一種檢測人外周血中t淋巴細胞活化期標記物的方法
【專利摘要】本發明屬醫學檢測【技術領域】，涉及一種定量流式細胞術同時測定人外周血中T淋巴細胞活化標記物CD69、、CD25和CD71的方法；所述方法首先對外周血進行培養和刺激；然后將培養刺激后的外周血進行染色處理，并對染色后樣品進行紅細胞裂解和洗滌；最后將洗滌后的樣品進行定量流式檢測。同時根據QuantiBRITE?PE微球建立標準曲線，通過標準曲線計算得到每個細胞表面抗原的具體表達數量。本發明所述的方法可準確、靈敏地測定人T淋巴細胞表面CD69、CD25和CD71抗原表達量，反映被測T細胞的免疫學特征，為臨床研究提供一定的免疫學依據和檢測指標。
【專利說明】—種檢測人外周血中T淋巴細胞活化期標記物的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬醫學檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測人外周血中T淋巴細胞活化標記物的方法。尤其是應用定量流式細胞術同時檢測人外周血中T淋巴細胞活化標記物CD69、⑶25和⑶71的方法。
【背景技術】
[0002]研究顯示，免疫抑制劑的安全范圍(即治療窗)較窄，血藥濃度等藥動學參數個體間和個體內變異大，易發生感染或排異等嚴重不良反應，需要進行治療藥物監測(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)和個體化給藥。目前對免疫抑制劑的治療藥物監測通常是進行血藥濃度監測。但是，近年來研究發現相同的血藥濃度會產生不同的藥物效應。因此，越來越多的國內外學者提出需進行免疫藥效學監測，通過檢測免疫細胞功能來調整給藥方案，提高免疫抑制劑的安全性和有效性。
[0003]⑶69、⑶25和⑶71分別是T淋巴細胞活化早、中、晚期的標志物，對其進行監測可以直接反映人體的免疫抑制狀態，為及時調整免疫抑制劑的用藥方案提供依據。傳統流式細胞術(Flow cytometry, FCM)的分析結果通常用熒光強度、平均熒光強度(Meanfluorescence intensity, MFI)、相對突光強度(Relative fluorescence intenstityRFI)、陽性或陰性細胞百分率等方式表達。然而，上述結果未能表達出細胞或顆粒上的某種抗原或分子的絕對數量。此外，T淋巴細胞活化抗原⑶69、⑶25和⑶71的表達是一個連續變化過程，而熒光強度的定性分析無法準確反映其動態變化特點，并且各實驗室間的檢測結果亦無法直接進行比較。
[0004]基于上述原因，本申請的發明人擬提供一種快速，準確的同時測定人外周血中T淋巴細胞表面抗原⑶69、⑶25和⑶71表達量的方法。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是克服現有技術對T細胞表面抗原測定的不足，提供一種可以絕對定量人外周血中T淋巴細胞表面抗原的方法。該方法能快速、準確定量人外周血中T淋巴細胞活化標志物CD69、CD25和CD71的表達量(Antibody capacity,ABC)，為臨床個體化用藥提供準確的免疫藥效學依據。
[0006]本發明采用定量流式細胞術檢測T淋巴細胞活化標志物⑶69、⑶25和⑶71的表達量。該法是通過檢測標準微球的熒光強度及已知的熒光分子數建立標準曲線，通過標準曲線求得每個待測細胞上的平均熒光素分子數。根據每個抗體分子所結合的熒光分子數，計算每個細胞上抗體結合量(Antibody binding capacity, ABC),從而根據抗原抗體結合的原理，反映細胞表面抗原的表達量。
[0007]本發明方法中，首先對外周血進行培養和刺激；然后將培養刺激后的外周血進行染色處理，并對染色后樣品進行紅細胞裂解和洗滌；最后將洗滌后的樣品進行定量流式檢測。[0008]本發明方法中，所使用的定量流式標準微球是QuantiBRITE PE微球。該微球是一種水溶性小球，以藻紅蛋白(P-phycoerythrin, PE)分子包被(或標記),其中含4種不同突光水平。使用時，根據產品說明書中標稱的每個微球上PE分子數量及流式細胞儀測得的實際熒光強度，可建立標準曲線。
[0009]具體而言，本發明的檢測人外周血中T淋巴細胞活化標記物的方法，其特征在于，其包括步驟:
[0010](I)采集樣本
[0011 ] 采集人外周靜脈血2-3ml，K2EDTA抗凝；
[0012](2)熒光標記
[0013]①取100 μ I抗凝全血，加入適量RPMI1640細胞培養基和ConA刺激劑，使ConA刺激劑的終濃度為10-12ng/ml ;37± 1°C，5%C02培養箱中培養24_48h ；
[0014]②取培養后樣品離心，棄上清培養基；
[0015]③加入antihuman-CD3-PerCP-5.5、antihuman_CD69PE、an t i human -CD 2 5PE 和antihuman-⑶7IPE抗體各2 μ I，避光孵育30_45min，然后加入3_5ml紅細胞裂解液，避光靜置 10-15min ；
[0016]④離心后棄上清，再加入2_3ml PBS洗滌2-3次，棄上清液；
[0017]⑤加入100-200 μ I PBS重懸細胞，待測；
[0018](3)檢測分析
[0019]①配制標準微球溶液:在含QuantiBRITE PE微球的測定管中加入Iml PBS,混勻；
