專利名稱：棗樹水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉 及基因工程技術領域，具體為一種棗樹水通道蛋白基因及在提高植物耐 旱性和耐鹽性中的應用。
背景技術：
公知，水通道蛋白(aquaporin，AQP)大量存在于植物、動物、微生物等多種生物體 內。植物水通道蛋白是一類在植物體內形成水選擇性運輸通道的蛋白質，它在植物種子萌 發、細胞伸長、氣孔運動等過程中調節水分的快速跨膜運輸，它使植物能快速靈敏地調節細 胞內與細胞間的水分流動。有些水通道蛋白是組成型表達的，而多數水通道蛋白則受環境 因子，如干旱、鹽害、激素、光質等誘導表達，因此研究水通道蛋白與植物抗逆性的關系備受 人們關注。第一個植物水通道蛋白Y-TIP是從模式植物擬南芥中分離出來的，它位于液泡 膜上，因此被命名為TIP(tonoplast intrinsic protein)。通過爪蟾卵母細胞表達系統分 析確認了 Y-TIP蛋白運輸水的專一性功能。到目前為止，科學家已經在擬南芥、豌豆、煙 草、玉米、水稻等多種植物中都發現了 AQP。另外，從蛋白數據庫中也發現了大量AQP的同源 物，它們廣泛存在于單子葉和雙子葉植物以及C3和C4代謝植物中，通過氨基酸序列同源性 分析推測它們可能也是AQP。越來越多的研究表明，大多數植物中都存在著多個AQP及其 同源物且含量豐富。如擬南芥中，PIPl蛋白占葉與根質膜蛋白的以上；菠菜葉肉細胞 中含豐富的質膜AQP，占其質膜總蛋白的20% ；菜豆子葉中含豐富的a-TIP同源物，約占細 胞可抽提總蛋白的2%。根據水通道蛋白氨基酸序列同源性及結構特征，可將其分為4類 質膜內在蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIPs)、液泡膜內在蛋白(tonoplast intrinsic protein,TIPs)、類nodulin26膜內蛋白(nodulin26_like intrinsic protein, NIPs)和小分子堿性內在蛋白(small and basic intrinsic protein，SIPs)。植物水通道蛋白的發現是植物水分生理學研究的重大進展，將水分代謝的研究引 入了一個全新的階段。目前，科學家們已經在擬南芥、豌豆、玉米、煙草、向日葵、含羞草等多 種植物中發現了 AQP，并對它們中的某些蛋白進行了分類、功能、亞細胞定位等方面的研究。 但是對于中國古老的、重要的經濟樹種——棗樹的水通道蛋白的研究還沒有相關的報道， 到目前為止，還未見有從棗樹中分離出AQP基因并用于提高植物耐旱性和耐鹽性方面的報 道。棗樹原產于我國黃河流域，是我國特有的經濟林樹種之一，棗樹耐寒，抗旱，抵御各種 外界不良因子的能力強，尤其是對土壤瘠薄、干旱有很強的忍耐力，在晉西北、太行山、陜北 等黃土高原地區，棗樹一般生長在土壤相當貧瘠、少雨干旱的丘陵山坡、高崖邊等不良環境 下，且都能正常生長結果。這種極其耐旱、耐瘠薄的特點顯著優于其它農作物，因此棗樹的 抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源，了解具有優良抗性的棗樹的抗逆機制，逆境相關基因 的分子結構、表達、功能及調控，可充分利用這些優良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定 的實驗數據和奠定理論基礎。
發明內容

本發明的目的在于提供一種棗樹水通道蛋白基因，該基因來自于棗樹，可作為目 的基因導入植物，提高植物耐旱性和耐鹽性，進行植物品種改良。本發明是采用如下技術方案實現的一種棗樹水通道蛋白基因，該基因的核苷酸 序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列。由所述一種棗樹水通道蛋白基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該氨基酸序列 具有如SEQ ID NO :2所示的序列。一種棗樹水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應用。本發明從壺瓶棗樹(Ziziphus jujuba Mill. HUPING)的結果枝(棗吊)，利用CTAB 法提取總RNA，根據mRNA純化試劑盒方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA，構建cDNA文 庫，然后通過Blast分析與比對，從中克隆到一個cDNA序列為棗樹中的水通道蛋白基因全 序列，將其命名為 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic protein)。 根據該基因的核苷酸序列，設計并合成引物，上游引物WP3序列為5' —ATGGATCC]ΑΤ<^'GCAAAAGACCCTG-3‘，包含 BamH I 限制性酶切位點(即有下
