醇)的NHS酯對肽的反應性伯胺進行酰化。以甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA進行酰化產生消除初始伯胺的任何電荷的酰胺鍵。以符號”PE012”或”ΡΕ0Μ” 表示的PEG-CNP肽，以及以符號”PEG1K”、”PEG (”、”PEG ”或”PEG20K”表示的肽系經由肽上的伯氨基與經NHS酯活化、甲氧基封端的PEG試劑反應來進行聚乙二醇化。PEG-CNP變體亦可藉由其它方法，例如經由涉及肽上的伯氨基及PEG醛(諸如PEG-丙醛)或其單C1-Cltl 烷氧基或芳氧基衍生物的還原性胺化來制備(參看美國專利5，252，714)。不同于核糖體蛋白質合成，合成肽的合成系自C端進行至N端。因此，Boc-PEG(含有第三丁氧羰基(Boc))為一種將PEG連接至肽的C端的方法(R.B.Merrifield，J.Am. Chem. Soc.(美國化學學報)，85 (14) :2149-2154 (1963))。或者可采用Fmoc (弗基甲氧羰基)化學(E. Atherton 及 R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis :a Practical Approach (固相肽合成實驗方法)，IRL Press (Oxford，England (1989))。制備PEG-CNP變體的本發明方法提供聚合物-蛋白質偶聯物的實質上均質混合物。純化之后，不連續PEG-CNP制劑對于生物特性的活體外及活體內測試足夠純。如本文中所表明，某些PEG-CNP變體顯示對NEP切割的敏感性降低及實質上類似或更佳的功能性 (例如刺激cGMP產生)。如本文所述，使用適當聚乙二醇化試劑/CNP肽比率及反應條件進行的CNP22或其變體的聚乙二醇化反應提供PEG-CNP衍生物。聚乙二醇化的性質及程度可使用例如PAGE 及HPLC分析來測定。在某些實施例中，至少約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %的 CNP22或其變體在N端經單聚乙二醇化。為優化聚乙二醇化對CNP肽的生物特性的有利影響，可改變聚合物長度、構型(例如分支或線性)，及/或PEG部分的官能化(例如添加帶負電基團)。針對NEP抗性、藥物動力學及生物活性(例如結合NPR-B及刺激cGMP產生的能力)對聚乙二醇化CNP變體進行測試。可例如于活體外在基于大鼠軟骨肉瘤細胞的軟骨發育不全模型中，及于活體內在鼠類軟骨發育不全動物模型中進一步測試顯示獲改良NEP抗性及CNP22的cGMP刺激活性的至少約50%的聚乙二醇化CNP變體。 E.使用CNP變體的方法、CNP變體的醫藥組合物，及給藥途徑使用CNP變體的方法骨相關病癥成纖維細胞生長因子(FGF)在骨形成方面起重要作用，且FGF受體基因(FGFR 1、 2及3)的突變導致多種遺傳性骨骼畸形(Curr. Biol.(目前生物學)，5 :500-507 (1995))。 特別是，FGFR-3的活化突變造成長骨病癥，包括軟骨發育不全(人類遺傳性侏儒癥的最常見形式)(Nature (自然)，371 :252-254(1994) ；Cell (細胞)，78 :335_；342 (1994))，較輕度病癥軟骨發育低下(Ann. N. Y. Acad. Sci.(紐約科學年報),785 182-187 (1996))，及較嚴重及新生兒致死性第I型及第II型侏儒癥性發育不全(TD) (Hum. Mol. Genet.(人分子遺傳學)，5 :509-512(1996) ；Nat. Genet.(自然遺傳學)，9 :321-3 (1995))。過度表達 FGF-2 且從而活化FGFR-3的小鼠模型顯示長骨縮短及巨頭畸形(Mol. Biol. Cell (分子生物學，細胞)，6 :1861-73(1995))。與此模型相符，缺乏FGFR-3的小鼠顯示顯著的骨骼過度生長與較寬生長板(Nature Genet.(自然遺傳學)，12 :390-397 (1996))。使用CNP、NPR-B及NPR-C的互補實驗表明肽配位體、相應受體與骨生長之間的聯系。在轉殖基因小鼠中藉由提高血漿濃度的CNP來活化NPR-B引起骨骼過度生長(Nat. Med.(自然醫學)，10 :80-86 0004))，此在組織學上類似于FGFR-3基因敲除小鼠的生長板軟骨的情形(Nat. Genet.，4 :390-397 (1996))。在NPR-C基因敲除小鼠中，應消除NPR-C 介導的CNP清除；與此預測相符，基因敲除動物顯示延長的長骨及延長的椎骨與脊柱隆凸 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :7403-08 (1999))。相反，CNP基因敲除的小鼠因長骨及椎骨較短而矮化(表型在組織學上類似于軟骨發育不全)，且因咬合異常及肺受小胸腔限制而致使死亡率增加(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 :4016-4021 (2001))。與所提出的 CNP 作為 NPR-B的活化劑的作用相符，NPR-B基因敲除小鼠與CNP基因敲除小鼠具有相同矮化骨骼表型及增加的死亡率(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 101 17300-05 (2004))。此外，在軟骨中具有活化FGFR-3的軟骨發育不全的小鼠模型中，軟骨細胞中CNP的靶向過度表達對抗侏儒癥 Wasoda等人，Nat. Med.(自然醫學)，10 :80-86 (2004))。另外，已顯示CNP在調節軟骨內骨生長及軟骨細胞活性方面起作用，包括(但不限于)軟骨細胞增殖及分化、抑制有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-I)激酶信號傳導路徑及促進軟骨內骨化Wasoda等人， Nat. Med.(自然醫學)，10 :80-86(2004)).此等結果表明CNP/NPR-B系統的活化為治療人類軟骨發育不全的潛在治療策略。本文的CNP變體藉由刺激基質產生、使軟骨細胞增殖及分化及增強長骨生長而適用于治療患骨相關病癥(諸如骨骼發育不良)的哺乳動物，包括人類。CNP反應性骨相關病癥及骨骼發育不良的非限制性實例包括軟骨發育不全、軟骨發育低下、身材矮小、侏儒癥、骨軟骨發育不全、致死性軟骨發育不全、成骨不全、軟骨成長不全、斑點狀軟骨發育異常、同型合子軟骨發育不全、斑點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死性低磷酸酯酶癥、周產期致死型成骨不全、短肋骨綜合征多指綜合征、軟骨發育低下、肢根型斑點狀軟骨發育異常、詹森型干骺端發育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia)、生HH本 ^ 勾 ^^良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita) > 骨發育不全癥(atelosteogenesis)、骨畸形性發育不良(diastrophic dysplasia)、 先天性短股骨、朗格型肢中部發育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部發育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、綜合征羅比撓綜合征(Robinow syndrome)、綜合征萊茵哈特綜合征(Reinhardt syndrome)、肢端發育不全(acrodysostosis)、周圍性骨發育不全、克尼斯特發育不良(Kniest dysplasia)、纖維軟骨發生(fibrochondrogenesis)、綜合征羅伯茨綜合征(Roberts syndrome)、肢端肢中發育不全、短肢畸形、莫基奧綜合征(Morquio syndrome)、克尼斯特綜合征(Kniest syndrome)、后生營養性發育不良(metatrophic dysplasia)及脊椎干骺端發育不良 (spondyloepimetaphyseal dysplasia)。此外，CNP變體適用于生長激素的輔助物或替代物以便治療特發性身材矮小及其它骨骼發育不良。另外，CNP變體適用于治療其它骨相關病狀及病癥，諸如佝僂病、低磷酸鹽血癥性佝僂病[包括X染色體連鎖低磷酸鹽血癥性佝僂病(亦稱為抗維生素D佝僂病)及常染色體顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病]，及軟骨病[包括腫瘤誘發的軟骨病(亦稱為致癌軟骨病或致癌低磷酸鹽血性軟骨病)]。本文的CNP變體亦可用以治療骨關節炎。骨關節炎為關節軟骨的退化性疾病且通常發生于老年人中。骨關節炎涉及軟骨破壞及由關節組件退化所致的骨與軟骨的增生性變化，其中該變化導致繼發性關節炎(例如滑膜炎)。在骨關節炎中，作為軟骨的功能性實體的細胞外基質蛋白質減少，且軟骨細胞數目減少(Arth. Iiheum. 46 (8) 1986-1996 (2002)) 0 藉由促進基質產生、軟骨細胞生長及分化，CNP變體適用于在患關節炎(包括骨關節炎)的個體中抗衡FGF-2的不當作用及增加基質合成，藉此治療關節炎，包括骨關節炎。血管平滑肌病癥
