專利名稱：馬立克氏病病毒快速檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測馬立克氏病的器具，特別是涉及一種快速檢測馬立克氏病病毒的膠體金試紙條。
背景技術：
馬立克氏病(Marek，s disease, MD)是由馬立克氏病病毒(Marek，s diseasevirus, MDV)引起的一種禽類高度接觸性、傳染性、淋巴組織增生性腫瘤病。該病以外周神經、性腺、虹膜、各種內臟器官、肌肉和皮膚單核細胞的浸潤和腫瘤形成為主要特征。臨床上MD發病雞群表現為生長不均勻、極度消瘦、死亡等癥狀，最常見的病變是神經損害和多種實質臟器的淋巴腫瘤，以肝臟、脾臟腫瘤最為多見，因神經損害導致的不對稱性進行性麻痹，最終可引起單個或多個肢體的完全性麻痹。根據癥狀和病變發生部位，MD在臨床上分為四種類型，即神經型、內臟型、眼型和皮膚型，有時也可混合發生。MDV主要危害雞，鵪鶉、山雞也有發病。MDV有三種不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含有特異性抗原。近年來MDV的毒力呈不斷增強趨勢，至今已發生三次大的毒力變異。MD免疫的失敗在世界各地屢有發生，我國也存在類似情況。因此，及時對臨床病例進行快速診斷，對該病的有效防控具有重要意義。MD的診斷主要有病毒分離培養、血清學檢測、病毒核酸檢測和病理組織觀察、DNA探針技術、端粒酶活性檢測等手段，目前臨床上最常用的是前三種。病毒分離鑒定不但對臨床診斷很有價值，對流行病學及病原學研究亦至關重要，但該方法檢測周期長，約需1-2個月，同時細胞培養的操作要求高，局限性較大。血清學檢測方法包括熒光抗體法(FA)、免疫過氧化酶法、瓊脂擴散試驗(AGP)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。這些方法都需要在實驗室內由專業技術人員操作，主要用于檢測毛囊上皮、溶細胞感染的淋巴細胞組織及細胞培養物等樣品，但在淋巴瘤和潛伏·感染的組織中很難檢測到MDV抗原。病毒核酸檢測主要是用PCR技術檢測組織樣本或細胞培養物中的MDV病毒基因組DNA，可以用于鑒別診斷致弱毒株和野毒株。與病毒分離培養相似，分子生物學檢測方法操作復雜、需要特殊儀器及專業技術人員。血清學方法雖然相對簡便，但仍需要熒光顯微鏡、酶標儀和許多配套試劑，以及較復雜的操作步驟和實驗室工作環境，不適合生產或現場的快速診斷，因此，該方法難以在生產基層或獸醫臨床上推廣應用。

發明內容
本發明要解決的技術問題是:提供一種簡便、準確、結果直觀、肉眼可判的快速檢測馬立克氏病病毒的試紙條，與其他檢測方法相比，該試紙條特異性強、靈敏度高、操作簡便、結果顯示快，檢測成本低廉。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案:
一種快速檢測馬立克氏病病毒MDV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜層上標記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對照印跡，以及含有抗MDV抗體的檢測印跡，所述抗MDV抗體為抗MDV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標抗體纖維層上附著有與檢測印跡對應的以膠體金標記的抗MDV的多克隆抗體或單克隆抗體。所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。所述支撐層由不吸水的硬質塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成；所述金標抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水層上敷設有保護膜，且在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向樣品吸附纖維層一側0.3 0.7cm處印制有樣品標記線，檢測印跡與對照印跡的排列組合為“ Il ”、“/ /”、“ + + ”、“U”、“H--Γ”、“ h卜”中的一種。所述膠體金標記的抗MDV的單克隆抗體是通過以下方法制備的:
篩選抗MDV的單克隆細胞株，擴大培養，用PBS洗滌后1000 r/min離心10 min, PBS洗
2遍，收集細胞，以每只I X IO6 2 X IO6個細胞量對經產母鼠進行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清,得到單克隆抗體腹水；
用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% -2 % (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑為15-20 nm的膠體金溶膠；以0.lmol/L的K2CO3調節膠體金溶膠的pH值至8.5-9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將所述的單克隆抗體腹水加入膠體金溶膠中，印跡10 min后，加20 % (wt)的PEG-10000 至 PEG-10000 的終濃度為 0.05 %(wt)，4°C下、1500 3000 r/min 離心 20 min,除去未結合的膠體金顆粒，4°C下、15000 r/min離心I h,棄上清液,獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，得到膠體金印跡的抗MDV單抗。所述抗MDV的單克隆細胞株是由以下方法制備的:
