專利名稱：用于培養淋巴細胞的無血清培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及適于在體外培養淋巴細胞的培養基，具體地涉及了一種在體外能使淋巴細胞增生的無血清培養基。
背景技術：
隨著組織工程核基因工程的興起和發展，干細胞的研究稱為21世紀的熱點之一。在人和動物的個體發生發育過程中，在胚胎和成年組織中均存在著具有高度更新能力和多向分化潛能的干細胞。干細胞可體外分離、擴增和冷凍保藏，而且在適當條件下可以被誘導分化成多種細胞和組織，這為探討人和動物胚胎發生、組織細胞分化、基因表達調控等發育生物學問題提供了理想的模型系統，同時也為臨床組織缺陷性疾病和遺傳性疾病的細胞替代治療和基因治療開拓了新途徑。
造血干細胞是一類倍受關注的具有多向分化能力的干細胞，在不同的生理條件下，如在不同的造血細胞生長因子的刺激下可以向著淋巴細胞或髓性細胞的方向分化，髓性細胞進一步增殖可以產生成熟的紅細胞、白細胞或巨核細胞。每個巨核細胞又能產生數千個有功能的血小板。將造血干細胞輸入體內，可以很快分化成增殖形成成熟血細胞，因此，可以治療各種血細胞減少癥，也可以移植給骨髓衰竭病人，重建其造血功能。
淋巴細胞是一種具有重要用途的造血干細胞，進一步分化可以發育成功能性的淋巴細胞。Grimm，E.A等發現如果從癌癥患者體內提取外周血淋巴細胞(Peripheral Blood Lymphocyte，PBL)，將其在存在白細胞介素-2的條件下體外培養，該細胞能獲得識別并破壞癌腫瘤細胞的能力(參見Grimm，E.A等，J.Exper.Med.，1551823-1841)1982)；Grimm，E.A等，J.Exper.Med.，157884-897(1983)；Grimm，E.A等，J.Exper.Med.，1581356-1361(1983))。這一發現對于治療癌癥患者是非常有意義的，醫生可以從患者體內提取少量的淋巴細胞，體外培養以產生大量的具有抗腫瘤特異性的免疫淋巴細胞，即淋巴因子激活的殺手細胞(Lymphokine activated killer cells，LAK)。
Grimm，E.A等首次用含有人血清的培養基在體外成功培養出LAK細胞(J.Exper.Med.，157884-887(1993))。然而，人血清價格昂貴，不適宜于大規模擴增。Mazumder，A.等(J.Exper.Med.，159495-507(1984))和Rosentein，M等(J.Natl.Canc.Inst.，721161-1165(1984))研究證實含有胎兒牛血清的培養基也能刺激LAK細胞的產生。但是，發現胎兒牛血清誘導LAK細胞形成的效率較低(Imir，P等，Clin.Immunol.Immunopath.，36289-296(1 985))，其誘導產生的LAK的數量只有用人血清誘導產生的LAK細胞的數量的1/9。而且，胎兒牛血清對LAK細胞前體或LAK細胞自身具有毒性。針對上述缺陷，Froelich，C.J.，等(J.Immunol.Meth.，86205-211(1986))設計出了無血清培養基，該培養基是Dulbecco改良的Eagle培養基，其中補加了牛血清蛋白和三種脂肪酸亞油酸、油酸和棕櫚酸，另外還含有胰島素、轉鐵蛋白和乙醇胺。這種培養基能使LAK細胞增殖，但是其效率仍然比含有人血清的培養基要低得多。
因此，為了克服現有技術的缺陷，本發明提供一種新的培養基，該培養基不含血清，價格便宜，擴增淋巴細胞的效率與含有人血清的培養基相當且殺死腫瘤細胞的活性高。

發明內容
本發明的目的是提供一種在體外培養淋巴細胞的無血清培養基。該培養基包括基本培養基、白介素-2(IL-2)、脂肪酸、膽固醇、甘油酯、轉鐵蛋白。