劃線部分)，兩個保護堿基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密碼子ATG。下游引物WP6 序列為5' —ATACCCGGGjTCA]AACATGAGGGTT-3‘，包含Sam I 限制性酶切位點(即有下劃 線部分)，三個保護堿基ATA，及水通道蛋白Z jPIP2基因的終止密碼子TGA (反向序列)。引 物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。然后使用PCR技術成功擴增出ZjPIP2的目 的基因片段，電泳分析ZjPIP2基因的cDNA序列全長為846bp，編碼281氨基酸，其中包含有 16個酸性氨基酸，19個堿性氨基酸，蛋白質的相對分子量為29. 87KD，理論等電點為8. 77。 多重比對表明ZjPIP2與其他水通道蛋白有非常高的同源性，特別是與菜豆PIP2的同源性 達到88%。而且，ZjPIP2蛋白序列當中含有MIP家族典型的保守氨基酸序列“HINPAVIFG” 和兩個“NPA”保守肽段。進化樹分析表明棗樹ZjPIP2和茄科煙草屬的粉藍煙草親緣關系 最近。特別是三級結構的分析暗示著ZjPIP2跟菠菜水通道蛋白相似，推測其功能有著類似 性。上述同源性分析、氨基酸序列特性分析以及氨基酸序列的進化樹分析、三級結構預測等 分析手段是本領域普通技術人員所熟知的常規驗證手段，通過上述多重對比分析，即可證 明本發明克隆得到的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列即為本發明所述的棗樹水通道蛋 白基因的序列，而且其蛋白功能也被唯一確定。本發明在PCR克隆得到ZjPIP2基因后，經限制性內切酶修飾后連接到植物表 達載體PBI121上，經含卡納霉素的LB平板篩選、PCR、酶切、測序等方法證明植物表達載 體pBII21-ZjPIP2構建成功。通過凍融法將植物表達載體pBI121_ZjPIP2轉入根癌農桿 菌LBA4404的感受態細胞中，經含卡納霉素的YEB平板篩選、PCR鑒定等方法證明工程菌 pBI121-ZjPIP2-L構建成功。農桿菌介導ZjPIP2基因轉化擬南芥，經含卡納霉素的1/2MS 培養基篩選獲得含有目的基因ZjPIP2的轉基因擬南芥植株，然后對轉基因植物及其Tl代 進行耐鹽性評價及耐旱性性評價，經在0. IM NaCl溶液連續處理3天(鹽處理)或是不澆 任何液體(干旱處理)，觀察其生長表現，均能夠在正常生長條件下恢復。
此外，本發明為了進一步研究ZjPIP2基因在棗樹體內的表達，分別對盆栽壺瓶棗 樹苗進行干旱、NaCl脅迫處理，并以未作任何處理的正常壺瓶棗樹苗為對照，研究逆境因素 對ZjPIP2基因表達的影響，當處理過的樹苗出現嚴重卷葉、枯黃現象時，立即采樣并速凍 保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的對照及脅迫處理過的植物材料的總RNA，經 OD260值的測定、甲醛變性膠電泳等方法檢測證明所提RNA純度高、無降解，質量合格。反轉 錄所提總RNA，RT-PCR分析得Z jPIP2基因在植物莖、葉中的表達比較穩定，同時證實ZjPIP2 可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導表達。與現有技術相比，本發明首次發現并從棗樹中克隆出棗樹水通道蛋白基因 ZjPIP2，該基因可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽性和耐旱性，以進行植物品種改 良，明確了具有優良抗性的棗樹的抗逆機制，逆境相關基因的分子結構、表達、功能及調控， 為進一步充分利用這些優良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的實驗數據，奠定了一 定的理論基礎。


圖1為目的基因ZjPIP2的PCR擴增結果圖；圖2為pBI121載體及目的基因ZjPIP2的雙酶切圖譜；圖3為重組質粒pBI121_ZjPIP2的酶切圖譜；圖4為植物表達載體pBI121_ZjPIP2的構建過程示意圖；圖5為工程菌pBI121-ZjPIP2_L的PCR鑒定圖譜；圖6(a)為棗樹不同環境、組織器官中內參基因ZjH3的差異性表達圖譜一；圖6(b)為棗樹不同環境、組織器官中內參基因ZjH3的差異性表達圖譜二 ；圖7為ZjPIP2基因在不同環境、組織器官的差異性表達圖譜。
