一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法。苦苣苔科植物的新鮮嫩葉；選擇番茄為主要內參，水稻為第二內參，并依據番茄基因組大小為標準對水稻基因組大小進行重新校對；按照1ml核提取緩沖液LB01中加入20mg嫩葉的量，分別將目的植物和內參物種的嫩葉加入核提取緩沖液LB01中，然后將嫩葉切碎，用50μm孔徑的過濾網過濾獲得細胞核懸液，置于冰上備用；再用RNA消化酶消化細胞核懸液中的RNA，然后加入碘化丙啶熒光染色，終濃度為100μg?ml-1，避光染色，染色時間為40min；然后再應用流式細胞儀測定目的植物的基因組大小。本發明能為多種苦苣科植物測定了準確的基因組大小，變異系數CV低于5％，該方法重復性好，操作簡單，符合苦苣科植物學方面的研究。
【專利說明】一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法

【技術領域】
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[0001]本發明屬于分子遺傳與進化研究領域，具體涉及一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法。

【背景技術】
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[0002]基因組大小(C-value)是指單倍體細胞核的DNA含量，基因組大小變異是物種形成和進化的重要原動力之一，越來越多的研究表明基因組大小在諸多關鍵的生物研究領域，如生態學、細胞學、分子生物學、系統學和進化生物學等方面，具有重要的理論及實際應用意義。理論預期，基因組的大小和物種的復雜程度成正比，即越簡單的物種，其基因組越小；越復雜的物種，其基因組越大。越來越多的研究表明即使是屬于同一門類的物種，它們的基因組大小的變化也可能非常大，而物種之間的復雜性卻相差不大，即所謂的"C值悖論"。為了更好的理解物種的復雜性和其基因組大小之間的關系，對基因組大小的準確估計就顯得越來越重要。
[0003]流式細胞術(Flow cytometry, FCM)是測定植物基因組大小快速而有效的方法。然而，植物體內大量次生代謝物質的存在(如花青素等)會極大的降低PI熒光染色強度，嚴重影響FCM方法測定基因組大小的準確性及有效性，進而導致基因組大小的后續分析及應用產生極大的偏差，在植物分類學、進化生物學、分子遺傳學等方面的研究中出現錯誤的結果及結論。因此，在測定基因組大小之前，確定目的物種最適合的FCM測定方法，包括細胞核的提取、染色等技術條件至關重要。
[0004]苦苣苔科(Gesneriaceae)植物是我國喀斯特地區的特色類群，在全世界約有150屬3700種，我國分布有58屬470余種。該科在我國的分布和特有中心在我國南方喀斯特地區，由于喀斯特地區生境的高度異質性，苦苣苔科植物的功能性狀具有強烈分化，表明該屬植物是一個開展喀斯特地區植物對環境適應的理想模式系統，對于研究喀斯特生物多樣性對環境變化的響應與適應具有重要意義。由于喀斯特土壤的低保水能力，周期性水資源缺乏，營養貧瘠等特點對該地區植物物種產生了較強的選擇壓力。之前的研究表明，土壤營養缺乏及非生物選擇壓力如干旱、強光、低溫等，可以誘導葉片花青素等次生代謝物質的合成。因此，喀斯特生境的選擇壓力可能會影響FCM測定該區域植物基因組大小的準確性。盡管該植物類群在我國喀斯特生境適應進化及資源保護研究中具有重要地位，其最適合的基因組大小測定方法尚未明確。
[0005]可見，優化該類群基因組大小測定的FCM方法對于其后續生物學研究如系統分類學、進化遺傳學具有重要的理論及實際意義。明確其最適合的測定方法，才能保證基因組大小測定的準確性，及后續研究如系統分類、與生態及適合度特征的相關性等分析的有效性，對我國喀斯特特殊生境地區特色植物類群的適應性進化機制的研究具有重要的推動作用。


【發明內容】

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[0006]為了解決苦苣苔科植物基因組大小準確測定的技術障礙及其后續植物分類學、進化生物學、分子遺傳學等研究的實際應用，本發明的目的是提供一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法。
[0007]本發明的適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]材料準備:苦苣苔科的目的植物的新鮮嫩葉；
[0009]內參選擇:儀器調試后進行樣品熒光強度及基因組大小的預測(1C約為
0.5-1.1pg),根據預測基因組大小選擇番爺(Solanum lycopersicum cv.1Stupickepolnirane>, IC = 0.98pg)為主要內參，水稻(Oryza sativa ssp.japonica, IC = 0.43-0.45pg)為第二內參，并依據番茄基因組大小為標準對水稻基因組大小進行重新校對；
[0010]制備細胞核懸液:目的植物和內參物種，按照Iml核提取緩沖液LBOl中加入20mg嫩葉的量，分別將目的植物和內參物種的嫩葉加入核提取緩沖液LBOl中，然后將嫩葉切碎，用50 μ m孔徑的過濾網過濾獲得細胞核懸液，置于冰上備用，所述的核提取緩沖液 LBOl 的配方為:15mM Tris、2mM Na2EDTA、0.5mM spermine.4HCl、80mM KCl、20mM NaCl,15mM^-mercaptoethanol>0.1% (v/v) Triton X-100, pH7.5 ；
[0011 ] 再用RNA消化酶消化細胞核懸液中的RNA，RNA消化酶終濃度為50 μ g ml—1 ;然后加入碘化丙啶熒光避光染色；最后應用流式細胞儀測定目的植物的基因組大小。
[0012]優選，所述碘化丙啶的終濃度為100 μ g ml-1，染色時間為40min。
[0013]本發明根據苦苣科植物的性質，從影響流式細胞術檢測基因組大小的因素入手，為多種苦苣科植物測定了準確的基因組大小，變異系數CV(coefficient of variat1n)低于5%，該方法重復性好，操作簡單，符合苦苣科植物學方面的研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
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[0014]圖1是采用本發明的核提取緩沖液LBOl和其他buffer (de Laat’s、Galbraith’S、General Purpose、MgS04、Partec、Tris.MgCl2 和 Woody Plant)測定線葉報春苣苔的峰圖及其CV值得比較；
[0015]圖2是24h黑暗處理和未黑暗處理對懷集報春苣苔及舌柱報春苣苔基因組大小測定(ungated未設門)的比較。
[0016] 圖3是采用本發明的方法測定線葉報春苣苔的峰圖及其CV值。