基本培養基是Iscove改良的Dulbecco培養基(Iscove’s modified Kulbecco’smedium，IMDM)、McCoy’s5A或Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham’s-F12培養基以1∶1的比例混合而形成的培養基。優選地，該基本培養基是Iscove改良的Dulbecco培養基。
IL-2的用量是用常規方法測得，通常在T細胞株培養中加入不同濃度的IL-2，以3H-dR摻入法檢測細胞生長情況，選擇最佳濃度的IL-2用于淋巴細胞的培養。以3H-dR達到最大摻入量的50％時所需的IL-2的量為一個單位(U)，那么，IL-2的濃度一般為3-1000U/ml，優選為100-800U/ml，更優選為600U/ml。
可用的脂肪酸包括環狀糊精，如α-環狀糊精、β-環狀糊精、γ-環狀糊精，亞油酸，油酸或棕櫚酸其中的一種或幾種的組合。優選的是環狀糊精和亞油酸，更優選的是β-環狀糊精和亞油酸。脂肪酸在培養基中以有效量存在，優選含量為0.001-100ug/ml，更優選為0.1-10ug/ml。
膽固醇的含量為0.5-2.0ug/ml，優選為1.0-1.8ug/ml，更優選為1.5ug/ml。
可用的甘油酯包括甘油二脂和乙酰甘油酯，優選為甘油二酯，更優選為sn-1，2-甘油二酯。其濃度為0.5-20ug/ml，更優選為5-20ug/ml。上述化合物微溶于水，但加入助溶劑，如Tween(濃度為1-20ug/ml)可以使其溶解度增大。
轉鐵蛋白可以用公知的方法從動物或人體中提取純化。所用的純的轉鐵蛋白的濃度為80-500ug/ml，優選為130-500ug/ml，更優選為275-400ug/ml，更優選為300ug/ml。
該培養基所使用的緩沖溶液是碳酸氫納或HEPES。培養基的pH值保持在6.8-7.2之間，優選為7.0。
為了選擇性培養特定的淋巴細胞，可以向培養基中加入有效量的抗生素，如青霉素、慶大霉素或鏈霉素中的一種或幾種。
用上述培養基37℃培養分離的淋巴細胞，所得的淋巴細胞與用含有人血清的培養基培養所得的干細胞比較，效率相當，且殺死細胞活性高、培養費用較低。
具體實施例方式
本發明用下面的實施例作進一步的說明，但對本發明的范圍不起限制作用。
實施例1淋巴細胞的分離與培養從患白血病的病人的靜脈中采血5-10ml，加入到肝素抗凝的離心管中，肝素的終濃度為40U/ml，用IMDM梯度密度離心分離提取單個核細胞，用IMDM洗滌2次，調整細胞濃度為1×106/ml備用。如果有必要，可以用常規的玻璃黏附法(glass adherence)對上述淋巴細胞進行進一步的純化。
在IMDM中加入青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml、亞油酸8ug/ml、膽固醇1.5ug/ml、甘油二酯15ug/ml、Tween80 5ug/ml、轉鐵蛋白300ug/ml，2600ug/mlHEPES緩沖液(pH 7.0)、2500ug/ml碳酸氫鈉。在使用培養基之前，向培養基中加入600U/ml的IL-2。將4ml上述分離的細胞加入到該培養基中，5％CO2，飽和濕度下在24孔板中37℃培養7天，每3天更換培養液，每天觀察細胞生長或死亡情況。
實施例2與含有血清的培養基所產生的細胞集落數進行比較以補加了2％人血清的RPMI-1640培養基或Darfler培養基或IMDM培養基作為對照，按照與實施例1相同的方法培養淋巴細胞，在倒置的顯微鏡下計算同一孔板內的菌落數，結果發現，用實施例1的培養基培養所得的菌落數與用含有人血清的培養基培養得到的菌落數相當。這表明本發明的無血清培養基完全可以代替含血清的培養基。