CNP及其它血管活性肽(包括ANP、BNP及尿舒血管素(urodilatin))具有血管擴張及利尿特性且在心血管內穩定中起重要作用(J. Cardiovasc. Pharmaco 1.(心血管藥物學雜志)，117 =1600-06(1998) ；Kidney Int.(國際腎臟)，49 :1732-37(1996)； Am. J. Physiol.(美國生理學雜志)，275 :H1826_1833 (1998))。CNP廣泛分布于心血管系統中，尤其以高濃度分布于血管內皮細胞中(J. Cardiovasc. Wiarmacol.(心血管藥物學雜志)，117 :1600-06(1998))。CNP為血管平滑肌(尤其在冠狀循環中)的有效松弛劑 (Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學生物物理研究通訊)205 :765-771 (1994))， 且為平滑肌細胞增殖的抑制劑(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學生物物理研究通訊)177 :927-931 (1991))。盡管CNP的血管擴張作用的效力不如ANP強(約1 100) (Hypertens. Res.(高血壓研究)，21 :7_13 (1998) ；Am. J. Physiol.(美國生理學雜志)，
275:L645-L652(1998))，但在發炎性心血管病理學中，CNP mRNA回應于剪切應力而增加(FEBS Lett. (FEBS 通信)，373 :108-110 (1995))，且 CNP 的血菜含量升高(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化學生物物理研究通訊)198 1177-1182 (1994))。已顯示 CNP經由抑制巨噬細胞浸潤于兔的受損頸動脈中來抑制發炎(Circ.Res.(循環研究)， 91 :1063-1069^00 ),且經由NPR-B/cGMP依賴性路徑直接抑制心臟成纖維細胞增殖 (Endocrinology (內分泌學)，144 :2279-2284 (2003)) CNP的心血管作用系經由NPR亞型NPR-B及NPR-C的活化來介導 (Endocrinology (內分泌學)，130 :229-239 (1992))，NPR-C 占活體內表達的 NPR 的 95% (Science (科學)，293 1657-1662 (2001))。CNP/NPR-B 路徑在心血管系統中引起 cGMP (公認第二信使)升高。NPR-C的C端的37個氨基酸部分具有與異源三聚G蛋白Gi相互作用的共同序列(J. Biol. Chem.(生物化學雜志)，274 17587-17592 (1999))，已顯示該異源三聚G蛋白Gi調節腺苷酸環化酶及磷脂酶C活性(J. Biol. Chem.(生物化學雜志)，
276:22064-70(2001) ；Am. J. Physiol.(美國生理學雜志)，278 :G974-980 (2000) J. Biol. Chem.(生物化學雜志)，271 19324-19329 (1996)) CNP經由NPR-C的活化及G蛋白調節的內向性整流K+通道的開啟來介導平滑肌超極化及松弛(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :1426-1431(2003)).同樣，CNP在心臟成纖維細胞中具有重要抗增殖作用，且經由與 NPR-C相互作用使平滑肌細胞超極化來調節局部血液流動及全身血壓(R. Rose及I Giles, J. Physiol.(生理學雜志)586 :353-366 (2008))。CNP22通過結合于血管平滑肌細胞上的NPR-B來刺激cGMP的產生，cGMP充當細胞內第二信使以最終使得血管松弛。基于CNP的降血壓作用，本文的CNP變體適用于治療高血壓、充血性心臟衰竭、心原性水腫、腎水腫、肝原性水腫、急性及慢性腎功能不全等。另外， cGMP信號傳導的活化抑制血管平滑肌細胞的生長。因此，本文的CNP變體可用以治療由血管平滑肌細胞的異常生長所致的病狀或疾病，包括(但不限于)再狹窄及動脈硬化。上述研究表明，CNP可為用于血管平滑肌松弛及重塑的潛在治療候選物。CNP對于某些病癥的藥理作用部分地歸因于血管保護作用而非血管擴張活性(Am. J. Respir. Crit. Care Med.(美國呼吸道重癥監護醫學雜志)，170 :1204-1211 (2004))。因此，本文的CNP變體適用于治療CNP可具有血管保護作用的病狀，例如血管平滑肌病癥，該血管保護作用包括(但不限于)誘導平滑肌松弛及抑制巨噬細胞浸潤于心臟組織中。在一實施例中，使用 CNP變體來治療心臟衰竭，包括(但不限于)急性代償失調性心臟衰竭及急性充血性心臟衰竭。在另一實施例中，使用CNP變體來治療哮喘、心肌癥及冠狀動脈再狹窄(藉由增強平滑肌細胞松弛及減少平滑肌細胞增殖)。CNP變體的醫藥組合物在其它實施例中，本文提供醫藥組合物，其包含CNP變體及一或多種醫藥學上可接受的賦形劑、載體及/或稀釋劑。在某些實施例中，這些組合物進一步包含一或多種其它生物活性劑(例如蛋白酶、受體酪氨酸激酶及/或清除受體NPR-C的抑制劑)。在一些實施例中，組合物包含純度為至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%的所需CNP變體。在某些實施例中，組合物含有少于約10%、5%、 4^^3^^2^^1%或0.5%大分子污染物，諸如其它哺乳動物(例如人類)蛋白質及其它 CNP變體。賦形劑、載體及稀釋劑的非限制性實例包括載體、液體、緩沖劑、等張劑、添加劑、 穩定劑、防腐劑、增溶劑、界面活性劑、乳化劑、濕潤劑、佐劑等。組合物可含有液體(例如水、乙醇)；各種緩沖劑內容物(例如Tris-HCl、磷酸鹽、乙酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑)、 PH值及離子強度的稀釋劑；去污劑及增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化劑(例如甲硫氨酸、抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑(例如硫柳汞(Thimerosol)、苯甲醇、間甲酚)；及增積物質(bulking substance)(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖)。在此項技術中已知在醫藥組合物的制劑中使用賦形劑、稀釋劑及載體；例如參看Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington 藥典)，第 18 版，第 1435-1712 頁,Mack Publishing Co. (Easton，Pennsylvania(1990))，其系以其全文引用的方式并入本文中。舉例而言，載體包括(但不限于)稀釋劑、載體及佐劑，以及植入運載體，及不與活性成分反應的惰性無毒固體或液體填充劑及囊封材料。載體的非限制性實例包括磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、水及乳液(例如油/水乳液)。載體可為含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物)、植物油及其混合物的溶劑或分散介質。在一些實施例中，組合物為液體制劑。在某些實施例中，制劑包含濃度范圍為約 0. lmg/ml 至約 20mg/ml，或約 0. 5mg/ml 至約 20mg/ml，或約 lmg/ml 至約 20mg/ml，或約 0. lmg/ml 至約 10mg/ml，或約 0. 5mg/ml 至約 10mg/ml，或約 lmg/ml 至約 10mg/ml 的 CNP 變體。在其它實施例中，組合物包含緩沖溶液或緩沖劑以維持含CNP的溶液或懸浮液的 PH值在所需范圍內。緩沖溶液的非限制性實例包括磷酸鹽緩沖鹽水、Tris緩沖鹽水及亨克氏緩沖鹽水(Hank's buffered saline)。緩沖劑包括(但不限于)乙酸鈉、磷酸鈉及檸檬酸鈉。亦可使用緩沖劑的混合物。在某些實施例中，緩沖劑為乙酸/乙酸鹽或檸檬酸/檸檬酸鹽。適用于組合物中的緩沖劑的量部分視所用特定緩沖劑及溶液或懸浮液的所需PH值而定。舉例而言，乙酸鹽為在PH 5下比在pH 6下更有效的pH值緩沖劑，因此在pH 5的溶液中可使用比PH 6的溶液中所用較少的乙酸鹽。在一些實施例中，緩沖劑具有約IOmM 士 5mM 的濃度。在某些實施例中，組合物的PH值為約pH 3至約pH 7.5,或約pH 3. 5至約pH 7， 或約pH 3. 5至約pH 6. 5，或約pH 4至約pH 6，或約pH 4至約pH 5，或為約pH 5.0 士 1.0。在其它實施例中，組合物含有等張調節劑以使得溶液或懸浮液等張且更兼容以便注射。等張劑的非限制性實例包括NaCl、葡聚糖、葡萄糖、丙三醇、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些實施例中，等張劑為NaCl。在某些實施例中，NaCl濃度為約160士20mM，或約