具體實施例方式一、棗樹水通道蛋白基因ZjPIP2的獲得春天采集壺瓶棗樹(Ziziphus jujuba Mill.HUPING)長度約2mm的結果枝(棗 吊)，利用CTAB法提取總RNA，根據mRNA純化試劑盒(貨號:Z5200)購自Promega (美國) 方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA。利用cDNA文庫構建試劑盒(貨號18248_039) 購自Invitrogen (美國)構建cDNA文庫。將獲得的文庫中的cDNA與克隆載體pSPORTl連 接，連接產物轉化至E. coli DH5a感受態細胞，涂布于含有氨芐青霉素抗性的平皿37°C培 養過夜，藍白斑篩選重組質粒，并隨機挑選部分質粒委托上海生工測序。將測序結果利用NCBI (www, ncbi. nlm. nih. rov/)在線分析軟件進行Blast分 析，結果表明其中的一個cDNA序列為棗樹中的水通道蛋白同源基因全序列。將其命名為 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic nrotein)。根據上述已經獲得的棗樹水通道蛋白基因的精確核苷酸序列設計并委托上海生 工生物工程技術服務有限公司合成如下引物，用于ZjPIP2基因的克隆。上游引物WP3序 列為5' -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘，包含BamH I限制性酶切位點(即有下劃線部 分)，兩個保護堿基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密碼子ATG。下游引物WP6序列為 5 ‘ -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘，包含Sam I限制性酶切位點(即有下劃線部分)，三個保護堿基ATA，及水通道蛋白ZjPIP2基因的終止密碼子TGA。引物由上海生工生物工程 技術服務有限公司合成。以克隆載體pSP0RTl_ZjPIP2為模板，以WP3和WP6為引物，擴增獲得含完整 開放閱讀框的棗樹水通道蛋白基因。PCR反應體系組成為5 μ L 10XPCR buffer, 1 μ L 2. 5MmdNTPs, IOpmol WP3, IOpmol WP6,1. 5U Taq DNA聚合酶，50ng 的模板，去離子水補充體 IRM 50 μ L0 PCR 擴增條件為:95°C預變性 5min，94°C 30s、54°C 30s,72°C Imin 35 個循環， 最后72°C延伸5min。取5yL PCR產物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析確認片段大小。按照DNA純化試劑 盒說明操作，純化PCR產物。二、ZJPIP2基因植物表達載體的構建
1、材料、試劑與儀器1.1載體和菌株植物表達載體PBI121均由山西省農業科學院生物技術研究中心園藝作物研究室 保存，大腸桿菌(E. coli)DH5a、含ZjPIP2基因的重組質粒pSP0RTl_ZjPIP2。1. 2酶與試劑盒限制性內切酶 BamH I、Sma I、Xba I、Sac I、DNA Ligation Kit、RNA 酶、 PrimeScript RT reagent Kit、 Taq _、 dNTP Mixture> DNA Marker(15000bp>2000bp ladder)均購自大連TaKaRa (寶生物)工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 QIAquick 購自 QIAGEN 公司。1. 3常用試劑及培養基卡那青霉素(100mg/mL)，酚氯仿異戊醇(V V V = 25 24 1)葡萄糖溶液(IM)EDTA (0. 5M, ρΗ8· 0)10ΧΤΒΕ電泳緩沖液硼酸55.2g/LTris108g/LEDTA (0. 5M, ρΗ8· 0) 40mL10% SDS (pH7. 2)NaOH (2M)Tris-HCl (1M, pH8. 0)醋酸鈉(3M，pH5.2)TE 溶液(IOmM Tris-Hcl, IMm EDTA, pH8. 0)LB培養基(固體培養基加瓊脂0. 15g/L)蛋白胨0. lg/L酵母提取物 0.05g/LNaCl0. 05g/L2實驗方法2. 1大腸桿菌DH5 α感受態細胞的制作
