一種黑胸大蠊濃核病毒定性定量的檢測方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種黑胸大蠊濃核病毒定性定量檢測方法及應用。該方法包括病毒粒子純化、病毒粒子沉淀特征鑒定、病毒粒子形態測定、病毒核酸提取、核酸分子量電泳測定、電鏡計數（包括樣品處理、計數）。本發明檢測準確度高，檢測時間短，具有良好的特異性和穩定性，適用于該病毒的定性和定量的檢測。
【專利說明】一種黑胸大蠊濃核病毒定性定量的檢測方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及昆蟲病毒生物農藥檢測【技術領域】，更具體涉及一種檢測黑胸大蠊濃核病毒的定性定量檢測方法及應用，該方法不僅可使用目前存在市場上的所有類型電子顯微鏡儀器，更重要的是能準確地對黑胸大蠊濃核病毒進行定性、定量檢測。
【背景技術】
[0002]蟑螂學名蜚蠊，屬于昆蟲綱(Insecta)、直翅目(Blattaria)、蜚蠊科(Blattidae)0蟑螂是一種非常古老的昆蟲，早在3億年前就已出現，素有活化石之稱。同時蟑螂又是危害人類健康的重要衛生害蟲之一，其危害不亞于蚊蟲、蒼蠅及老鼠的一類重要衛生害蟲，已知蟑螂體內外能攜帶霍亂弧菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等多種細菌和鉤蟲、蛔蟲、鞭蟲等十種寄生蟲卵，可在體內貯存多天，并不斷排出體外，污染周圍環境。多年來防治蟑螂的主要方法是使用化學農藥，造成了蟑螂抗藥性增強，且一年多次用藥，造成環境污染，現在人民生活水平逐步提高，在家庭滅蟑上都希望采用生物農藥，而應用微生物防治蟑螂已有很多報道，其中從自然罹病蟑螂體內分離到的黑胸大蠊濃核病毒對蟑螂有非常好的感染性，死亡率高達99%。
[0003]黑胸大爐濃核病毒(Periplanetafuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)是武漢大學胡遠揚教授等人在國內首先發現并報道，是在國內外第I個正式分類鑒定的蟑螂濃核病毒。該病毒與其他細小病毒一樣，病毒粒子無包膜，呈球狀二十面體對稱，直徑22nm基因組為單鏈線狀DNA分子(ssDNA)，沉降系數為102s，浮力密度為1.42g/ml，可以通過差速離心和密度梯度離心的方法將其分離提純。病毒粒子的SDS-PAGE顯示由5個蛋白組成，分子量分別為52KD，56KD，79KD，82KD，105KD。PfDNV基因組全長為5454bp (PfDNV基因組序列已提交Genbank，編號為:AFI92260)。基因組正鏈有4個大的閱讀框(0RF)，負鏈含有3個大的閱讀框，分別編碼非結構蛋白和結構蛋白。ICTV第九次會議正式將其獨立列為一個屬=Pefudens0Virus。黑胸大蠊濃核病毒可引起蟑螂食欲減退，行動遲緩，后體翻仰臥不能自正，直至不動而死去。死后蟲尸外觀體形體色不變，體軟腐，壓之流出乳白色膿液，無臭味；此病毒最顯著的病癥是嗉囊特別膨脹，呈白色魚泡狀的氣囊，氣囊一般伸達第2-4腹節，有的甚至占住整個血腔，將中、后腸擠壓至尾端一側，囊內空而無物，破之氣消癟縮；其次是中腸稍腫脹，黑褐色，破之，流出黑褐色液體；后腸黑色，滯留有未排出的糞便。目前應用黑胸大蠊濃核病毒制成的殺蟑產品有拜樂生物殺蟑餌劑、方便貼、拜樂生物殺蟑餌盒等產品。而產品的不斷推出，需要有更快更簡單的方法對其有效成分黑胸大蠊濃核病毒進行定性定量檢測，才能保證產品的質量。一直以來，電鏡計數都是病毒定量的傳統方法。
[0004] 申請人:建立的黑胸大蠊濃核病毒定性定量檢測方法，旨在對黑胸大蠊濃核病毒進行定性和定量檢測，為生產及市場提供簡單、準確、方便的檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是在于提供了一種黑胸大蠊濃核病毒定性定量檢測方法，該方法具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高，不僅可使用目前存在市場上的所有類型電子顯微鏡、電泳儀、離心機等儀器，更重要的是能準確、快速地對黑胸大蠊濃核病毒進行定性定量檢測，可為生產提供可靠的保證產品質量的方法。
[0006]本發明的另一個目的是在于提供了一種黑胸大蠊濃核病毒定性定量檢測方法在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測中的應用，此方法定性準確、穩定，定量重復性好。