81140mM士 20mM，或約 120 士 20mM，或約 IOOmM士 20mM，或約 80mM士 20mM，或約 60mM士 20mM。在其它實施例中，組合物包含防腐劑。防腐劑包括(但不限于)間甲酚及苯甲醇。 在某些實施例中，防腐劑濃度為約0.4% 士0.2%，或約士0.5%，或約1.5% 士0.5%， 或約 2. 0% 士0. 5%。在其它實施例中，組合物含有抗吸附劑(例如以減輕CNP變體吸附至玻璃或塑料)。抗吸附劑包括(但不限于)苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些實施例中，抗吸附劑濃度為約0. 001 %至約0. 5%，或約0. 01 %至約0. 5%，或約0. 1 %至約1 %，或約0.5%至約1%，或約0.5%至約1. 5%，或約0.5%至約2%，或約1%至約2%。在其它實施例中，組合物包含穩定劑。穩定劑的非限制性實例包括丙三醇、甘油、 硫甘油、甲硫氨酸及抗壞血酸及其鹽。在一些實施例中，當穩定劑為硫甘油或抗壞血酸或其鹽時，穩定劑濃度為約0. 至約1%。在其它實施例中，當穩定劑為甲硫氨酸時，穩定劑濃度為約0. 01 %至約0. 5 %，或約0. 01 %至約0. 2 %。在其它實施例中，當穩定劑為丙三醇時， 穩定劑濃度為約5%至約100% (純)。在其它實施例中，組合物含有抗氧化劑。例示性抗氧化劑包括(但不限于)甲硫氨酸及抗壞血酸。在某些實施例中，抗氧化劑與CNP變體的摩爾比為約0. 1 1至約15 1， 或約1 1至約15 1，或約0.5 1至約10 1，或約1 1至約10 1，或約3 1至約 10 1。組合物中可使用醫藥學上可接受的鹽，包括(但不限于)無機酸鹽(例如鹽酸鹽、 氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽)、有機酸鹽(例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽)，及胺鹽(例如異丙胺、三甲胺、二環己胺、二乙醇胺)。醫藥學上可接受的鹽的全面討論可見于 Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington 藥典)，第 18 版， Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania(1990))中。醫藥組合物可以各種形式給予，諸如錠劑、膠囊、顆粒劑、粉末、溶液、懸浮液、乳液、軟膏及經皮貼片。組合物的劑型可據組合物的所需給予模式來調整。對于經口給予，組合物可采用例如錠劑或膠囊(包括軟凝膠膠囊)的形式，或可為例如水性或非水性溶液、懸浮液或糖漿。供經口給予的錠劑及膠囊可包括一或多種常用賦形劑、稀釋劑及載體，諸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米淀粉、糖精鈉、滑石、纖維素、碳酸鎂及潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酰反丁烯二酸鈉)。必要時，可將調味劑、著色劑及/或甜味劑添加至固體及液體制劑中。用于經口制劑的其它可選成分包括(但不限于)防腐劑、懸浮劑及增稠劑。 經口制劑亦可具有腸溶衣以保護CNP變體不受胃部的酸性環境影響。制備固體及液體劑型的方法為已知，或本領域技術人員將顯而易見(例如參看上文所參考的Remington藥典 (Remington 藥典))。供非經腸給予的制劑可制備為例如液體溶液或懸浮液，制備為適于在注射之前溶解或懸浮于液體介質中的固體形式，或制備為乳液。舉例而言，可根據此項技術中已知的技術，使用適合稀釋劑、載體、溶劑(例如緩沖水溶液、林葛爾氏溶液(Ringer’ s solution), 等張氯化鈉溶液)、分散劑、濕潤劑、乳化劑、懸浮劑及其類似物來調配無菌可注射溶液及懸浮液。另外，可使用無菌不揮發性油、脂肪酸酯、多元醇及/或其它非活性成分。作為其它實例，供非經腸給予的制劑包括無菌可注射水溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑，及使制劑與預定接受者的血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可含有懸浮劑及增稠劑。包含CNP變體的組合物亦可為凍干制劑。在某些實施例中，凍干制劑包含緩沖劑及膨脹劑，及視情況選用的抗氧化劑。例示性緩沖劑包括(但不限于)乙酸鹽緩沖劑及檸檬酸鹽緩沖劑。例示性膨脹劑包括(但不限于)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚維酮(PVP K24).在某些實施例中，甘露糖醇的量為約3%至約10%，或約4%至約8%， 或約4 %至約6 %。在某些實施例中，蔗糖的量為約6 %至約20 %，或約6 %至約15 %，或約 8%至約12%。例示性抗氧化劑包括(但不限于)甲硫氨酸及抗壞血酸。本文亦提供試劑盒，其含有例如包含液體(例如無菌可注射液體)制劑或固體 (例如凍干固體)制劑的瓶、小瓶、安瓿、管、藥筒及/或針筒。這些試劑盒亦可含有醫藥學上可接受的載體或運載體(例如溶劑、溶液及/或緩沖液)以便將固體(例如凍干固體) 制劑復原成溶液或懸浮液以便給予(例如通過注射)，包括(但不限于)在針筒中復原凍干制劑以便注射或將濃縮物稀釋至較低濃度。此外，可自例如包含含有CNP的組合物的無菌散劑、顆粒劑或錠劑制備臨時注射溶液及懸浮液。試劑盒亦可包括分配裝置，諸如噴霧器， 或注射分配裝置、筆式注射器、自動注射器、無針注射器、針筒及/或針。作為一非限制性實例，試劑盒可包括具有單腔室或雙腔室的針筒。對于單腔室針筒，單腔室可含有備用于注射的液體CNP制劑，或固體(例如凍干固體)CNP制劑或CNP變體于相對較小量的適合溶劑系統(例如丙三醇)中的液體制劑，其可復原成溶液或懸浮液以便注射。對于雙腔室針筒，一個腔室可含有醫藥學上可接受的載體或運載體(例如溶劑系統、溶液或緩沖液)，且另一腔室可含有固體(例如凍干固體)CNP制劑或CNP變體于相對較小量的適合溶劑系統(例如丙三醇)中的液體制劑，其可使用來自第一腔室的載體或運載體復原成溶液或懸浮液以便注射。作為另一實例，試劑盒可包括一或多個筆式注射器或自動注射器裝置，及雙腔室藥筒。藥筒的一個腔室可含有醫藥學上可接受的載體或運載體(例如溶劑系統、溶液或緩沖液)，且另一腔室可含有固體(例如凍干固體)CNP制劑或CNP變體于相對較小量的適合溶劑系統(例如丙三醇)中的液體制劑，其可使用來自第一腔室的載體或運載體復原成溶液或懸浮液以便注射。藥筒可包含足以歷經所需時段(例如1日、2日、3日、1周、2周、3 周、4周等)給藥的量的CNP變體。可調節筆式注射器或自動注射器以自藥筒給予所需量的 CNP制劑。另外，可將包含CNP變體的醫藥組合物調配為緩慢釋放、控制釋放或持續釋放系統以便歷經所需時段(諸如1周、2周、3周、1個月、2個月或3個月)維持相對恒定的劑量濃度。如在此項技術中所已知，緩慢釋放、控制釋放及持續釋放制劑可使用例如生物可降解的聚合系統{其可包含例如親水性聚合物[例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)]}來制備，且可采用例如微粒、微球體或脂質體的形式。給藥劑量及頻率如本文中所用，術語活性劑(例如CNP變體)的”治療有效量”指向患者提供治療益處的量。該量可在個體之間不同及可視許多因素(包括患者的總體身體狀況)而定。熟習此項技術者使用公開可得的材料及程序可容易地確定CNP變體的治療有效量。舉例而言，基于患有軟骨發育不全的0-17歲兒童014名女性及189名男性)的生長圖表 (其列出年齡別身高(height for age)、頭圍及體節生長(segmental growth))，用于療法的CNP變體的量應得到可接受的生長速率(Horton WA等人，Standard growth curves for achondroplasia(軟骨發育不全的標準生長曲線)，J. Pediatr.(兒科雜志)，93 435-8(1978))。⑶C圖表可用以評估年齡別體重及身高別體重或年齡別BMI。亦可量測使用實質上較長療程獲得的次要結果。血清半衰期長于野生型CNP22的CNP變體可潛在地以低于CNP22的頻率給予。特定個體的給藥頻率可視多種因素(包括所治療的病癥，及個體的狀況及對療法的反應)而變。在某些實施例中，約每日一次、每兩日一次、每三日一次或每周一次給予個體含有CNP 變體的醫藥組合物。在一實施例中，為治療骨相關病癥(例如骨骼發育不良，包括軟骨發育不全)，給予患者每日或每周劑量的CNP變體直至成人為止及/或貫穿成人期。本文所述的CNP變體可以治療有效劑量給予患者以治療、改善或預防骨相關病癥 (例如骨骼發育不良，包括軟骨發育不全)及CNP可提供血管保護作用的病狀(例如血管平滑肌病癥)。可于細胞培養物或實驗動物中藉由標準藥理學程序，諸如藉由測定LD5tl(對 50%群體致死的劑量)及ED5tl (在50%群體中治療有效的劑量)來測定CNP變體的安全性及治療功效。毒性作用與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可以比率LD5tZED5tl形式表示。顯示大治療指數的活性劑通常較佳。獲自細胞培養分析法及動物研究的數據可用以調配供人類使用的劑量范圍。該劑量通常處于循環濃度(包括ED5tl)的范圍內，其中毒性極小或最小。該劑量可視所用劑型及所用給藥途徑而在此范圍內變化。治療有效劑量可由細胞培養分析法及動物研究測定。在某些實施例中，本文所述的CNP變體系以約5或10nmol/kg至約300nmol/kg， 或約20nmol/kg至約200nmol/kg范圍內的劑量給予。在一些實施例中，以約5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、 170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、 750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的劑量或治療醫師認為適當的其它劑量給予 CNP 變體。在其它實施例中，以約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950或1000口8/1^或約 1,1. 25,1. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、 9、9. 