用CaCl2法制備大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態細胞，具體方法見精編分子生物 學實驗指南。2. 2PCR引物的設計與合成根據棗樹水通道蛋白基因cDNA編碼的序列，設計帶有Ba mH I和Sam I酶切位點 的特異性引物，并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用于ZjPIP2基因及組蛋 白基因的克隆。ZjPIP2 基因的上游引物 WP3 序列為5 ‘ -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘，包含 BamH I限制性酶切位點(即有下劃線部分)，兩個保護堿基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因 的起始密碼子ATG。下游引物WP6 的序列為5' -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘，包含 Sam I 限制 性酶切位點(即有下劃線部分)，三個保護堿基ATA，及水通道蛋白ZjPIP2基因的終止密碼 子 TGA。2. 3質粒pBI121和pSP0RTl_ZjPIP2的少量制備及目的基因ZjPIP2的擴增2. 3. 1 載體 pBI121、pSP0RTl-ZjPIP2 的少量制備pSP0RTl-ZjPIP2質粒的DH5 α菌液用2mL的LB液體培養基加1 μ 1氨芐青霉素 (100mg/mL)接菌后37°C過夜培養所得。含pBI121質粒的DH5 α菌液則用2mL的LB液體 培養基加1 μ L卡那青霉素(100mg/mL)接菌后37°C過夜培養所得。堿裂解法快速提取質粒pBI121、pSP0RTl_ZjPIP2的具體步驟見精編分子生物學
實驗指南。最后將干燥的質粒溶于20 μ 1 TE中，-20°C保存備用。2. 3. 2目的基因序列的擴增以克隆載體pSPORTl (攜帶目的片段)為模板，用設計的特異性引物進行PCR擴增 以獲得含完整開放閱讀框的棗水通道蛋白基因。先利用梯度PCR技術設置不同的退火溫 度，找出最佳退火溫度為54°C。PCR擴增 ZjPIP2 基因的反應體系10 X PCRbuffer 5 μ 1 (含Mg 離子)，dNTP 1 μ 1, 上下游引物各1μ l(20pmol/L)，rTaq聚合酶0. 3 μ 1，模板DNA 1 μ 1 (2. 3 μ g/μ 1)，滅菌超 純水加40. 7 μ 1至總體積為50 μ 1。擴增條件為95°C預變性5min，94°C變性lmin，54°C退 火lmin，72°C延伸2min，共40個循環，最后72°C延伸5min。2. 4目的基因ZjPIP2和載體pBI121的準備因為PCR擴增獲得的目的基因片段兩端及PBI121載體的多克隆位點都具有BamH I和Sma I限制性酶切位點，利用BamH I和Sma I分別雙酶切目的基因Z jPIP2的PCR產物 及載體PBI121，使它們都具有相同的粘性末端，為連接載體做準備。PCR產物的酶切反應體系 注PCR產物的體積依據其濃度而定，最少酶切1 2 μ g目的基因片段。最后加 超純水至總體積為50 μ 1。載體pGEX-4T-l的酶切反應體系 酶切后分別取5μ 1雙酶切產物，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，確認片段大小 都與預期相吻合。2. 5酶切產物的純化及連接按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒QIAquick 里的說明書進行操作，純化雙酶切后 的目的基因片段和載體。用T4DNA連接酶將純化后的pBI121載體與ZjPIP2基因片段進行連接。將載體 PBI121的DNA與欲插入的目的基因ZjPIP2的DNA片段混合制備成體積為5 μ L左右的DNA 溶液(載體DNA和插入DNA的摩爾數比一般為0. 03pmol 0. 1 0. 3pmol)，向上述DNA溶 液中加入等體積的DNA Ligation Kit中的Solution I，充分混勻。連接反應體系總體積為 10 μ 1左右，16°C反應過夜。采用設計構建植物表達載體pBI121-ZjPIP2。2. 6連接產物的轉化將100 μ 1的新鮮或保存于_70°C的大腸桿菌感受態細胞DH5 α加入到上面的連接 產物中，輕輕混勻，冰上放置30min。放入預加溫到42°C的循環水浴中熱休克90s，快速將 管轉移到冰浴中，使細胞冷卻3 5min。加400 μ L的LB培養基，將管轉移到37°C的搖床 上，溫浴40min使細菌復蘇，復蘇期應溫和的搖動細胞(轉速低于225轉/min)。將適當體 積的已轉化感受態細胞轉移到LB平板(含氨芐青霉素)，涂勻。