專利名稱：一種檢測外周血克隆特異性t淋巴細胞的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及分子免疫學和分子生物學，特別是一種檢測方法， 具體為一種檢測外周血克隆特異性T淋巴細胞的方法。
背景技術：
T細胞受體(T cell receptor, TCR)是T淋巴細胞表面識別和結合抗原、參與特異性細胞免 疫的重要分子。正常人外周血95%的T淋巴細胞的TCR由oc、 (3兩條多肽鏈通過二硫鍵構成 的異源性二聚體。oc鏈由胚系基因中AV、 AJ、 AC重排形成，AV末端和AJ前端及中間插入 的核苷酸序列組成了 TCR oc鏈可變區互補決定區3(CDR3)， P鏈由胚系基因中的BV、 BD、 BJ、 BC基因片段經重排而形成，其中由BV(p鏈可變區)基因片段末端、BD基因片段、BJ基 因片段前端及V-D與D-J之間插入的核苷酸序列組成了 TCR |3鏈CDR3。不同T細胞克隆具 有不同長度或不同序列的TCR BV CDR3基因組成，形成CDR3基因譜型的多樣性，CDR3 區的長度和序列決定其結構，從而決定TCR的特異性。一種CDR3序列代表一個T細胞克隆， 和同一MHC肽復合物結合的大部分克隆T細胞，有著相同的BV片段和CDR3長度，測定 特定BV CDR3序列出現的頻率可以反映特定T細胞克隆擴增的程度，能很好地反映不同疾 病狀態下T淋巴細胞的功能狀態。分析病毒(如HBV)感染后相關的TCRCDR3基因家族特異 性克隆擴增情況和TCR BV CDR3基因組成，可考慮采用特異性TCR CDR3單克隆抗體活化感染 患者自體T細胞，獲得臨床治療數量的特異性CTL細胞從而用于感染性疾病(如HBV引起的 肝炎)的潛在治療；也可以分離特異性TCR基因轉染到自體或同種異體外周血淋巴細胞來治 療病毒感染后的相應疾病。
分析TCR CDR3的方法有Southern blot、單鏈構象多態性(SSCP)、變性梯度凝膠電泳 (DGGE)，單克隆抗體檢測等。隨后發展了流式細胞儀檢測細胞內細胞因子表達或EUSpot結 合特異性抗原刺激后檢測細胞因子的分泌，可間接反映T細胞的亞型和功能。隨著四聚體技 術(tetramer)的出現，用tetramer來檢測抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)技術得到了很大的 發展。但這些方法不能提供特異性T細胞的TCR分子特征和整個樣本中T細胞的組成信息。
近年來，免疫掃描譜型分析技術(immunoscope spectratyping)在分析CDR3的表達頻率和 長度分布上得到較為廣泛的應用。根據一定濃度變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)很高的分辨力來 區分大小只相差lbp核苷酸片段，然后經基因掃描(GeneScan)分析電泳結果。根據TCRCDR3 基因表達情況，從而推測機體T細胞克隆性擴增狀況。在國外，毛細管電泳技術已逐步在分析 TCRBV上得以應用，如國外有人利用毛細管測序儀(ABI310)檢測再生障礙性貧血(AA)特異性 TCRBV CDR3基因譜型特點。近年來，實時熒光定量PCR與熔解曲線分析技術在檢測TCRBV
家族與鑒定T細胞克隆性增生上也逐步得以應用。
目前實時熒光定量(realtime)PCR技術是公認的最敏感、最準確、重復性好的核酸分子定 量檢測方法，已廣泛應用于基礎研究及病原體的臨床檢測。實時熒光定量PCR技術的原理為 在PCR反應體系中加入熒光基團(分子)，通過熒光信號的按比例增加來反應DNA量的增加， 使PCR產物的實時檢測成為可能。相對常規PCR，熒光定量PCR的主要優點是在動態范圍內 準確地確定初始模板的拷貝數量和高的靈敏度。另外，熒光定量PCR的結果無需通過瓊脂糖 凝膠電泳來評估，可節省實驗時間，提高實驗效率，減少實驗樣品污染的幾率。
