專利名稱：鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法
技術領域：
本發明屬于化學分析領域，涉及生物傳感器，尤其是一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法。
背景技術：
鏈霉素(Streptomycin, STR)是一種氨基糖苷類抗生素,對于革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌，尤其是結核桿菌，具有顯著的抗菌活性，在畜牧業和水產業中作為飼料添加劑和治療動物疾病廣泛應用。但是，鏈霉素對聽神經有明顯的毒性作用，能造成耳聾，對過敏胎兒更為嚴重，具有腎毒性，濫用、不遵守休藥期、超量用藥等造成的鏈霉素殘留，會直接威脅人、畜的健康。STR殘留物可存在于肉類、肝、腎、牛奶以及蜂蜜中。各國對STR殘留限量都做出了明確規定，我國農業部2002年發布的第235號文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定鏈霉素在牛奶中殘留限量為200μ g/L，在肌肉、脂肪、肝中為600μ g/kg，在腎中為 1000 μ g/kg O目前，國內外測定鏈霉素的主要方法有分光光度法、微生物法、免疫學檢測法、液相色-串聯質譜法(LC-MS/MS)和熒光衍生測定法等。雖然，一些理化檢測方法比較靈敏、精確，但由于鏈霉素缺少較強的紫外吸收生色基團，檢測前往往需要通過一系列的衍生方法進行處理，操作繁瑣、耗時長；高效液相色譜儀、質譜儀等大型設備的使用，對發明人員要求較高，檢測成本高。因此，建立一種快速、簡便的檢測方法對于鏈霉素殘留檢測是非常重要的。分子印跡技術(molecularimprintingtechnique,MIT)亦稱分子模板技術,是指以某一特定的目標分子為模板，制備對該分子具有特異選擇性聚合物的過程。分子印跡技術自上世紀90代有了迅猛發展 ，分子印跡聚合物(MIPs)常作為傳感器的識別元件或改性材料應用環境檢測、抗生素檢測等領域。電化學聚合電活性功能單體制備的分子印跡聚合物，既具有類似金屬的特性，也保留了有機聚合物的性能，且與滴涂和旋涂等化學方法在導電基質表面聚合的MIP薄膜相比具有其優越性，如制備簡單、膜厚可控、高重現性，以及在水溶液中聚合和操作的可行性。

發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測靈敏度高、重現性好、選擇性高的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:—種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，制備傳感器的步驟如下:⑴玻碳電極預處理:將玻碳電極拋光、清洗，然后將電極置于0.5mol/LH2S04溶液中，在一 1.0 + 0.8 V電位區間內，以0.1V/S的掃速進行循環伏安掃描，直至得到穩定的循環伏安響應，得到具有活性的電極；⑵分子自組裝膜修飾電極
將上述處理好的電極浸入聚合底液，通純N2IOmin后，在O 0.8V的電位區間內循環伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s ；所述聚合物底液為含有功能單體鄰苯二胺、模板分子硫酸鏈霉素的PBS溶液，pH=5.0 ；所述聚合底液中功能單體:模板分子的摩爾濃度比為4:1;⑶洗脫模板分子采用上述步驟⑵修飾電極，再經70被％乙醇溶液洗脫后，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器。而且，所述玻碳電極拋光、清洗的方法為:將玻碳電極在涂有0.05 μ HiAl2O3漿液的麂皮上“8”字型拋光至鏡面，水沖洗后，依次用1:1HNO3、無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗3min,以洗去電極表面殘存的化學物質以及惰化層。而且，所述步驟⑶洗脫15分鐘。而且，所述步驟⑵聚合底液中含有0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。而且，所述步驟⑵聚合物底液采用0.lmol/L的KCl溶液作為支持電解質。本發明的優點和有益效果為:1、本發明基于分子印跡技術，通過電化學聚合方法，利用循環伏安法以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體制備出分子印跡電極，建立了快速、靈敏的鏈霉素檢測方法，為小型化和自動化、低檢測限的電化學傳感器的發明提供依據。2、本發 明使用的鄰苯二胺能形成致密的剛性絕緣聚合膜，非常適合用于分子印跡，能提供親水性、疏水性及其他的識別位點，但緩沖液中聚鄰苯二胺膜對帶正電荷的物質具有選擇透過性，采用正電荷探針如[Ru (NH3)6]3+會干擾發明，故本發明中選取[Fe(CN)6]'鐵氰化鉀具有良好的電化學穩定性，可保證分析結果的可靠性。由圖2可知，K3[Fe (CN)6]在洗脫處理后的非印跡膜表面幾乎無響應(曲線d)，而洗脫處理后的印跡膜峰電流(曲線b)較大，但與裸電極表面峰電流(曲線a)相比較小。3、本發明制備的傳感器經二次洗脫20min，重現的響應值可與原響應值基本一致，以此傳感器對1.0 μ mol/L硫酸鏈霉素溶液平行測試4次，響應值的RSD為1.33%，顯示了良好的重現性。此傳感器在連續使用7次，最終響應值降到初始值的79.2%。