將平板置于室溫直至液體 被吸收，倒置平板，37°C靜置培養過夜。2. 7轉化產物的鑒定2. 7. IPCR 鑒定待轉化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上長出菌落后，用無菌牙簽挑取轉化單菌落至50 μ L超純水中，沸水浴5min使菌裂解。取1 μ 1作為模板進行PCR陽性鑒定，反應體 系為10 XPCR buffer 1. 5 μ 1 (含 Mg 離子)，dNTP 0. 2 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/ L)，rTaq聚合酶0. 1 μ 1，模板DNA 1μ 1 (2. 3 μ g/ μ 1)，滅菌超純水加11. 2 μ 1至總體積為 15μ 1。擴增條件同前，將鑒定為陽性的轉化體劃線培養。2. 7. 2酶切鑒定將PCR鑒定為陽性的克隆子用堿裂減法提取質粒DNA后，質粒pBI121_ZjPIP2用 XbaI和Sac I進行雙酶切鑒定，再用Sma I和Sac I進行雙酶切鑒定。載體pBI121_ZjPIP2的Xba I和Sac I雙酶切反應體系 載體pBI121_ZjPIP2的Sma I和Sac I雙酶切反應體系 S. D. W 6 μ 1瓊脂糖凝膠電泳酶切液，驗證片段的大小，保存有目的片段的陽性菌落。并將陽性 菌株送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序，驗證重組質粒讀碼框的正確性。3、ZJPIP2基因植物表達載體構建的結果與分析3. lZjPIP2cDNA 的擴增利用設計的特異性上下游引物進行PCR擴增后，產物在1. 0%瓊脂糖中電泳，經EB 染色后在紫外燈下觀測到一條約850bp的條帶，如圖1所示，圖中M :DL2000Marker ；1,2 PCR產物，與所設計的擴增目的片段大小吻合。3. 2目的基因片段及載體片段的制備將PCR產物和pBI121質粒用BamH I和Sma I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖電泳，結 果如圖 2 所示，圖中，Ml :DL15000Marker ；1 :pBI121 酶切產物；M2 :DL2000Marker ；2 目的 基因酶切產物，PCR產物大小約為850bp，pBI121載體片段分別約為14. 7Kb，與預期結果相 符。分別用試劑盒純化目的片段與載體片段，用于連接。3. 3重組質粒的鑒定從含有卡那霉素的培養基上挑取陽性單菌落進行PCR鑒定，如圖3所示，圖中，M DL2000Marker ；1,2 陽性克隆，與預期結果相符；初步推斷重組質粒構建成功，且重組質粒 的大小約為15. 6Kb。測序結果表明該轉化菌的質粒中確實含有目的片段，且讀碼框正確，重 組質粒構建成功。3. 4構建ZjPIP2基因植物表達載體小結通過PCR技術克隆得到目的基因ZjPIP2的cDNA片段，經限制性內切酶BamH I 和Sma I修飾并純化后連接到植物表達載體PBI121中；用熱激法將連接產物轉入E. coli DH5a感受態細胞中；用含有卡那霉素的LB平板篩選轉化子，最后經PCR鑒定、酶切鑒定及 測序證明植物表達載體pBI121-ZjPIP2構建成功，如圖4所示，為載體的構建圖譜，為探討 ZJPIP2基因在植物體內的功能奠定了基礎。三、農桿菌介導ZjPIP2基因轉化擬南芥1、材料、試劑及儀器
1.1植物材料野生型擬南芥種子來源于山西省農業科學院生物技術研究中心園藝作物研究室， 培養基質購自山西省農科院園藝作物研究所。1.2載體和菌株根癌農桿菌LBA4404、植物表達載體PBI121均由山西省農業科學院生物技術研究 中心園藝作物研究室保存。1-3 試劑卡那霉素購自上海生工生物工程服務有限公司；YEB、1/2MS培養基中所用試劑均 購自天津天大化工。1.4培養基及試劑配方1.4. IYEB 培養基蛋白胨0. 05g/L，酵母膏 0. 01g/L，蔗糖 0. 05g/L，硫酸鎂 0. 005g/L。注固體培養基需加終濃度為1. 0%的瓊脂粉。1.4. 21/2MS 培養基按配制MS培養基配制1/2MS培養基，大量元素、微量元素、有機元素、鐵鹽的量各 減半，蔗糖30g/L，瓊脂粉6g/L。其他試劑配方與ZjPIP2基因植物表達載體的構建中所用到的試劑一樣。2實驗方法2.1擬南芥的培養將擬南芥種子先在95%乙醇浸泡30 60s ；再轉入2. 65%次氯酸鈉滅菌5min，其 間上下顛倒洗，5000rpm離心2min。滅菌水洗三次。然后將種子懸浮于0. 的瓊脂粉溶膠 中。用槍頭吸上懸浮液將種子點播于1/2MS固體培養基上，封口。4°C黑暗春化2d后，將擬 南芥種子在22°C，16h/8h光周期條件下進行培養。當擬南芥長出2片真葉時，移栽到營養