實時熒光定量PCR檢測方法主要有2種 一種是使用雜交探針，即在PCR擴增加入一對引 物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基 團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增 時，Taq酶的5' 3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，熒光 監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信 號的累積與PCR產物形成完全同步，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標 準曲線對未知模板進行定量分析。另一種是使用SYBR Green I染料，與雜交探針比較，SYBR Green I不需要設計特定的序列，其檢測原理是SYBR Green I是一種結合于雙鏈DNA小溝 的染料，最大吸收波長約為497nm，最大發射波長約為520nm。 SYBR Green I與雙鏈DNA結 合后，其熒光強度大大增強。在PCR反應體系中加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料 特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子熒光信號極弱， 從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
因SYBRGreenI與雙鏈DNA結合沒有特異性，容易產生非特異性熒光信號，我們把PCR 產物進行熔解曲線分析來區分特異性與非特異性產物，以及引物二聚體。即在PCR反應結束 后，把PCR產物從一定的開始溫度按一定的溫度變化速率(Ramp)升至95'C ，擴增產物雙鏈DNA 隨溫度升高漸變性解鏈成單鏈，嵌到雙鏈中的熒光染料SYBR green I釋放出來，反應體系中 熒光信號隨之衰減，儀器自動檢測反應管內熒光信號的變化，最后繪制出擴增產物熒光信號 隨溫度變化的熔解曲線(melting cuve)。從而來區分特異性和非特異性擴增，因此SYBR Green I用于實時定量檢測更加方便，經濟，而且在同一體系可以檢測多個基因。另外，通過熒光 信號強度變化的負一次導數(-dF/dT)與熔解溫度(Tm)間作圖，得到PCR產物的熔解曲線峰形 圖，我們稱之為基因熔解譜型圖(Gene melting sepctratyping，GMST)(因該圖類似于以基因片段 大小為基礎經基因掃描得到的免疫掃描譜型圖)。因為PCR產物的熔解溫度與產物片段組成、 大小，堿基成份等有關，因此根據基因熔解譜型圖我們可以區分混合PCR產物中片段組成情 況，若為單峰，則表示PCR產物中片段組成單一，若為多峰，則表示PCR產物由多個片段組 成，從而得知特定基因的克隆性擴增情況，來反映機體T細胞功能狀態。
另外，病毒性感染(如HBV)和TCR CDR3克隆性增生之間關系研究的應用，我們可以考慮 以下幾方面(l)找到與某一病毒感染較為密切相關的特異性TCR CDR3亞家族，從機制方面 探討T淋巴細胞在疾病發生和發展中的變化；(2)分析病毒感染相關的TCR CDR3家族和機體 感染后特異性免疫應答的強弱，考慮采用特異性的TCR CDR3單克隆抗體活化感染患者自體T 細胞，獲得臨床治療數量的特異性CTL細胞從而用于相應病毒感染所致疾病的潛在治療；(3) 若已知特異性TCR CDR3的基因組成，可用來轉染(TCR基因)自體或異體外周血淋巴細胞來 治療相應疾病；(4)己知克隆特異性TCR分子組成，可有助用于CTL表位的鑒定和HBV治療性 多肽疫苗的設計。進行這方面的研究即可從理論上帶動人們從更深層次認識T細胞及其特異 性TCR在感染性疾病(病毒、細胞、寄生蟲)中的作用，也有助于設計出用于相應疾病治療的 多肽疫苗。克隆特異性T細胞的檢測方法也有助于明確T淋巴細胞在腫瘤、自身免疫病、移 植排斥等發病及惡化中的作用，有利于這些疾病的診斷與治療。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測外周血克隆特異性T淋巴細胞的方法，為研究與TCR相關 的感染性免疫、自身免疫性疾病、移植排斥、腫瘤(血液病)等提供一個很好的技術平臺。