5或10mg/kg的劑量，或治療醫師認為適當的其它劑量給予CNP變體。本文所述的CNP 變體的劑量可根據本文所述的給藥頻率/給藥頻率來給予，這些頻率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。對于特定個體，給予/給予CNP變體的頻率可視包括以下的多種因素而變化所治療的病癥、及個體的狀況、及對療法的反應。可以單次劑量或以每次給藥多次劑量的形式給予CNP變體。在某些實施例中，以如下頻率給予CNP變體單次劑量或多次劑量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每兩周、每3周、每月、每6周、每2個月、每3個月，或治療醫師認為適當的頻率。在一些實施例中，給予CNP變體以便留出生長期(例如軟骨生成)，接著為恢復期 (例如骨生成)。舉例而言，可靜脈內、皮下，或藉由另一模式每日或每周多次給予CNP變體持續一段時間，接著為無治療時期，接著重復該循環。在一些實施例中，初始治療期(例如每日或每周多次給予CNP變體)持續3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、 10周、11周或12周。在一相關實施例中，無治療時期持續3日、1周、2周、3周或4周。在某些實施例中，CNP變體的給藥療程為每日給藥持續3日，接著3日不給藥；或每日或每周多次給藥持續1周，接著3日或1周不給藥；或每日或每周多次給藥持續2周，接著1或2 周不給藥；或每日或每周多次給藥持續3周，接著1、2或3周不給藥；或每日或每周多次給藥持續4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接著1、2、3或4周不給藥。給藥模式可以多種方式(諸如通過皮下、靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或鞘內注射)來給予個體CNP變體或包含其的醫藥組合物。在一實施例中，藉由一日一次單次皮下、 靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或鞘內注射來給予CNP變體。亦可通過在疾病部位或其附近直接注射來給予CNP變體。此外，可通過在目標作用部位(例如異常骨或發育不全骨)植入儲積器來給予CNP變體。或者，可于舌下方經舌下(例如舌下錠劑)或通過吸入肺中(例如吸入劑或氣霧劑噴霧)、通過傳遞至鼻腔中(例如鼻內噴霧)、通過傳遞至眼內(例如滴眼劑)或通過經皮傳遞(例如藉助于皮膚貼片)來給予CNP變體。CNP變體亦可以微球體、微囊、脂質體(不帶電或帶電(例如陽離子型))、 聚合微粒(例如聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液及其類似物的形式經口給予。另一給藥方法通過滲透泵(例如Alzet泵)或微型泵(例如Alzet微型滲透泵) 來給予，這些泵允許控制、連續及/或緩釋傳遞CNP變體或醫藥組合物持續預定時期。滲透泵或微型泵可植入目標部位(例如肢干的長骨、骨骺等)或目標部位附近的皮下。如上所說明，CNP變體可用以治療由血管平滑肌細胞異常生長引起的病狀或疾病， 包括(但不限于)再狹窄及動脈硬化。為將CNP變體局部傳遞至患病身體血管(例如血管)，可借助植入于患病部位的醫學裝置(例如血管內支架)來傳遞CNP變體。在一實施例中，將CNP變體浸漬于安置于血管內支架上的聚合基質或聚合涂層內。在另一實施例中， CNP變體包含在形成于血管內支架內且由CNP變體可擴散穿過的多孔聚合膜或聚合層覆蓋的儲集器或通道內。如在此項技術中所已知，聚合基質、涂層、膜或層可包含至少一種生物可降解(例如親水性)聚合物。在另一實施例中，CNP變體可含于血管內支架體中的微孔內。可自血管內支架通過爆發式釋放、脈沖釋放、控制釋放或持續釋放或其組合來傳遞CNP 變體。舉例而言，血管內支架可依次以爆發式釋放及持續釋放的方式將CNP變體局部傳遞至患病部位。持續釋放可持續多達約2周、1個月、2個月、3個月、6個月或1年的時期。本領域技術人員將明白，CNP變體或其組合物亦可通過其它模式給予。CNP變體或其組合物的最有效給藥模式的決定在本領域技術人員的技能范圍內。CNP變體可以醫藥制劑形式給予，這些醫藥制劑適用于例如經口(包括頰內及舌下)、經直腸、經鼻、表面、經肺、經陰道或非經腸(包括肌肉內、動脈內、鞘內、皮下及靜脈內)給予，或呈適于通過吸入或吹入給予的形式。視預定給藥模式而定，醫藥制劑可呈固體、半固體或液體劑型，諸如錠劑、栓劑、丸劑、膠囊、散劑、液體、懸浮液、乳液、乳膏、軟膏、 洗劑及其類似物。可以適于單次給予精確劑量的單位劑型提供制劑。這些制劑包含有效量的CNP變體，及一或多種醫藥學上可接受的賦形劑、載體及/或稀釋劑，及視情況選用的一或多種其它生物活性劑。組合療法在一實施例中，CNP變體可與一或多種適用于治療、改善或預防CNP反應性病狀或病癥(諸如骨相關病癥(例如骨骼發育不良)及血管平滑肌病癥)的其它活性劑組合使用。 其它活性劑可增強CNP變體的作用及/或除CNP變體的作用外亦發揮其它藥理學作用。可與本文所述的CNP變體組合使用的活性劑的非限制性實例為其它利鈉肽(例如BNP)，及肽酶及蛋白酶(例如NEP及弗林蛋白酶)、NPR-C及酪氨酸激酶(例如FGFR-3)的抑制劑(例如拮抗劑)。NEP抑制劑可通過防止CNP變體的NEP切割來延長變體的半衰期。NEP抑制劑的實例包括(但不限于)塞奧芬及坎沙曲。共同使用NPR-C抑制劑亦可經由抑制NPR-C對變體的清除來延長CNP變體的半衰期。NPR-C抑制劑的非限制性實例為片段reiPMDRIGRNPR(SEQ ID NO 82)，其將在目標部位(例如骨生長板)于reiPMDRIGRNPR-CNP22嵌合體(類似物 CZ) (SEQ ID NO 82)或包含CNP22的變體(例如相對于CNP22含有氨基酸取代、添加及/或缺失的變體)的類似嵌合體的蛋白水解切割后釋放。共同使用酪氨酸激酶抑制劑可通過抑制酪氨酸激酶受體FGFR-3(—種軟骨細胞及骨生長的負調節劑)來增強CNP的效果。酪氨酸激酶抑制劑的非限制性實例包括U. S. 6，329，375及6，344，459中所揭示者。為在組合療法中達成適當治療結果，一般將給予個體有效產生所需治療結果(例如恢復骨生長)的組合量的CNP組合物與其它治療劑。此方法可涉及同時給予CNP組合物與其它治療劑。同時給予可藉由給予包括CNP變體與其它治療劑的單一組合物或藥理學蛋白質制劑來達成。或者，其它治療劑可與CNP變體的藥理學制劑(例如錠劑、注射液或飲齊U)大致在同時分別服用。亦可將CNP變體調配于適于攝取的食物(諸如核仁巧克力蛋糕 (brownies)、薄餅或蛋糕)中。在其它替代療程中，給予CNP變體可在給予其它治療劑之前或之后，間隔數分鐘至數小時范圍內的時間進行。在分別給予其它治療劑及CNP組合物的實施例中，一般將確保CNP變體及其它治療劑在彼此適當的時間內給予，以使CNP變體及其它治療劑可對患者發揮協同或加成的有利作用。舉例而言，可在其它治療劑的約0. 5-6小時內(之前或之后) 給予CNP組合物。在一實施例中，CNP組合物在其它治療劑的約1小時內(之前或之后)給予。鑒別及監測患者群體可建立鑒別適于CNP療法的個體及確定指定患者對CNP療法是否有反應的療程。 舉例而言，對于治療骨相關病癥，可量測生長指標，諸如子宮內(in utero)及新生兒的長骨生長量測值，及骨生長生物標記(諸如CNP、cGMP、膠原蛋白II、骨鈣化素及增殖細胞核抗原 (PCNA))的量測值。一種CNP信號傳導標記為cGMP (鳥苷3’，5’環狀單磷酸)。在CNP結合并活化其同源受體NPR-B之后，此細胞內信號傳導分子的含量增加。可自CNP暴露后的細胞培養抽提物(活體外)、自CNP暴露后的骨外植體研究(離體)的條件培養基，及皮下、靜脈內或經由此項技術中已知的其它給藥途徑給予CNP的數分鐘內的血漿(活體內)量測提高的cGMP含量。亦可量測軟骨及骨特異性分析物(或軟骨及骨相關標記)來評估CNP功效。舉例而言，切割的第II型膠原蛋白的片段為軟骨更新的軟骨特異性標記。第II型膠原蛋白為軟骨的主要有機組分且在軟骨更新之后，第II型膠原蛋白的片段(切割的膠原蛋白)釋放于循環中，且隨后分泌于尿中。軟骨更新之后形成新骨。可量測的骨形成的骨特異性生物標記為第I型原膠原的N端前肽(PINP)。因為第I型膠原蛋白為骨基質中的主要有機組分，所以第I型膠原蛋白的合成為骨形成中的重要步驟。在膠原蛋白合成期間，前肽自原膠原分子釋放且可在血清中檢測到。另外，可量測第I型膠原蛋白的片段作為骨吸收標記。軟骨及骨形成及生長的其它可能生物標記包括聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素(軟骨更新的軟骨特異性標記)、第II型膠原蛋白的前肽(軟骨形成的軟骨特異性標記)、堿性磷酸酶(骨特異性)及骨鈣化素(骨形成的骨特異性標記)。可使用市售試劑盒，例如在來自功效/藥效學活體內研究及來自離體研究的條件培養基的血清中量測軟骨及骨相關生物標記。在一實施例中，在已給予CNP變體的個體中分析或量測至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量以監測CNP變體在活體內對骨及軟骨形成及生長的作用。舉例而言，至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量增加可表明給予CNP變體對骨生長具有積極作用且為適用于與CNP活性降低相關的骨骼發育不良及其它骨或軟骨相關疾病或病癥的治療。例示性骨或軟骨相關生物標記包括(但不限于):CNP(例如內源性含量的CNP)、cGMP、第II型膠原蛋白的前肽及其片段、第II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、第 I型原膠原的前肽(PINP)及其片段、第I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。在一實施例中，通過自將給予、正給予或已給予CNP變體的個體獲得生物樣品來量測生物標記。可使用此項技術中已知的技術來量測生物標記，這些技術包括(但不限于) 蛋白質印跡分析(Western Blot)、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)及酶活性分析法。生物樣品可為血液、血清、尿液或其它生物流體。本文的其它態樣及細節將自以下實例顯而易見，這些實例意欲說明而不具限制性。實施例實例1CNP變體的合成使用本文所述的方法制備CNP變體。在CNP22的野生型序列的各別氨基酸殘基處， 以天然或非天然氨基酸或肽模擬物進行取代，如表1_3(展示于實施例3中)中所示。在某些變體中，將額外氨基酸添加至完整野生型CNP22序列或野生型CNP22序列的一部分的N 末端及/或C末端(參看表3)。亦制備PEG (或ΡΕ0)部分偶聯至CNP22或其變體的N端的CNP變體(參看實施例 3中所示的表4)。聚乙二醇化試劑可獲自表5中所示的商業來源。表 5—喪貨商產品名稱名稱MW(Da)聚乙二醇化試劑