基質中繼續培養。2. 2根癌農桿菌LBA4404感受態細胞的制作，為本領域公知技術。2. 3工程菌pBI121-ZjPIP2_L的構建及篩選通過凍融法將構建成功的重組質粒載體轉入農桿菌LBA4404，然后提取陽性克隆 的質粒DNA，并通過PCR鑒定重組質粒載體是否轉入農桿菌。
從28°C培養的轉化有重組質粒pBI121_ZjPIP2的篩選平板上隨機挑選生長良好 的若干單菌落，各取二分之一菌落至50 μ 1超純水中，沸水浴5min使菌裂解，取1 μ 1作為 模板進行PCR鑒定，將鑒定出的陽性工程菌重新劃線保存一份，備用。2. 4農桿菌介導轉化擬南芥2. 4. 1 工程菌 pBI121-ZjPIP2_L 的培養挑選鑒定的陽性克隆于IOmLYEB液體培養基(含終濃度為50 μ g/mL的卡納抗生 素)過夜培養后。6000rpm離心5min收集菌體，用培養基懸浮菌體至OD6tltl值為0. 8左右， 用于轉化擬南芥植株。2. 4. 2農桿菌侵染擬南芥 當擬南芥植株形成花蕾時，即可用于農桿菌轉化。將含農桿菌的轉化介質倒入燒 杯，將擬南芥植株的花蕾部分浸入轉化介質3 5S后，把浸染過的植株放到塑料盤中，用薄 膜覆蓋，暗處放置過夜。然后揭開薄膜，在正常條件下，繼續培養轉化后的擬南芥植株。當 擬南芥的角果枯黃、欲開裂時，收獲種子。2. 4. 3轉基因擬南芥的篩選將消毒的轉基因擬南芥植株的TO代種子播種于1/2MS篩選培養基(含終濃度為 50 μ g/mL的卡那抗生素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，16h/8h光周期下培養。轉化成功的 擬南芥種子長出來的幼苗生長正常，未轉化成功的幼苗葉子發黃，生長緩慢。生長正常的擬 南芥長出2片真葉時，移栽到營養基質中繼續培養。3ZJPIP2基因轉化擬南芥的結果與分析3.1農桿菌的轉化結果將構建好的植物表達載體pBI121-ZjPIP2轉人農桿菌LBA4404，在YEB固體培養基 (含終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素上篩選轉化子，從篩選平板上隨機挑選生長良好的若干 單菌落，進行PCR檢測，PCR擴增結果如圖5所示，圖中M:DL2000Marker :1、4、5、12、13 陽 性克隆，產生一條大小約為850bp的特異條帶，表明這些菌落為陽性轉化子，重組植物表達 載體已經成功轉入農桿菌LBA4404。3. 2轉基因擬南芥植株的獲得按上述方法侵染擬南芥后，將消毒的轉基因擬南芥的Ttl代種子播種于1/2MS篩選 培養基(含終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，16h/8h光周期下 培養。經觀察，抗卡那霉素的擬南芥幼苗生長正常，且有真葉形成，而不抗卡那霉素的擬南 芥幼苗比較小，葉子發黃，也沒有真葉形成。對轉基因擬南芥植物及其Tl代進行耐鹽性評價及耐旱性性評價，選取對照、干旱 處理、NaCl處理的轉基因擬南芥植物及其Tl代。每天下午給對照澆充足的水，NaCl處理的 苗各澆0. IM NaCl溶液500ml，干旱處理的苗不澆任何液體。連續處理3天后，觀察其生長 表現，結果表明，經過兩種脅迫處理的轉基因擬南芥及其Tl代均能夠在正常生長條件下恢 復，而對照則死亡。3. 3轉ZjPIP2基因擬南芥小結通過凍融法將構建好的植物表達載體pBI121_ZjPIP2轉入農桿菌LBA4404感受態 細胞中，經含卡納霉素的YEB平板篩選、PCR鑒定成功構建工程菌pBI121-ZjPIP2-L;工程 菌介導ZjPIP2基因侵染擬南芥，經含有卡納霉素的1/2MS培養基篩選獲得含有目的基因ZJPIP2的轉基因擬南芥植株，并對轉基因擬南芥植物進行耐鹽性評價及耐旱性性評價，為 研究ZjPIP2基因在植物體內的表達定位、功能及調控機制奠定了基礎。
四、ZjPIP2在棗樹體內的表達1材料、試劑及儀器1.1植物材料壺瓶棗(Ziziphus jujuba Mill hupingzao)樹苗由山西省農業科學院生物技術 研究中心園藝作物研究室提供。1.2試劑及儀器設備NaCl購自天津天大化工；飽和酚、DEPC及RNA提取過程中所用到的試劑均購自上 海生工生物工程有限公司。1.3試劑配方與ZjPIP2基因植物表達載體的構建中所用到的試劑一樣。2實驗方法2. 1材料的準備及采集將壺瓶棗樹苗移栽到直徑為50厘米的大花盆中。放置戶外正常培養，對照、干旱 處理、NaCl處理的棗苗各三盆。每天下午給對照棗苗澆充足的水，NaCl處理的棗苗各交 0. IM NaCl溶液500ml，干旱處理的棗苗不澆任何液體。