本發明的一種檢測外周血克隆特異性T淋巴細胞的方法，包括如下步驟-
(1) 制備抗凝的外周血待檢樣本；
(2) 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，試劑盒抽提PBMC中總RNA，并采用 MBI公司逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA;
(3) 以T細胞受體(TCR) beta鏈可變區(BV) 24個家族的26條引物之一分別為上游引物， 其中BV5， BV13各2條引物；BC1、BC2區域設計共同下游引物BC，染料法(SYBR Green I)實時熒光定量PCR擴增外周血上面步驟(2)制備的cDNA;
(4) 熔解曲線分析cDNA的PCR產物，通過對PCR產物熒光強度變化負一次導數(-dF/dT)與 溫度(Tm)間作圖，得到TCR BV 24家族各家族相應峰形圖，統稱為基因熔解譜型圖 (GMST)，對只出現單峰BV家族的PCR產物純化后進行序列分析，或以相同的引物對 PCR產物再次擴增，所得PCR產物純化后再行序列分析；
(5) 根據基因熔解譜型圖上各BV家族峰形分布，若BV某一家族在GMST上只出現單峰， 則表明該BV家族中的T淋巴細胞為特異性單克隆擴增，若BV各家族峰形圖(GMST)上 均無單峰出現，則說明外周血中不存在T淋巴細胞特異性擴增。
(6) 根據外周血中T淋巴細胞TCRBV各家族在GMST上峰形圖形狀與分布，可以進一步區 分T淋巴細胞單克隆、寡克隆或多克隆擴增情況。
步驟(2)所述總RNA提取試劑盒選用OMEGA公司產品；步驟(3)所述的實時熒光定量PCR 擴增試劑選用大連寶生物公司(TAKARA)試劑盒。
步驟(4)所述熔解曲線分析的反應室溫度從75'C以0.2°C/S溫度變化速率開始緩慢升至95 °C，即PCR產物的溫度每升高0.2匸，同時521nm波長檢測熒光值，保持時間為2s。
步驟(3)所述下游共同引物BC的基因序列如下5，-TTCTGATGGCTCAAACAC-3，。
圖1: 10例慢乙肝(CHB)患者外周血TCR BV 24家族cDNAPCR產物在基因熔解譜型上 出現為單峰的BV家族。
圖2:圖1中1例CHB患者TCR CDR3轉錄物PCR產物在基因熔解譜型圖上表現為單 峰的BV13.1家族測序結果的部分片段及其氨基酸序列。注TCR CDR3的氨基酸序列(帶下 劃線)OTSVYFCASSYSGOGIDGYTFGSGTRLTVVE
具體實施例方式
本發明的詳細實施步驟如下
(1) PBMC的準備抽取健康獻血者外周血5ml，以1.9%檸檬酸鈉抗凝(1:10)，輕搖1分鐘后， 室溫靜置1小時；將抗凝血用磷酸鹽緩沖液(PBS)或RPMI-1640培養基原液以1:1體積比 混勻；將稀釋血懸于5ml的淋巴細胞分層液(上海恒信試劑有限公司)的界面上，400g離 心20分鐘；用吸管將分離出的中間層(灰白色)細胞取出放入另一離心管，另入5倍體積 的PBS，充分混勻后，1500rpm離心IO分鐘；棄上清，用PBS再洗一次。得到外周血單 個核細胞(PBMC)用于提取totalRNA，若不能馬上提取，可于-75'C冰箱短期凍存。
(2) Total RNA的抽提外周血單個核細胞(PBMC) total RNA的提取采用E. Z. N. A Total RNA Kit系統(OMEGA公司)，提取過程嚴格按試劑說明書進行。最后吸附(bind)柱上的total RNA用無Rnase水洗脫，提取的total RNA或立即逆轉錄成cDNA，或存于-78。C冰箱備用。 RNA的質量與含量在Spectrophotometer (bio-rad)上測定OD260/OD280比值，取比值為 1. 7~2.0的RNA樣品用于后續實驗。