Sunbright~^pfg90k ~CH3(CH2CH20)450-(CH2)5
N0F ME-200CSmPEG20K20，_ COO-NHS
SunbrightmPFG,K,000 CH3(CH2CH20)110-(CH2)5
N0F ME-050CSmPEG5K5，_ COO-NHS
(甲基-PEG12)[CH3(CH2CH20)12]3-(CH2
Pierce 3-PEG4-NHS； ^^' J2,400 CH20)4-NHC0(CH2)3-C00
酯3棚4-NHS
SunbrightmPFG2K2 000 CH3(CH2CH20)45-(CH2)5C
N0F ME-020HSmPEG2K2，000 00_NHS
SunbrightniPFG2K2 non CH3(CH2CH20)45-(CH2)5C
N0F ME-020CSmPEG2K2'000 OO-NHS
SunbrightmPFr,1K! nnn CH3(CH2CH20)23-C0(CH2)
NOF ME-OlOHSmPEG1K1^00 2COO-NHS
甲某
TV Z^A XTTTC廣、…,ΟΠΛ CH3(CH2CH20)24-(CH2)2C
Pierce PEG24-NHSMS(PEG)241,200 ‘ v ’
酯
EZ連接的ρρ012φ物生物素
Pierce NHS-PEG12-^ J940 -(CH2CH20)12-(CH2)2C00-
生物素胃 NHS
Pierce Pmi2-NHSMS(PEG)12690 =^2Oi2O) G(Oi2)I
酉旨
EZ連接的生物素
Pierce NHS-PEG4-生PE04-生物素 590 -(CH2CH20)4-(CH2)2C0〇-物素 NHS 單(乳糖基酰
Pierce 氨基)LSS590
_單(丁二酰亞_
權利要求
1. 一種C型利鈉肽(CNP)的變體，其系選自由以下組成的群GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO:146)；RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO:147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50) (SEQ ID NO:148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO :149)； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO :150)； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO 151)； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO :152)； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)； WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)； ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMS GLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)； RLLQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)； LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO 161)； HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO :162)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34) (SEQ ID NO 163)； NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO :164)； ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)； RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)； KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)； YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)； KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)； GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)； ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)； GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO :178)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)]； PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)； MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP 27)(SEQ ID NO :193)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)] (SEQ ID NO :184)； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R)](SEQ ID NO :189)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4, 5,9R)](SEQ ID NO :194)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PEGlK-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEGlK-Pro-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :189)； PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :194)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE012-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PE012-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Pro-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :189)； PE012-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO :194)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE024-CNP27(K4,5,9R,M22N)](SEQ ID NO :184)； PE024-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Pro-CNP27(K4, 5, 9R) ](SEQ ID NO 189)；及PE024-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :194)。
2.一種醫藥組合物，其包含CNP變體，及醫藥學上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
3.如權利要求2所述的組合物，其為凍干制劑。