[0007]為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施:
[0008]1.病毒粒子純化
[0009]病毒的純化通過沉淀法、差異離心法和密度梯度離心法結合進行。具體為:將樣品懸浮于磷酸緩沖溶液(PBS),勻衆后以5000r/min離心3min。上清液加入硫酸銨至350g/L，硫酸銨水溶液飽和度為55%，放置于4°C冰箱內靜置12-14小時，然后以8000r/min離心50min,沉淀加入PBS重懸浮,勻衆后，以15000r/min離心20min,上清液以40000r/min離心2h，取沉淀。勻漿離心后，上清液經40%蔗糖單梯度，以40000r/min離心5h，沉淀懸于PBS中，勻漿，以12000r/min離心20min，得上清，再經過10%?40%蔗糖線性梯度，以26000r/min 離心 2.5h。
[0010]經10%?40%蔗糖梯度離心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管。用紫外分光光度計測定每管在260nm處的吸收值，繪制吸收曲線。
[0011]將峰值管的收集液洗糖，以40000r/min離心2h，PBS懸浮，即為提純病毒。
[0012]2.病毒粒子的沉降特征
[0013]以家香濃核病毒伊那株(Bombyxmori Densonucleosis Virus, BmDNV Inaisolate)和家香傳染性軟化病毒(Bombyx mori Infectious flacherie Virus BmIFV)作為對照，將純化的黑胸大蠊濃核病毒樣品稀釋10倍上樣，鋪在10%?40%蔗糖線性梯度上層，121700g離心3.5hr,以形成沉降區帶。部分收集器收集，每管0.75mL，收集50管，分別測定260nm光吸收值(OD26tl),并對應收集管號繪制曲線，收集出現光吸收峰的區帶病毒。測定收集到的病毒是否符合黑胸大蠊濃核病毒的沉降特性。
[0014]本病毒沉降系數為102S,病毒粒子密度為1.45g/cm3。
[0015]3.蟑螂病毒的形態測定
[0016]純化的蟑螂病毒粒子用2%磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡下檢查，病毒為大小均一的近似球狀二十面體的粒子，加入直徑15nm的煙草花葉病毒(TMV)作為標準，測定其直徑應該是22nm。
[0017]4.蟑螂病毒核酸檢測
[0018]a)蟑螂病毒核酸提取
[0019]純化的蟑螂病毒懸液與等體積TE飽和酚混勻，室溫下置40 - 60min,期間數次搖動。酚處理后以10000r/min離心5min，取水相，重復兩次，再用等體積的氯仿:異戊醇(24:I)抽提，取水相，加1/10體積的3mol/L乙酸鈉，2.5倍體積無水冷乙醇，_20°C靜置4小時，以15000r/min離心lOmin，沉淀真空干燥后，懸浮在pH8.0TE緩沖液中，即為蟑螂病毒核酸。
[0020]b)蟑螂病毒核酸電泳檢測及其分子量
[0021]采用核酸的瓊脂糖電泳方法檢測其核酸分子量，瓊脂糖濃度為1.9% (用IXTBE配制)。
[0022]電泳時以Hind III酶切的λ DNA作標準，電泳結束后用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察照相，計算病毒核酸的大小。
[0023]5.樣品的處理
[0024]制備檢測病毒懸液，取ImL (精確至0.01mL)試樣，溶解于IOmL蒸餾水中，然后10倍梯度稀釋樣SS1 (1/10) — S2(1/10)，再用I μ L磷鎢酸與I μ L樣品重復混勻后滴在銅網上，自然干燥后直接電鏡檢測計數。以電鏡視野中的病毒顆粒不重疊為宜，每網孔中的病毒數不少于4個。
[0025]6.計算有效網孔中病毒的總和P = Ρ!+Ρ2+Ρ3+......+Ρη，重復3次取平均值。蟑螂
濃核病毒含量X用式(I)進行計算:
[0026]X = PX IOX IOsX 1000
[0027]式中:Ρ—電鏡下統計的總數；
[0028]S—梯度稀釋的次數。
[0029]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0030]該方法具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高，不僅可使用目前存在市場上的所有類型電子顯微鏡、電泳儀、離心機等儀器，更重要的是能準確、快速地對黑胸大蠊濃核病毒進行定性定量檢測，可為生產提供可靠的保證產品質量的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1為黑胸大蠊濃核病毒電鏡示意圖。