(3) cDNA合成分別取約l嗎總RNA為模板，用Olig(dT)為引物，cDNA反應體系為20|il， 每標本做3個反應，按cDNA合成試劑盒(MBI公司產品)條件合成cDNA，步驟如下 每一 0.2ml薄壁PCR反應管加入總RNA約l嗎，加入oligo(dT)18 Primer(0.5嗎/ml) lpl， 加入DEPC水至12^1，輕輕混勻，70°C， 5min，放置冰盒中；加入5Xbuffer 4μ1,加入 Inhibitor(20μ/μl) 1μl ，加入10mM dNTP 2pl，輕輕混勻，37°C， 5min;加入RvertAid H Minus M-MuLV(200uAil) 1μ1，總體積20^1， 42°C， 60min， 70°C， 10min，放置冰盒中。
(4) 引物合成根據文獻報道和人TCR基因庫，合成TCRBV基因24個家族上游引物26條 (其中BV5、 BV13各有二條引物)；共用下游引物BC —條，后者核苷酸序列如下5'-TTC TGA TGG CTC AAA CAC-3，。
(5) 熒光定量PCR擴增BV各家族CDR3的cDNA:每20μ1 PCR反應體系中包含lulcDNA
樣本(含相當于total RNA量10 50ng)和各0.3nmol/L的26條上游引物(BV1 24)之一、下 游引物(BC)，加入2X SYBR Real time PCR Master Mix預混合液IOpl，三蒸水補足20pl 反應體系，PCR反應條件如下94℃預變性3分鐘，94℃ 20秒，退火溫度設為56℃ 30 秒，延伸溫度72℃30秒，共45個循環。每個循環結束后，在80℃溫度保持2秒鐘后521nm 波長讀板(測定每孔熒光強度)，最后72℃延伸8分鐘。
(6) 實時熒光定量PCR產物的熔解曲線分析在PCR反應程序結束后，反應室溫度從75℃ 以0.2℃/s溫度變化速率開始緩慢升至95℃ ，即PCR產物的溫度每升高0.2℃ ，同時521nm 波長檢測熒光值，保持時間為2s。
(7) 熔解曲線分析PCR產物對PCR產物熒光強度變化負一次導數(-dF/dT)與溫度(Tm)間作 圖，得到BV各家族的峰形圖，統稱為基因熔解譜型圖(GMST)。根據BV各家族的基因 熔解譜型圖可以判斷T淋巴細胞克隆性擴增情況，若某一家族只出現單峰，說明該BV 家族的T淋巴細胞為單克隆擴增，若峰形圖上有多個峰，且不多于4個峰，則表明為寡 克隆擴增，若一個BV家族的峰形圖為多峰(多于4個峰)，則表明該BV家族中多克隆T 細胞存在。對只出現單峰(克隆性擴增)的BV家族的PCR產物純化后進行序列測定，測 序結果與DDBJ、 GeneBank及IMGT庫中標準TCR BV、 BD、 BJ、 BC序列進行比對 (BLAST),確定特異性克隆擴增的T細胞TCR CDR3基因組成。
本發明的優點和應用前景
T細胞受體(TCR) beta鏈可變區(BV) CDR3基因譜型檢測，以往的方法大都是通過半定 量檢測TCR CDR3某些譜系的PCR產物的明顯增加而間接推斷T細胞的克隆性增殖。
近年來，根據V(324個基因家族和Va的32個家族的cDNA序列分別設計各家族的上游引 物，從Cpi和Cp2區域設計一個C(3共同下游引物，每個標本分別進行V卩26個(BV5， BV13 各有二個亞家族)、Vct32個PCR擴增，通過對擴增產物的基因掃描而判斷T細胞克隆增殖， 如出現單克隆或寡克隆產物,則進一步分離純化，進行DNA序列分析，了解其CDR3的核苷酸序 列組成情況等，從而可以知道TCR的基因組成，稱為免疫掃描譜型分析技術。但此技術分析 T淋巴細胞的TCR基因譜型特征(TCRa鏈和TCR卩鏈CDR3基因)時操作較為復雜，且 容易交叉污染。應用染料法(SYBR Green I )實時熒光定量PCR技術和熔解曲線分析對外周 血TCR BV CDR3基因mRNA的轉錄物cDNA進行擴增和熔解曲線分析來檢測T細胞克隆性 擴增。從而可以避免聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析DNA片段大小時的繁瑣過程，也體現 了染料法(SYBR Green I)熒光定量PCR技術操作簡便、重復性高、交叉污染少且費用低等優 點。此技術為研究與TCR相關的感染性免疫、自身免疫性疾病、移植排斥、腫瘤(血液病)等 提供了一個很好的技術平臺。熔解曲線分析技術能很方便地在這些T細胞相關疾病中找特異 性克隆T細胞，從而有利于疾病的診斷，也大大縮短了操作時間。