4.如權利要求3所述的組合物，其中所述凍干制劑是用包含pH值為約4至約6的緩沖液的制劑制備的。
5.如權利要求4所述的組合物，其中所述緩沖液是檸檬酸/檸檬酸鹽緩沖液或乙酸/ 乙酸鹽緩沖液。
6.如權利要求4或5所述的組合物，其中該凍干制劑用進一步包含等張調節劑或膨脹劑的制劑制備。
7.如權利要求6所述的組合物，其中等張調節劑或膨脹劑選自甘露醇、蔗糖、山梨醇及其組合。
8.如權利要求4-7任一所述的組合物，其中該凍干制劑用進一步包含抗氧化劑的制劑制備。
9.如權利要求8所述的組合物，其中所述抗氧化劑選自甲硫氨酸、抗壞血酸、抗壞血酸的鹽形式、硫甘油及其組合。
10.如權利要求2-9任一所述的組合物，其中該CNP變體是權利要求1所述的CNP變體。
11.一種如權利要求1所述的CNP變體或如權利要求2-10任一所述的藥物組合物， 用于治療選自骨關節炎、低磷酸鹽血癥性佝僂病、軟骨發育不全、軟骨發育低下、身材矮小、侏儒癥、骨軟骨發育不全、致死性軟骨發育不全、成骨不全、軟骨成長不全、斑點狀軟骨發育異常、同型合子軟骨發育不全、斑點狀軟骨發育異常、屈肢骨發育不良、先天性致死性低磷酸酯酶癥、圍產期致死型成骨不全、短肋骨多指綜合征、軟骨發育低下、肢根型斑點狀軟骨發育異常、詹森型干骺端發育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia), 先天性椎體骨飯結構不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita)、骨發育不全癥 (atelosteogenesis)、骨畸形性發育不良(diastrophic dysplasia)、先天性短股骨、朗格型肢中部發育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部發育不良 (Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、羅比接綜合征(Robinow syndrome)、萊茵哈特綜合征(Reinhardt syndrome)、肢端發育不全(acrodysostosis)、周圍性骨發育不全、克尼斯特發育不良(Kniest dysplasia)、纖維軟骨發生(f ibrochondrogenesis)、羅伯茨綜合征(Roberts syndrome)、肢端肢中發育不全(acromesomelic dysplasia)、短肢畸形、莫基奧綜合征(Morquio syndrome)、克尼斯特綜合征(Kniest syndrome)、后生營養性發育不良 (metatrophic dysplasia) ^Wffi^FtliJiM^W^· E^ (spondyloepimetaphyseal dysplasia) 的骨相關病癥或骨骼發育不良。
12.如權利要求11所述的CNP變體或藥物組合物，其中該骨相關病癥或骨骼發育不良為軟骨發育不全。
13.一種如權利要求1所述的CNP變體或如權利要求2-10任一所述的藥物組合物，用于治療選自高血壓、再狹窄、動脈硬化、急性代償失調性心臟衰竭、充血性心臟衰竭、心原性水腫、腎水腫、肝原性水腫、急性腎功能不全及慢性腎功能不全的血管平滑肌病癥。
14.一種重組產生CNP變體的方法，其包括使包含編碼CNP變體多肽的第一多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質的第二多核苷酸的宿主細胞，在培養基中，在可以讓所述多核苷酸編碼的融合多肽表達的條件下培養，其中該融合多肽包含該CNP變體多肽直接連接至該可切割肽或蛋白質或經由接頭與其間接連接。
15.如權利要求14的方法，其中該宿主細胞經表達載體轉化，該表達載體包含編碼該 CNP變體多肽的多核苷酸連接至編碼該可切割肽或蛋白質的該多核苷酸。
16.如權利要求14或15的方法，其中使用異丙基β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)-誘導型載體來增強編碼該融合多肽的該多核苷酸的表達。
17.如權利要求16所述的方法，其中在約20°C至約40°C的溫度下，在約0.4mM至約 1.5mM IPTG存在下培養該宿主細胞一段時間。
18.如權利要求15-17任一所述的方法，其中該載體為質體。
19.如權利要求18的方法，其中該質體選自pjexpress、pjexpress401、 pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pMAL_c2X、 pQE-30、pET-SUMO及 pTYB11。
20.如權利要求14-19任一所述的方法，其中該可切割肽或蛋白質選自組胺酸標簽、 人類轉錄因子TAF12、TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12 (C/ A)、TAF12 (D/E)、TAF12 (4D/4E)、TAF12 (6D/6E)、TAF12 (10D/10E)、TAF12 (C/A 及 D/E)、 TAF12(C/A 及 4D/4E)、TAF12 (C/A 及 6D/6E)、TAF12(C/A 及 10D/10E)、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結合域、BMP-2、 ΒΜΡ-2突變體、BMP-2 (C/A)，及其突變體及片段。
21.如權利要求20所述的方法，其中該可切割肽或蛋白質選自人類轉錄因子TAF12、 TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12 (C/A), TAF12 (D/E), TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/A 及 4D/4E)、 TAF12 (C/A 及 6D/6E)及 TAF12 (C/A 及 10D/10E)。
22.如權利要求14-21任一所述的方法，其中用切割劑切割所述可切割肽或蛋白。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述切割劑選自甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質自切割、因子敘、腸激酶、ProTEV和SUMO蛋白酶。
24.如權利要求14-23任一所述的方法，其特征在于，該宿主細胞為細菌。
25.如權利要求M的方法，其中該細菌宿主細胞為大腸桿菌(E.coli)。
26.如權利要求25所述的方法，其中該大腸桿菌細胞選自BL21、BL21(DE3)、 BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3) pGro7、ArcticExpress (DE3)、C41 (DE3)、C43 (DE3)、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。
27.如權利要求沈所述的方法，其中該大腸桿菌細胞為BL21(DE3)。
28.如權利要求14-27任一所述的方法，其中該融合多肽表達為可溶蛋白質或包涵體。
29.如權利要求14- 任一所述的方法，其進一步包含自該宿主細胞或培養基分離該所表達的融合多肽。
30.如權利要求四所述的方法，其進一步包含使該經分離的融合多肽與選自由以下組成的群的切割劑接觸甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質自切割、因子)Ca、腸激酶、ftx)TEV 及SUMO蛋白酶。
31.如權利要求30所述的方法，其中該切割劑為甲酸。
32.如權利要求30或31所述的方法，其中在約至約10%甲酸存在下，在約50°C至約70°C的溫度下，由該經分離的融合多肽與切割劑接觸。
33.如權利要求32所述的方法，其中在甲酸存在下，進行該接觸約5小時至約36小時。
34.如權利要求14-33任一所述的方法，其產生選自由以下組成的群的CNP變體R-CNP22 (K4R)(類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ER-CNP22 (K4R)(類似物 ΒΑ) (SEQ ID NO :39)； GANPR-CNP22 (K4R)(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)； GANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CH) (SEQ ID NO 69)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (類似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (類似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (類似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (類似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (類似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (類似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHS SGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO :68)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)] (SEQ ID NO :184)； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :189)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :194)； GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)； PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；及 MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27) (SEQ ID NO :193)。