[0020]②標準曲線建立:用前向角設閾值，前向角/側向角設門(如圖1所示)，建立熒光通道2(FL2)直方圖，獲得4種已知含不同PE分子數微球的平均熒光強度(如圖2所示);再根據4種標準微球的標定PE分子數(X)和實際測定的平均熒光強度(Y)，建立定量分析的標準曲線logY=AlogX+B (如圖3所示);③樣本測定:流式細胞儀測定樣品細胞的熒光強度；將熒光強度代入標準曲線，計算得到CD69、CD25和CD71抗體結合的PE分子數，再根據有效熒光素/蛋白(Fluorochrome/Protein，F/P)比值，換算得到每個T淋巴細胞上CD69、CD25和⑶71表達量。
[0021]④本發明方法可準確測定人外周血中T淋巴細胞表面⑶69、⑶25和⑶71抗原表達量，反映人體的免疫學特征，為臨床個體化用藥提供更依據。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1顯示了流式細胞儀檢測QuantiBRITE PE微球:前向角/側向角(FSC/SSC)設門。
[0023]圖2顯示了流式細胞儀檢測QuantiBRITE PE微球:4種不同PE分子數微球的平均熒光強度(MFI)。
[0024]圖3顯示了熒光分子定量分析的標準曲線。
【具體實施方式】
[0025]以下實施例用于說明本發明，但不使用限制本人發明的范圍，若未特別指明，實施例中所用技術手段為本【技術領域】技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。[0026]以下實施例中所用流式細胞儀為美國BD公司生產，型號FACS Aria I。
[0027]實施例1健康人中⑶69、⑶25及⑶71的表達量
[0028]①采集樣本:選取5例健康志愿者，抽取外周靜脈血3ml，置于K2EDTA抗凝管中；
[0029]②取100 μ l抗凝血，加入2ml RPMI1640細胞培養基及20 μ l ConA刺激劑，37°C，5%C02培養箱中培養24h ；
[0030]③加入antihuman-CD3-PerCP-5.5、antihuman_CD69PE、antihuman_CD25PE 和antihuman-⑶71PE各2μ l，避光孵育30min，然后加入3ml紅細胞裂解液，避光靜置IOmin
[0031]④477g離心IOmin,棄上清；
[0032]⑤加入2ml PBS洗漆,477g離心IOmin,棄上清,該過程重復2次；
[0033]⑥加入100 μ lPBS重懸細胞，待測；
[0034]⑦配制標準微球溶液:在含QuantiBRITE PE微球的測定管中加入Iml PBS,混勻；
[0035]⑧標準曲線建立:用前向角設閾值，前向角/側向角設門，建立熒光通道2直方圖，獲得4種已知含不同PE分子數微球的平均熒光強度；再根據4種標準微球的標定PE分子數⑴和實際測定的平均熒光強度(Y)，建立定量分析的標準曲線log (y) =1.0231og (x) -0.124 ；
[0036]⑨樣本測定:流式細胞儀測定樣品細胞的的熒光強度；將熒光強度代入標準曲線，計算得到CD69、CD25和CD71抗體結合的PE分子數，再根據PE分子數/抗體比值為1:1，得到5名健康志愿者⑶69、⑶25、和⑶71的抗原表達量(如表1所示)。
[0037]表1 5名健康志愿者外周血T細胞CD69、⑶25及⑶71的表達量
[0038]
【權利要求】
1.一種檢測人外周血中T淋巴細胞活化標記物的方法，其特征在于，其包括:首先對外周血進行培養和刺激；然后將培養刺激后的外周血進行染色處理，并對染色后樣品進行紅細胞裂解和洗滌；最后將洗滌后的樣品進行定量流式檢測；同時測定QuantiBRITE PE熒光得到標準曲線，根據標準曲線換算所測樣品中T淋巴細胞表面CD69、CD71及CD25的表達量。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人外周血中T淋巴細胞活化標記物為CD69、CD25 和 CD71。
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，其包括步驟: (1)采集檢測樣本； 采集靜脈外周血2-3ml，EDTA抗凝，室溫放置； (2)熒光染色； ①取抗凝全血，加入適量RPMI1640培養基及ConA刺激劑，使ConA刺激劑的終濃度為10-12ng/ml,37°C，5%C02 培養 24_48h ； ②取培養后樣品離心，吸棄上清培養基； ③加入antihuman-CD3-PerCP-5.5、antihuman_CD69PE、antihuman_CD25PE 和antihuman-⑶7IPE抗體，避光孵育，加入紅細胞裂解液，室溫下避光靜置10_15min ； ④離心棄上清,加入PBS洗滌，離心棄上清，該過程重復2-3次； 加入100 μ I PBS重懸細胞，上機檢測； (3)樣本檢測； ①配制標準微球溶液=QuantiBRITEPE微球測定管中加入Iml PBS，充分混勻后待測。 ②流式細胞儀檢測QuantiBRITEPE標準微球熒光強度:用前向角設閾值，前向角/側向角設門，建立熒光通道2 (FL2)直方圖； ③根據4種標準微球的標定PE分子數(X)和實際測定的平均熒光強度(Y)，建立定量分析的標準曲線:logY=AlogX+B ； ④流式細胞儀測定樣品T細胞的CD69、CD25和CD71的熒光強度；將熒光強度代入標準曲線，計算得到⑶69、⑶25和⑶71結合的PE分子數。 ⑤根據有效熒光素/蛋白(F/P)比值，換算得到每個T淋巴細胞上CD69、CD25和CD71表達量。
【文檔編號】G01N21/64GK103604919SQ201310542753
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】焦正, 范琳琳, 邱曉燕, 鐘明康, 張明 申請人:復旦大學附屬華山醫院