【具體實施方式】
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[0017]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0018]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0019]下述實施例中所使用材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0020]實施例1:
[0021]以線葉報春苣苔為例，采集線葉報春苣苔、番爺(Solanum lycopersicumcv.1Stupickepolni raneO 以及7jC稻(Oryza sativa ssp.japonica, IC = 0.43-0.45pg)嫩葉各20mg，以番茄為主要內參，水稻為第二內參，并依據番茄基因組大小為標準對水稻基因組大小進行重新校對；分別在滴有Iml核提取緩沖液LBOl的培養皿中，用鋒利刀片快速分別將線葉報春苣苔、番茄和水稻切碎，用50 μ m的過濾網過濾獲得細胞核懸液，置于冰上備用；加入RNA消化酶，終濃度為50 μ g ml—1，消化半小時；加入碘化丙啶(PI)染色，終濃度為100 μ g ml—1 ;避光染色，染色時間為40分鐘；采用德國Partec公司的流式細胞儀(型號CyFlow Space)對其基因組進行測定，采用488nm激光激發，由FL2通道檢測熒光強度，每個樣品測定5000個以上的細胞核，使用隨機軟件FloMax2.80進行數據獲取和分析，每個峰的細胞核數量及其CV值可通過該軟件直接獲得，通過在PI vs.SSC的散點圖上手動繪制多邊門(Polygon gates),可以進一步去掉多余的碎片(debris),獲取更高質量的峰圖。由此可獲得線葉報春苣苔的基因組大小，約為0.66pg，其峰圖見圖3，CV值為3.51%。
[0022]實施例2:
[0023]本實施例與實施例1基本相同，只是材料為苦苣苔科植物報春苣苔屬的100多個物種，經測定，所獲得的結果質量均較好，其CV值均低于5%。
[0024]對比例1:
[0025]本對比例與實施例1基本相同，只是將核提取緩沖液LBOl換成de Laat’ S、Galbraith，S、General Purpose、MgS04、Partec、Tris.MgCl2 和 Woody Plant 七種緩沖液,其他步驟與實施例1相同，測試得到的峰圖及其CV值見圖1，從圖1可以看出，用核提取緩沖液LBOl的CV為3.51 %，而其他緩沖液的CV值均比較高。
[0026]對比例2:
[0027]本對比例與實施例1基本相同，只是有兩點不同:
[0028]1、物種不同:本對比例的材料為懷集報春苣苔及舌柱報春苣苔；
[0029]2、避光染色，染色時間為24小時或者未避光染色，染色時間為24小時，其他步驟與實施例1相同。
[0030]測試得到的峰圖及其CV值見圖2，從圖2可以看出，24小時的避光染色以及未避光染色，其CV值都比較高，特別是黑暗處理，其CV值更高。
【權利要求】
1.一種適用于苦苣苔科植物基因組大小的測定方法，其特征在于，包括以下步驟: 材料準備:苦苣苔科的目的植物的新鮮嫩葉； 內參選擇:儀器調試后進行樣品熒光強度及基因組大小的預測，根據預測基因組大小選擇番茄為主要內參，水稻為第二內參，并依據番茄基因組大小為標準對水稻基因組大小進行重新校對； 制備細胞核懸液:目的植物和內參物種，按照Iml核提取緩沖液LBOl中加入20mg嫩葉的量，分別將目的植物和內參物種的嫩葉加入核提取緩沖液LBOl中，然后將嫩葉切碎，用50 μ m孔徑的過濾網過濾獲得細胞核懸液，置于冰上備用，所述的核提取緩沖液LBOl 的配方為:15mM Tris、2mM Na2EDTA、0.5mM spermine.4HCl、80mM KCl、20mM NaCl,15mM β -mercaptoethanol、0.I % (v/v)Triton X-100，pH7.5 ； 再用RNA消化酶消化細胞核懸液中的RNA，RNA消化酶終濃度為50 μ g ml—1 ;然后加入碘化丙啶熒光避光染色；最后應用流式細胞儀測定目的植物的基因組大小。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述碘化丙啶的終濃度為10ygπι1，染色時間為40m in。
【文檔編號】G01N15/14GK104075983SQ201410250566
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】王靜, 劉娟, 康明 申請人:中國科學院華南植物園