圖1-1和圖1-2為本發明循環伏安電聚合曲線:其中，圖1-1為鄰苯二胺單體聚合；圖1-2為鄰苯二胺和鏈霉素聚合；圖2為本發明不同電極在K3[Fe (CN)6]溶液中的方波伏安圖:(a)裸玻碳電極；(b)MIP/GCE ; (c) MIP 重鍵合 STR 后的電極；(d) NIP/GCE ；圖3為本發明不同配比模板-單體配比對印跡膜性能的影響；圖4為本發明的標準曲線。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
實施例1一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，步驟如下:⑴玻碳電極預處理 將玻碳電極在涂有0.05 μ HiAl2O3漿液的麂皮上“ 8 ”字型拋光至鏡面，水沖洗后，依次用1:1HNO3、無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗3min，以洗去電極表面殘存的化學物質以及惰化層。最后將電極置于0.5mol/L H2SO4溶液中，在一1.0 +0.8 V電位區間內，以0.1V/s的掃速進行循環伏安掃描，直至得到穩定的循環伏安響應，得到具有活性的電極；⑵分子自組裝膜修飾 電極將上述處理好的電極浸入含有20mmol/L鄰苯二胺(功能單體)、5mmol/L硫酸鏈霉素(模板分子)和0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=5.0)的聚合底液(其中0.lmol/L的KCl溶液作為支持電解質)，通純N2IOmin后，在O 0.8V的電位區間內循環伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s ；⑶洗脫模板分子采用上述步驟⑵修飾的電極，再經70wt%乙醇溶液洗脫后，洗脫15分鐘，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器；取出后再用雙蒸水淋洗5min，以洗脫出模板分子，并在含有4mmol/L K3 [Fe (CN)6]的PBS緩沖液中經循環伏安曲線比較洗脫效果。實施例2非印跡聚合膜(NIP)的制備，以實施例1同樣的方法進行，但步驟⑵中不加入模板分子。實施例3與實施例1的區別在于:步驟⑶印跡膜的洗脫采用lmol/L NaOH溶液洗脫15分鐘，在含有4mmol/L K3 [Fe (CN)6]的PBS緩沖液中經循環伏安曲線比較洗脫效果。實施例4與實施例1的區別在于:步驟⑶印跡膜的洗脫采用lmol/L H2SO4溶液洗脫15分鐘，在含有4mmol/L K3 [Fe (CN)6]的PBS緩沖液中經循環伏安曲線比較洗脫效果。以下內容對上述實施例制備的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法的性能檢測及比較。1、電化學檢測及標準曲線繪制本發明中均以K3 [Fe (CN)6]為探針，利用方波伏安法間接表征GC裸電極、MIP電極、MIP重鍵合后的電極和NIP電極的電流。通過測定吸附前后鐵氰化鉀方波峰的變化(Λ I)，計算出K3[Fe(CN)6]相對峰電流與硫酸鏈霉素溶液濃度之間的關系，繪制標準曲線，進而可間接測得硫酸鏈霉素的含量。2、印跡膜的選擇性將制得的印跡電極分別置于相同濃度的以慶大霉素和紅霉素為干擾物的緩沖液中吸附后，方波伏安法檢測。3、印跡膜的重現性使用同一支電極平行測定同一濃度硫酸鏈霉素溶液。印跡電極每次使用完后浸入
0.1moI/LPBS緩沖液中室溫下保存。檢測結果如下:
1、分子印跡的電聚合圖l-2(b)為鏈霉素在與鄰苯二胺經電化學作用在玻碳電極表面沉積的電化學行為。隨著掃描的進行，峰電流發生正移并且電流值迅速衰減，但是當掃描20圈，法拉第電流基本穩定，說明電極表面形成了低導電性致密的印跡聚合膜。對比圖1-1 (a)與圖l-2(b)，MIP膜與NIP膜的CV曲線峰形、峰位置及變化的趨勢相似，沒有額外的峰出現，說明鏈霉素在O 0.8V的電位區間內沒有參與電化學氧化反應，保證其在聚合膜中保持正確的三維結構、形成特異性識別位點。2、印跡膜性能的分析鄰苯二胺能形成致密的剛性絕緣聚合膜，非常適合用于分子印跡，能提供親水性、疏水性及其他的識別位點，但緩沖液中聚鄰苯二胺膜對帶正電荷的物質具有選擇透過性，采用正電荷探針如[Ru(NH3)6]3+會干擾發明，故本發明中選取[Fe(CN)6]'鐵氰化鉀具有良好的電化學穩定性，可保證分析結果的可靠性。由圖2可知，K3[Fe (CN)6]在洗脫處理后的非印跡膜表面幾乎無響應(曲線d)，而洗脫處理后的印跡膜峰電流(曲線b)較大，但與裸電極表面峰電流(曲線a)相比較小。結果說明，脫除模板分子STR后的印跡膜表面留有的空穴為K3[Fe(CN)6]擴散 提供通道，當MIP電極重新浸入含有硫酸鏈霉素溶液中吸附一段時間后，硫酸鏈霉素在氫鍵、靜電作用等作用下重新占據印跡空腔，導致方波峰電流值降低(曲線C)。