【具體實施方式】`
[0032]下面結合具體實施例對本發明進一步描述。
[0033]實施例1:
[0034]一種檢測黑胸大蠊濃核病毒定性定量檢測方法，其步驟如下:
[0035]1.病毒粒子純化
[0036]將黑胸大蠊濃核病毒樣品(武漢武大綠洲生物技術有限公司提供)懸浮于磷酸緩沖溶液(PBS)，勻漿后以5000r/min離心3min。上清液加入硫酸銨350g/L (指得是加入硫酸銨后的終濃度)，硫酸銨水溶液飽和度為55%，放置于冰箱(4°C)內靜置12-14小時后，以8000r/min離心50min,沉淀加入PBS重懸浮,勻衆后，以15000r/min離心20min,上清液以40000r/min離心2h,取沉淀。勻衆離心后,上清液經40%鹿糖單梯度，以40000r/min離心5h，沉淀懸于PBS中，勻漿，以12000r/min離心20min，得上清，再經過10%~40%蔗糖線性梯度，以 26000r/min 離心 2.5h。
[0037]經10 %~40 %蔗糖梯度離心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管。用紫外分光光度計測定每管在260nm處的吸收值，繪制吸收曲線，在26-30管處出現光吸收峰。
[0038]將峰值管的收集液洗糖，以40000r/min離心2h，PBS懸浮，即為提純病毒。
[0039]2.病毒粒子的沉降特征
[0040]以家香濃核病毒伊那株(Bombyxmori Densonucleosis Virus, BmDNV Inaisolate)(約6kb,沉降系數是100)和家蠶傳染性軟化病病毒(Bombyx mori Infectiousflacherie Virus BmIFV)(核酸9650bp，沉降系數是183)作為對照，將步驟I中得到的提純病毒稀釋十倍，進行上樣，鋪在10%~40%蔗糖線性梯度上層，121700g離心3.5hr，以形成沉降區帶。部分收集器收集，每管0. 75mL，收集50管，分別測定260nm光吸收值（0D26Q)， 并對應收集管號繪制曲線，在本實施例中，在26?33管處出現光吸收峰。本病毒沉降系數 為102S，病毒粒子密度為1. 45g/cm3。
[0041]3.蟑螂病毒的形態測定
[0042]純化的蟑螂病毒粒子用2%磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡下檢查，病毒為大小均一 的近似球狀十二面體的粒子，加入直徑15nm的煙草花葉病毒（TMV)作為標準，測定其直徑 應該是22nm。
[0043]4.蟑螂病毒核酸檢測
[0044]a)蟑螂病毒核酸提取
[0045]純化的蟑螂病毒懸液與等體積TE飽和酚混勻，室溫（23±2°C )下置40 — 60min, 期間搖動10-15次。酚處理后以10000r/min離心5min，取水相，重復兩次，再用等體積的 氯仿：異戊醇（24 ：1)抽提，取水相，加1/10體積的3mol/L乙酸鈉，2. 5倍體積無水冷乙 醇，-20°C靜置4小時，以15000r/min離心lOmin，沉淀真空干燥后，懸浮在pH8. 0TE緩沖液
中，即為蟑螂病毒核酸。
[0046]b)蟑螂病毒核酸電泳檢測及其分子量
[0047]采用核酸的瓊脂糖電泳方法檢測其核酸分子量，瓊脂糖濃度為1. 9% (用1XTBE 配制)。
[0048]電泳時以Hind III酶切的入DNA作標準，電泳結束后用溴化乙錠染色，在紫外燈下 觀察照相，計算病毒核酸的大小。該病毒的核酸大小5454bp。
[0049]5.樣品的處理
[0050]制備檢測病毒懸液，取lmL (精確至0. OlmL)試樣,溶解于10mL蒸懼水中，然后10 倍梯度稀釋樣品Si (1/10) —S2 (1/10)，再用luL磷鎢酸與lyL樣品重復混勻后滴在銅網 上，自然干燥后直接電鏡檢測計數。以電鏡視野中的病毒顆粒不重疊為宜，每網孔中的病毒 數不少于4個。
[0051]6.計算有效網孔中病毒的總和P = P!+P2+P3+......+Pn，重復3次取平均值。蟑螂
濃核病毒含量x用式（1)進行計算：
[0052]x = PX10X10SX1000
[0053]式中：P—電鏡下統計的總數；
[0054]S—梯度稀釋的次數。
[0055]經過上述步驟測定后，黑胸大蠊濃核病毒原藥含量為1. 05X 108個/ml，