連續處理3天后，經過脅迫處理的 早樹苗開始出現卷葉癥狀。兩周后，兩種脅迫處理的棗苗卷葉、枯黃現象嚴重，然后進行取 樣。取每盆植株的根、莖、葉、結果枝莖段到50mL離心管中，液氮速凍后保存于-80°C冰箱， 用于RNA的提取。2. 2植物RNA的抽提和質量檢測2. 2. 1植物材料RNA的提取CTAB法提取植物材料的總RNA。2. 2. 2RNA 質量檢測采用甲醛變性膠電泳法來檢驗RNA是否降解，同時用分光光度計檢測其純度和濃度。(1)測所抽提RNA的0D260值取1μ 1 RNA 力卩到 99 μ 1 RNA-free water 中，用分光光度計(印pendorf BioPhotometer)檢測RNA質量，如果0D26(1/0D28(1 = 2.0那么RNA的質量非常好，純度高，無 降解，可以用于反轉錄。(2)甲醛變性膠電泳RNA甲醛變性電泳液1XM0PS 500 600ml 用 DEPC 處理過的水稀釋 20XM0PS 20 倍。瓊脂糖變性膠配制方法如下水(經DEPC 處理)44mL甲醛3. OmL20 X MOPS3. OmL瓊脂糖0.6g加熱溶解后再加水至總體積為60ml，使溶液冷卻。
注制膠時先將水、MOPS、瓊脂糖融化，室溫放置至冷卻到60°C，再加入甲醛，混勻 并置通風櫥中15分鐘后倒入制膠器中。RNA變性Buffer配制方法如下 RNA樣品分別加3倍體積的RNA變性Buffer，混勻后在65°C水浴中溫浴lOmin，置 于冰水混合物上使之冷卻；點樣，電泳，EB染色40min，S. D. W洗三次，每次15min，紫外檢測 照相，能看到較分明的兩條帶，且前后兩條帶亮度比接近2 1，則RNA可用。2. 3RNA 的反轉錄及 RT-PCR2. 3. 1 反轉錄 RNA按試劑盒PrimeScrip RT reagent Kit說明將2. 6. 2. 2所提的RNA進行反轉錄， 反轉錄體系如下5XPrime Script Buffer8μ 1Prime Script Enzyme MixI 1 μ 1Oligo dT Primer1 μ 1Random 6mers1 μ 1Total RNA2 μ gS. D. Wup to 40 μ 1反轉錄的反應程序為37°C 15min (反轉錄反應)，85°C 5sec (反轉錄酶的失活反 應)。2. 3. 2內參基因ZjH3引物的設計與合成孫海峰等[66]研究表明棗樹ZjH3基因可作為內參基因對ZjPIP2基因進行mRNA表 達水平的檢測。由序列號EU916201獲得ZjH3基因序列，根據所得序列設計內參基因ZjH3 的特異性引物，并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用于ZjH3基因的克隆分 析。內參基因Z jH3的上游弓丨物序列為Z1 5，-ATGGATCCATGGCACGGACAAAGCA-3，，包含 BamHI限制性酶切位點(即有下劃線部分)，兩個保護堿基AT，及組蛋白基因的起始密碼子 ATG。下游引物序列為Z2 :5，-TATACCCGGGCTAAGCCCTCTCGCC-3’,包含 Sam I 限制性酶切 位點(即有下劃線部分)，四個保護堿基TATA，及組蛋白基因的終止密碼子CTA。2. 3. 3RT-PCR 分析以反轉錄產物為模板，WP3、WP6 ；Zl, Z2為引物，PCR鑒定棗樹水通道蛋白的表 達位置及各種脅迫處理后的表達情況。反應體系為10XPCR buffer 1.5μ1(含Mg離 子)，dNTPO. 2 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/L)，rTaq 聚合酶 0. 1 μ 1，模板 cDNA 1 μ 1(2. 3 μ g/μ 1)，滅菌超純水加11. 2μ 1至總體積為15 μ 1。擴增條件同2. 2. 3. 2，WP3 >WP6的退火溫度為54°c，Z1, Z2的退火溫度為56°C。3干旱、NaCI脅迫下ZjPIP2的表達分析結果