本發明中，嘗試了不同的模板分子和功能單體的配比下電聚合制備印跡膜，并利用Spartan’ 08 (vl.2.0)模擬模板-單體的預聚合,考察結合能(Δ Ef)的值,得到n (STR):n(OPD)=1:4的條件下獲得的印跡膜具有最負的能量值，可形成相對穩定的聚合物。這也在發明中得到證實，由圖3可知，此條件下的制備的印跡膜相同條件洗脫前后可獲得最大的峰電流變化值(Ai)，增大了電流可變化限度，提高了發明的精確度。其他條件下可能出現功能單體量過少，難以將模板分子束縛印跡膜中，導致留有的空腔不足；功能單體量過大，洗脫時鏈霉素從交聯結構中脫除受阻，印跡位點重鍵合時不易接近。3、洗脫劑和洗脫時間的影響從高交聯度的聚合膜中去除模板分子的步驟對印跡位點的形成是非常重要的。鏈霉素易溶于水，不溶于大多數有機溶劑，分子結構中含有多羥基，通過氫鍵與鄰苯二胺相互作用形成分子印跡聚合物，通過溫和的溶劑即可去除模板分子。發明中選取了 Imol/LNaOH溶液、ImoVLH2SO4溶液和75%的乙醇溶液作為洗脫劑，探討不同洗脫方法對MIP膜制備的影響，選擇出高效、快捷的洗脫方法。發明表明，洗脫時間相同，采用75%乙醇溶液進行一次洗脫，方波峰電流較大，對NIP膜的影響較小，洗脫15min后峰電流趨于穩定。4、標準曲線的繪制脫去模板分子的印跡電極放入含有一定濃度的硫酸鏈霉素溶液中吸附25min，取出后用雙蒸水淋洗干凈，置于K3 [Fe (CN)6]溶液中檢測電流。(圖4)。5、印跡膜的選擇性慶大霉素和硫酸鏈霉素同為氨基糖苷類抗生素，結構類似，而紅霉素雖為大環內酯類，但其結構中多羥基，可與鄰苯二胺單體形成氫鍵，故選取二者做干擾發明。5倍濃度的慶大霉素濃度和17倍濃度的紅霉素濃度基本無影響。可見，硫酸鏈霉素傳感器的選擇性較好。
6、印跡膜的重現性使用過的傳感器經二次洗脫20min，重現的響應值可與原響應值基本一致，以此傳感器對1.0 μ mol/L硫酸鏈霉素溶液平行測試4次，響應值的RSD為1.33%，顯示了良好的重現性。此傳感器在連續使用7次，最`終響應值降到初始值的79.2%。
權利要求
1.一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:制備傳感器的步驟如下: ⑴玻碳電極預處理:將玻碳電極拋光、清洗，然后將電極置于0.511101/1^2504溶液中，在一 1.0 + 0.8 V電位區間內，以0.lV/s的掃速進行循環伏安掃描，直至得到穩定的循環伏安響應，得到具有活性的電極； ⑵分子自組裝膜修飾電極 將上述處理好的電極浸入聚合底液，通純N2IOmin后,在O 0.8V的電位區間內循環伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s ； 所述聚合物底液為含有功能單體鄰苯二胺、模板分子硫酸鏈霉素的PBS溶液，pH=5.0 ； 所述聚合底液中功能單體:模板分子的摩爾濃度比為4:1 ； ⑶洗脫模板分子 采用上述步驟⑵修飾電極，再經70wt%乙醇溶液洗脫后，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器。
2.根據權利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述玻碳電極拋光、清洗的方法為:將玻碳電極在涂有0.05 μ HiAl2O3漿液的麂皮上“8”字型拋光至鏡面，水沖洗后，依次用1:1HNO3、無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗3-10min。
3.根據權利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟⑶洗脫15分鐘。
4.根據權利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵聚合底液中含有0`.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵聚合物底液采用0.lmol/L的KCl溶液作為支持電解質。
全文摘要
本發明涉及一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，制備傳感器的步驟如下⑴玻碳電極預處理；⑵分子自組裝膜修飾電極將處理好的電極浸入聚合底液，通純N210min后，在0～0.8V的電位區間內循環伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s；⑶洗脫模板分子采用上述步驟⑵修飾電極，再經70wt%乙醇溶液洗脫后，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器。本發明基于分子印跡技術，通過電化學聚合方法，利用循環伏安法以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體制備出分子印跡電極，建立了快速、靈敏的鏈霉素檢測方法，為小型化和自動化、低檢測限的電化學傳感器的發明提供依據。
文檔編號G01N27/327GK103243367SQ201310184510
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月17日 優先權日2013年5月17日
發明者張娟琨, 陳怡 , 劉利娟 申請人:天津前方科技有限公司