35.如權利要求14-34任一所述的方法，其不產生CNP-22或CNP-53。
36.一種根據如權利要求14-33任一所述的方法產生的CNP變體，其中該CNP變體選自R-CNP22 (K4R)(類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)； ER-CNP22 (K4R)(類似物 BA) (SEQ ID NO 39)； GANPR-CNP22 (K4R)(類似物 Cl) (SEQ ID NO 37)； GANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CH) (SEQ ID NO 69)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (類似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (類似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (類似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (類似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (類似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (類似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO :68)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4, 5，9R，M22N)]； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5，9R)]； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met_CNP27(K4, 5，9R)]；GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSM SGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)；PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；及MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :193)。
37.一種包含表達載體的宿主細胞，該載體包含編碼CNP變體多肽的第一多核苷酸連接至編碼可切割肽或蛋白質的第二多核苷酸。
38.如權利要求37的宿主細胞，其中該可切割肽或蛋白質選自組胺酸標簽、人類轉錄因子TAF12、TAF12片段、TAF12組蛋白折疊域、TAF12的突變體及其片段、TAF12(C/A)、 TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(1OD/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/ A及4D/4E)、TAF12 (C/A及6D/6E)、TAF12 (C/A及10D/10E)、酮類固醇異構酶、麥芽糖結合蛋白、β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、硫氧還蛋白、殼多糖結合域、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-2突變體、BMP-2 (C/A)，及其突變體及片段。
39.如權利要求37或38所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌。
40.如權利要求39所述的宿主細胞，其中所述細菌宿主細胞是大腸桿菌。
41.如權利要求40的宿主細胞，其中所述大腸桿菌選自BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、BL21 (DE3)pGro7、ArcticExpress (DE3)、C41 (DE3)、C43 (DE3)、Origami B (DE3)、 Origami B(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。
42.如權利要求41所述的宿主細胞，其中所述大腸桿菌是BL21(DE3)。
43.如權利要求37-42任一所述的宿主細胞，其中所述載體是質粒。
44.如權利要求43的宿主細胞，其中所述質粒選自pJeXpreSS、pJeXpreSS401、 pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pMAL_c2X、 pQE-30、pET-SUMO及 pTYBll。
45.如權利要求37-44任一所述的宿主細胞，其中在細胞培養前用載體轉化宿主細胞。
46.如權利要求37-45任一所述的宿主細胞，其中在適于表達由所述多核苷酸編碼的融合多肽的條件下，于培養基中培養該宿主細胞，其中該融合多肽包含該CNP變體多肽直接連接至該可切割肽或蛋白質或經由接頭與其間接連接。
47.如權利要求46的宿主細胞，其中該融合多肽表達為可溶蛋白質或包涵體。
48.如權利要求46或47所述的方法，其中從該宿主細胞或培養基分離該所表達的融合多肽。
49.如權利要求48所述的宿主細胞，其中使該經分離的融合多肽與選自由以下組成的群的切割劑接觸甲酸、溴化氰(CNBr)、羥胺、蛋白質自切割、因子fe、腸激酶、ftx)TEV及 SUMO蛋白酶。
50.如權利要求37-49任一所述的宿主細胞，其中該CNP變體多肽不是CNP-22或 CNP-53。
51.一種評估CNP肽或變體對個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記含量的影響的方法，其包括分析來自已給予CNP肽或變體的個體的生物樣品中至少一種骨或軟骨相關生物標記的該含量。
52.如權利要求51的方法，其進一步包含對該個體給予該CNP肽或變體，隨后分析該至少一種骨或軟骨相關生物標記的該含量。
53.一種治療CNP反應性病狀或病癥的方法，其包括對個體給予CNP肽或變體，及監測該個體中至少一種骨或軟骨相關生物標記的含量，其中該至少一種骨或軟骨相關生物標記的該含量增加，表示該CNP肽或變體對該個體或該病狀或病癥具有治療作用。
54.如權利要求53所述的方法，其進一步包括調整該CNP肽或變體的給藥量或給藥頻率，其中i)若所述至少一種骨或軟骨相關生物標記的所述含量低于目標含量，則增加該CNP肽或變體的給藥量或給藥頻率；或 )若所述至少一種骨或軟骨相關生物標記的所述含量高于目標含量，則降低所述 CNP肽或變體的給藥量或給藥頻率。
55.如權利要求51-M任一所述的方法，其中所述至少一種骨或軟骨相關生物標記選自CNP、cGMP、II型膠原蛋白的前肽及其片段、II型膠原蛋白及其片段、骨鈣化素、增殖細胞核抗原(PCNA)、1型原膠原的前肽(PINP)及其片段、I型膠原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸軟骨素及堿性磷酸酶。
56.如權利要求51-55任一所述的方法，其中所述CNP肽或變體選自 R-CNP22 (K4R)(類似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；GANRR-CNP22 (K4R)(類似物 AY) (SEQ ID NO 36)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (類似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (類似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (類似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (類似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (類似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (類似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (類似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (類似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (類似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(類似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(類似物 