[0056]實施例2 ：
[0057]—種黑胸大蠊濃核病毒定性定量檢測方法在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測中的應用，其 應用過程如下：
[0058]生物殺蟑餌劑的來源(武漢武大綠洲生物技術有限公司提供)，≥6000個/g。
[0059]步驟同實施例1
[0060]生物殺蟑餌劑內含量為7. lX104f/g。
[0061]以上僅為本發明所列舉的較佳實施例，并非用以限制本發明的保護范圍，所屬技 術領域中的普通技術人員運用本發明所作的等效修飾或變化，均同理應屬于本發明的專利 保護范圍。
【權利要求】
1.一種黑胸大蠊濃核病毒定性定量的檢測方法，其步驟如下: 1)病毒粒子純化 將樣品懸浮于磷酸緩沖溶液，勻衆后以5000r/min離心3min ;上清液加入硫酸銨至350g/L，硫酸銨水溶液飽和度為55%，放置于4°C冰箱內靜置12-14小時，然后以8000r/min離心50min,沉淀加入PBS重懸浮，勻衆后，以15000r/min離心20min,上清液以40000r/min離心2h，取沉淀；勻漿離心后，上清液經40%蔗糖單梯度，以40000r/min離心5h，沉淀懸于PBS中，勻漿，以12000r/min離心20min，得上清，再經過10%~40%蔗糖線性梯度，以26000r/min 離心 2.5h ； 經10%~40%蔗糖梯度離心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管，用紫外分光光度計測定每管在260nm處的吸收值，繪制吸收曲線； 將峰值管的收集液洗糖，以40000r/min離心2h，PBS懸浮，即為提純病毒； 2)病毒粒子的沉降特征 以家蠶濃核病毒伊那株和家蠶傳染性軟化病毒作為對照，將純化的黑胸大蠊濃核病毒樣品稀釋10倍上樣，鋪在10%~40%蔗糖線性梯度上層，121700g離心3.5hr，以形成沉降區帶；部分收集器收集，每管0.75mL,收集50管，分別測定260nm光吸收值，并對應收集管號繪制曲線，收集出現光吸收峰的區帶病毒，測定病毒的沉降特性； 黑胸大蠊濃核病毒沉降系數為102S，病毒粒子密度為1.45g/cm3 ； 3)蟑螂病毒的形態測定 純化的蟑螂病毒粒子用2%磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡下檢查，病毒為大小均一的近似球狀二十面體的粒子，加入直徑15nm的煙草花葉病毒作為標準，測定其直徑； 4)蟑螂病毒核酸檢測 a)蟑螂病毒核酸提取 純化的蟑螂病毒懸液與等體積TE飽和酚混勻，室溫下置40 - 60min,期間數次搖動；酹處理后以10000r/min離心5min,取水相,重復兩次,再用等體積的氯仿:異戍醇=24:1抽提，取水相，加1/10體積的3mol/L乙酸鈉，2.5倍體積無水冷乙醇，_20°C靜置4小時，以15000 r/min離心lOmin，沉淀真空干燥后，懸浮在pH8.0TE緩沖液中，即為蟑螂病毒核酸； b)蟑螂病毒核酸電泳檢測及其分子量 采用核酸的瓊脂糖電泳方法檢測其核酸分子量，用IXTBE配制的瓊脂糖濃度為1.9% ； 電泳時以Hind III酶切的λ DNA作標準，電泳結束后用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察照相，計算病毒核酸的大小； 5)樣品的處理 制備檢測病毒懸液，取ImL,精確至0.01 mL試樣，溶解于IOmL蒸懼水中，然后10倍梯度稀釋樣品S1 (1/10) — S2 (1/10)，再用I μ L磷鎢酸與I μ L樣品重復混勻后滴在銅網上，自然干燥后直接電鏡檢測計數，要求電鏡視野中的病毒顆粒不重疊，每網孔中的病毒數不少于4個； 6)計算有效網孔中病毒的總和P= Ρ!+Ρ2+Ρ3+......+Ρη，重復3次取平均值，蟑螂濃核病毒含量X用式(I)進行計算:
X = PX 10Χ IOsX 1000式中:P—電鏡下統計的總數；S—梯度稀釋的次數。
2.權利要求1所述的方法在·蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測中的應用。
【文檔編號】G01N15/04GK103592209SQ201310627439
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】陳嬌, 尹宜農 申請人:武漢武大綠洲生物技術有限公司