3. IRNA的質量檢測結果3. 1. 1 測定所提 RNA 的 0D260 值將所提RNA按1 99與S. D. W配好后，分光光度計測得的RNA濃度見表1 表1棗苗處理后分子數據材料總RNA 濃260/280 260/230 反轉錄反轉錄產度用量 物濃度(ug/ml)(ul) (ug/ml)對照根 1170.1 1.85 2.6311116.5蓮 316.9 1.83 2.4841343.8葉 1637.3 1.82 2.6911484.5結 1082.5 1. 79 2. 6611169.3干旱脅迫根31.9 1.99 1.7720 1595.8蓮 2393.3 2.06 2.4911796.1葉 1977.6 2.04 2.5311621.5結 2840.4 2.04 2. 5511516.8NaCl 脅迫根 172.2 1.95 2.1620 1078.2蓮 30. 3 3. 79 1. 6820 1433. 4葉 11894 1.99 2. 260.5 1459.7結 3863.6 2.00 2. 5211427. 73. 1.2甲醛變性膠電泳將所提RNA樣品處理后，進行甲醛變性膠電泳，凝膠成像分析儀下觀察所提RNA質 量，如果看到較分明的兩條帶，且前后兩條帶亮度比接近2 1，表明所提RNA純度高、無降 解、可用于反轉錄。3. 2ZJPIP2在不同脅迫下的RT-PCR分析結果按上述方法反轉錄所提RNA，反轉錄產物濃度見表1 ；然后再分別以ZpZ2JP3JPe 為引物對反轉錄產物進行RT-PCR分析，瓊脂糖凝膠電泳RT-PCR產物，結果如圖6 (a)、圖 6(b)所示，如圖7所示圖6(a)中，M :DL2000Marker ；1 質粒對照；.2-5 干旱處理植株的根、莖、葉、結果 枝莖段；圖6(b)中，2-5 對照植株的根、莖、葉、結果枝莖段；6-9 =NaCl處理植株的根、莖、 葉、結果枝莖段，表明ZjH3基因在對照和處理所有植株的不同組織均有表達，進一步表明 所提RNA可用。圖7中，M :DL2000Marker ；1 質粒對照；2_5 對照植株的根、莖、葉、結果枝 莖段6-9 干旱處理植株的根、莖、葉、結果枝莖段；10-13 =NaCl處理植株的根、莖、葉、結果 枝莖段.顯示棗水通道蛋白在對照植株的莖和葉片中有表達，葉片中的表達量相對少一點 兒；在干旱處理過的植株的莖、葉、結果枝莖段中均有表達，結果枝莖段經干旱脅迫表達了 目的基因，葉中的表達量現相對對照有所增加；在NaCl處理過的植株中，莖、葉、結果枝莖 段均有表達，而且莖、葉中的表達量比對照增加顯著。實驗結果表明ZjPIP2蛋白在莖、葉中 的表達比較穩定，證實逆境因素可誘導目的基因在結果枝中的表達。
3. 3ZJPIP2表達研究小結分別對盆栽壺瓶棗樹苗進行干旱、NaCl脅迫處理，并以未作任何處理的正常壺瓶棗樹苗為對照，研究逆境因素對ZjPIP2基因表達的影響，當處理過的樹苗出現嚴重卷葉、 枯黃現象時，立即采樣并速凍保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的對照及脅迫處 理過的植物材料的總RNA，經OD26tl值的測定、甲醛變性膠電泳等方法檢測證明所提RNA純度 高、無降解，質量合格。反轉錄所提RNA，RT-PCR分析得ZjPIP2基因在植物莖、葉中的表達 比較穩定，并推測ZjPIP2可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導表達。
權利要求
一種棗樹水通道蛋白基因，其特征是該基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO1所示的序列。
2.由權利要求1所述一種棗樹水通道蛋白基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其特 征是該氨基酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列。
3.一種棗樹水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程技術領域，具體為一種棗樹水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應用，該基因的核苷酸序列以及氨基酸序列如序列表中所示SEQ ID NO1和SEQID NO2，本發明構建植物表達載體，獲得轉基因擬南芥植株，對其進行耐鹽性評價及耐旱性性評價，證明其可用在提高植物耐旱性和耐鹽性中。本發明首次發現并從棗樹中克隆出棗樹水通道蛋白基因ZjPIP2，該基因可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽性和耐旱性，以進行植物品種改良，明確了具有優良抗性的棗樹的抗逆機制，逆境相關基因的分子結構、表達、功能及調控，為進一步充分利用這些優良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的實驗數據，奠定了一定的理論基礎。
文檔編號C12N15/29GK101880674SQ201010239449
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者孟玉平, 張潔, 曹秋芬, 顧蓉 申請人:山西省農業生物技術研究中心