研究機體外周血T細胞克隆性擴增情況，可以進一步了解T淋巴細胞在相應疾病發病機 制中的作用，檢測了 TCRCDR3序列，有可能通過轉基因(特異性TCR基因)來治療相應疾病，也有助于發展基于TCR表位多肽的治療性疫苗。
應用實例慢乙肝患者外周血淋巴細胞T細胞受體BVCDR3的檢測
本實施例以檢測慢乙肝患者外周血特異性T細胞克隆性擴增情況
世界衛生組織(WHO)把乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)列為全球十大死亡原因之首，全世界HBV感染者估計超過4.0億。其中至少有20。/r30n/。的HBV表面抗原(HBsAg)攜 帶者最終將死于慢性乙型病毒性肝炎(ChronicB Hepatitis, CHB)相關疾病(肝硬化、肝癌)。我國是HBV感染的高流行地區。根據2002年的全國HBV感染者血清流行病學調查，我國HBsAg 流行率為9.09%,約1.2億人，其中慢乙肝患者約為2000萬 3000萬。在慢性乙型肝炎5 年的自然史中，約10%~20%慢乙肝可發展為肝硬化，20% 23%肝硬化可發展為失代償性肝 硬化，6% 15%慢乙肝可發展為肝細胞性肝癌(HCC)。在慢乙肝患者中，約25% 40%最終將死于肝硬化或肝癌，高于世界平均水平。全國每年用于乙型病毒性肝炎及其相關疾病治療的費用數以億計，消耗了大量的醫療資源，但很多病人還是死于肝衰竭，肝癌。雖然肝移植是治療終末期肝病的很好手段，但由于肝源的極其缺乏，很多患者在等待中死去。因此在臨床上發展新的方法來監測病情進展甚至治療慢性乙型肝炎(CHB)很有現實意義。
HBV感染后，決定病程轉歸的一個主要因素是機體免疫應答能力，尤其是特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的反應水平。HBV感染機體后，體內活化的特異性CTL通過殺傷耙細胞和分泌細胞因子的非溶細胞機制抑制病毒復制。如研究發現在急性HBV 感染最終清除病毒個體中，其體內出現針對HBV的CTL反應是多克隆、多特異性的，但是在慢性感染的個體，特異性的CTL反應很弱、很難被檢測到，機體對HBV發展為一種免疫耐受狀態，使HBV感染持續存在而使病情慢性化。Ahmed R等指出抗病毒作用的T細胞免疫反應的強弱，很可能是決定HBV感染者的發病情況。其中，針對HBV各種抗原表位的特異性CTL作為主要的效應細胞，參與清除病毒和損傷細胞直接有關。有人對HBV慢性感染者與正常人外周血淋巴細胞功能狀況間關系研究后表明，慢性HBV感染者外周血T細胞功能沒有顯著改變，只是T細胞表面受體(T cell receptor, TCR)發生變化，說明TCR在HBV慢性感染者病程中起著重要作用，因此檢測克隆特異性T細胞和TCR BV CDR3的基因組成在研究慢乙肝患者的發病、惡化及其診治上具有重要的意義。
1.慢乙肝患者的診斷與來源
慢乙肝(CHB)組10例，男性6例，女性4例，年齡21-50(41. 3±7. 6y)，均為我院2006 年12月住院CHB患者，診斷符合2005年12月中華醫學會肝病學分會和感染病學分會聯合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》標準。所有患者除HBV感染外，其它已知病原體抗體檢測均陰性，無腫瘤和免疫性疾病，且在近6個月內未使用免疫調節劑或抗病毒治療。 2.外周血克隆性擴增T的檢測