CD) (SEQ ID NO :68)；GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53) (SEQ ID NO:4)；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52) (SEQ ID NO:146)；RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO:147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50) (SEQ ID NO:148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO :149)； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO :150)； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO 151)； SRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO :152)； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)； WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)； ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)； RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)； LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO :161)； HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35)(SEQ ID NO :162)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34)(SEQ ID NO :163)；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO :164)； ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)； RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)； KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)； YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)； KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)； GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)； ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)； NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)； GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :1)； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)；GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO :178)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO 191)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)；MGQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met_Gly_CNP37)(SEQ ID NO 191)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)；GHKSEVAHRFKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA_CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)；PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :193)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO :184)；PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :189)；MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :194)；PEG1K-CNP22(SEQ ID NO :1)；PE012-CNP22(SEQ ID NO :1)；PE024-CNP22(SEQ ID NO :1)；PE012-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)；PE024-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)；PE012-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :39)；PE024-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :39)；PE012-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :37)；PE024-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :37)；PE012-GANQQ-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :69)；PE024-GANQQ-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :69)；PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PEGlK-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEGlK-Pro-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :189)； PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :194)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE012-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PE012-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Pro-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :189)； PE012-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO :194)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE024-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PE024-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Pro-CNP27(K4, 5, 9R) ](SEQ ID NO: 189)；及PE024-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :194)。
57.如權利要求56所述的方法，其中所述CNP肽或變體不是CNP-22或CNP-53。
全文摘要
本申請公開文本提供一種C型利鈉肽(CNP)的變體、包含CNP變體的醫藥組合物，及制造CNP變體的方法。這些CNP變體適用于治療CNP反應性疾病的治療劑，這些疾病包括(但不限于)骨相關病癥，諸如骨骼發育不良(例如軟骨發育不全)，及血管平滑肌病癥(例如再狹窄及動脈硬化)。
文檔編號G01N33/53GK102481330SQ201080023189
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月20日 優先權日2009年5月20日
發明者A·O·奧克哈馬菲, C·P·普賴斯, D·J·文特, M·C·維拉德, S·卡斯蒂略, 美佳·青柳-史考伯, 龍世農 申請人:生物馬林藥物股份有限公司