實施例3Nk細胞毒性試驗將效應細胞，即上述培養分離的淋巴細胞用IMDM洗滌3次，配制成5×106個/ml細胞懸液。將靶細胞，即K562細胞用IMDM洗滌1次，配制成密度為5×107個/ml懸液，取細胞懸液0.1ml，加入0.1ml(100uCi)預先用生理鹽水配置的Na251CrO4(1.0mCi/ml)，置37℃溫育1h，用IMDM洗滌3次。計數后用培養液配成密度為1×105個/ml的細胞懸液。然后，分組加樣，反應在U型微孔板中進行。分3組，每組3復孔1)試驗組每孔加效應細胞和靶細胞懸液各100ul；2)自發釋放組每孔加靶細胞懸液和培養液各100ul；3)最大釋放組每孔加靶細胞懸液和1％Triton X-100水溶液各100ul。最后，將微孔反應板方在帶有反應板支架的離心機上以800r/min離心5min，以促進效應細胞和靶細胞結合。然后，置37℃5％CO2培養箱中培養，6h后，取出反應板，測定cpm值。
取各組3管均值計算自發釋放率和自然殺傷率(即NK細胞活性)。結果，用本發明的培養基培養出的淋巴細胞的自然殺傷率為79％，高出正常值。
權利要求
1.一種在體外培養淋巴細胞的無血清培養基，其特征在于該培養基含有基本培養基、細胞生長因子IL-2、脂肪酸、膽固醇、甘油酯、轉鐵蛋白。
2.權利要求1的培養基，其中的基本培養基是Iscove改良的Dulbecco培養基、McCoy’s5A或Dulbecco改良的Eagle培養基與Ham’s-F12培養基以1∶1的比例混合而形成的培養基。
3.權利要求1的培養基，其中的基本培養基是Iscove改良的Dulbecco培養基。
4.權利要求1的培養基，其中細胞生長因子IL-2的濃度為3-1000U/ml。
5.權利要求1的培養基，其中細胞生長因子IL-2的濃度為100-800U/ml。
6.權利要求1的培養基，其中細胞生長因子IL-2的濃度為600U/ml。
7.權利要求1的培養基，其中的脂肪酸包括α-環狀糊精、β-環狀糊精、γ-環狀糊精，亞油酸，油酸或棕櫚酸其中的一種或幾種的組合。
8.權利要求1的培養基，其中的脂肪酸是β-環狀糊精和/或亞油酸。
9.權利要求1的培養基，其中脂肪酸的含量為0.001-100ug/ml。
10.權利要求1的培養基，其中脂肪酸的含量為0.1-10ug/ml。
11.權利要求1的培養基，其中膽固醇的含量為0.5-2.0ug/ml。
12.權利要求1的培養基，其中膽固醇的含量為1.0-1.8ug/ml。
13.權利要求1的培養基，其中膽固醇的含量為1.5ug/ml。
14.權利要求1的培養基，其中的甘油酯包括甘油二脂和/或乙酰甘油酯。
15.權利要求14的培養基，其中甘油酯的濃度為0.5-20ug/ml。
16.權利要求14的培養基，其中甘油酯的濃度為5-20ug/ml。
17.權利要求1的培養基，其中的轉鐵蛋白的濃度為80-500ug/ml。
18.權利要求1的培養基，其中的轉鐵蛋白的濃度為300ug/ml。
19.權利要求1的培養基，其pH值保持在6.8-7.2之間。
20.權利要求1的培養基，其pH值為7.0。
全文摘要
本發明涉及適于在體外培養淋巴細胞的培養基，具體地涉及了一種在體外能使淋巴細胞增生的無血清培養基。該培養基包括基本培養基、白介素－2、脂肪酸、膽固醇、甘油酯、轉鐵蛋白，不含血清，價格便宜，擴增淋巴細胞的效率與含有人血清的培養基相當且殺死腫瘤細胞的活性高。
文檔編號C12N5/08GK1566331SQ0314787
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月27日 優先權日2003年6月27日
發明者任秀寶 申請人:北京天潤善達生物科技有限責任公司