慢乙肝患者外周血PBMC分離、總RNA的抽提、cDNA合成、熒光定量PCR操作、基因熔解 曲線分析同上面步驟。把在基因熔解譜型圖(GMST)上只出現單峰的PCR產物純化后進行序列 測定。把測序結果與Genebank上的TCR基因進行比較，從而確定慢乙肝患者外周血T細胞 克隆性擴增情況和T細胞TCR CDR3的基因組成。
慢乙肝患者的24個BV家族的基因熔解譜型圖中出現單峰圖的BV家族，見圖1~2。單 峰圖表明BV家族的CDR3轉錄體PCR產物組成單一，說明此CDR3可能來自單一 T細胞克 隆，我們對此PCR產物進行測序，表明為單一克隆(只列出一個標本的測序結果)，進一步說 明了結果的準確性。在本實施例中的10例慢乙肝患者外周血TCR BV 24家族的克隆性擴增 情況中，
我們發現有的患者幾個家族表現為單克隆擴增，有幾例患者出現相同BV家族的克 隆性擴增，至于其中的原因還需進一步的研究。
序列表
下游共同引物BC的基因序列5'-TTCTGATGGC TCAAACAC-3， 1例CHB患者克隆特異性BV 13.1家族TCR CDR3的氨基酸序列(帶下劃線) QTSVYFCASS YSGOGIDGY TFGSGTRLTVV E
權利要求
1、一種檢測外周血克隆特異性T淋巴細胞的方法，所述方法包括如下步驟(1)制備抗凝的外周血待檢樣本；(2)密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，試劑盒抽提PBMC中總RNA，并采用MBI公司逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA；(3)以T細胞受體(TCR)beta鏈可變區(BV)24個家族的26條引物分別為上游引物，其中BV5，BV13各設有2條上游引物；BC1、BC2區域設計共同下游引物BC，上面步驟(2)制備的cDNA為模板，染料法(SYBR Green I)實時熒光定量PCR進行擴增；(4)熔解曲線分析cDNA的PCR產物，通過對PCR產物熒光強度變化負一次導數(-dF/dT)與溫度(Tm)間作圖，得到TCR BV 24家族各家族相應峰形圖，統稱為基因熔解譜型圖(Genemelting spectratyping，GMST)；(5)根據基因熔解譜型圖上各BV家族峰形分布，若某一家族在GMST上只出現單峰，則表明該BV家族中的T淋巴細胞為特異性單克隆擴增，若GMST上BV各家族均無單峰圖形出現，則說明外周血中不存在T淋巴細胞特異性擴增。
2、 如權利要求l的方法，其特征在于步驟(2)所述總RNA提取試劑盒選自OMEGA公司； 步驟(3)所述的實時熒光定量PCR擴增選用大連寶生物公司(TAKARA)試劑盒。
3、 如權利要求l的方法，步驟(4)所述熔解曲線分析的反應室溫度從75'C開始以0.2t:/s溫度 遞增速率(ramp)緩慢升至95°C，即PCR產物的溫度每升高0.2°C，同時521nm波長檢測熒光 值，保持時間(holdtime)為2s。
4、 如權利要求l的方法，步驟(3)所述共同下游引物BC的基因序列如下5'-TTCTGATGG CTCAAACAC-3'。
全文摘要
一種檢測外周血克隆特異性T淋巴細胞的方法，包括抽提外周血單個核細胞總RNA并逆轉錄成cDNA。設計T細胞受體β鏈可變區(TCRBV)24個家族的上游引物和共同下游引物，染料法(SYBRGreenI)實時熒光定量PCR擴增cDNA。熔解曲線分析PCR產物，PCR產物熒光強度變化的負一次導數(-dF/dT)與溫度(Tm)間作圖，得到BV24個家族峰形圖，根據BV24個家族峰形圖上單峰出現情況，從而判斷克隆特異性T淋巴細胞在外周血中分布情況。本發明方法可用于檢測感染性疾病、自身免疫病、腫瘤或移植排斥中克隆特異性T細胞出現情況，用于評價機體對疫苗的應答情況等。
文檔編號C12Q1/68GK101200767SQ20071016449
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者李蘭娟, 楊介鉆 申請人:浙江大學