用原核表達MDV囊膜糖蛋白gB的重組質粒PET-28a-gB轉化大腸桿菌BL-21，挑取陽性克隆菌株；陽性菌液經IPTG誘導表達和培養，上清液經超聲波裂解后過鎳柱純化，得到純化的重組gB蛋白；
將純化的重組gB蛋白以20 30 μ g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原免疫6周齡Balb/c系小鼠三次,每次間隔15 30 d ;最后一次加強免疫后3 4 d,將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死后置于75% (V)酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌取其脾細胞，剪碎并經100目尼龍網過濾，用GNK洗液混懸脾細胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細胞；將I X IO8個脾細胞與2X IO7 5X IO7個NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸后，1000r/min離心10 min,棄上清,將細胞沉淀于37°C水浴中，在I min內緩緩加入0.7 1.0 mL的pH為8.5 pH 9.0的PEG-1500中，邊加邊搖晃，然后再緩慢加入GNK洗液15 ml, 37 °C水浴5 min后補足GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min,棄上清；將細胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養基中，最后以200 VL/孔鋪板至96孔培養 板，置于37°C、5%的CO2培養箱中培養7 10 d，雜交瘤的培養上清用間接免疫熒光試驗檢測，挑選熒光較強的細胞克隆，用有限稀釋法連續進行三次細胞亞克隆，最后篩選得到特異性的抗MDV的單抗雜交瘤細胞株。所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H2010.68g、NaH2PO4.2Η20 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚紅 0.03g，混合后加雙蒸水至 3000 ml，115。。滅菌15 min。本發明的有益效果:
(I)本發明根據ELISA的基本原理，用免疫層析試紙檢測病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，將抗原-抗體反應由ELISA的傳統液相環境轉到固相濾膜上快速進行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況，即時獲得檢測結果，因此該方法比ELISA等血清學方法更為簡便、快速。(2)檢測特異性強，敏感性高。試紙條以膠體金印跡高親和力的特異性單抗/多抗為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標對單抗/多抗特異性和親和力(結合力)影響很小，且具有較高的印跡率。(3)操作簡便，快速。使用本發明試紙條時無需附加任何其它儀器和試劑，只要將其測試端插入待檢樣品液中30秒左右，在1-5分鐘內即可判定檢測結果。(4)結果顯示直觀、準確。試紙條以顯示棕紅色的檢測印跡和對照印跡作為檢測的陽性和陰性印跡，即在纖維素膜上顯示兩條棕紅色印跡，表示病毒在被檢測樣品液中被檢出，結果為陽性；在纖維素膜上只顯示一條棕紅色對照印跡C，表示病毒在被檢測樣品液中未檢出，結果為陰性。結果判定直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性的誤判。(5)減少投資和檢測成本。使用該試紙條不需另配其它儀器、設備和試劑，節省大量儀器、設備和附加試劑費用，專業和非專業人士均可隨時隨地進行現場檢測，無需支付專家診斷檢查費或送樣品去診斷室的路費，節省檢測成本。使用該試紙條檢測每份樣品僅需人民幣3 5元，比用通常的儀器 分析(每份樣品300元左右)和進口 ELISA試劑盒(每份樣品30元左右)的檢測費大幅下降。(6)應用范圍廣，便于普遍推廣。本發明操作簡單，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖和個體養殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經濟、社會效益。


圖1為本發明試紙條的俯視結構示意圖。圖2為圖1的試紙條的側面結構示意圖。圖中I為支撐層，2為樣品吸附纖維層，3為金標抗體纖維層，4為纖維素膜層，5為吸水層，6為檢測印跡，7為對照印跡，8-1為測試端保護膜，8-2為手柄端保護膜，9為印跡線。
具體實施例方式實施例1:一種快速檢測馬立克氏病病毒(MDV)的試紙條，參見圖1、圖2。支撐層I以塑膠薄片條制成，樣品吸附纖維層2以玻璃棉制成，金標抗體纖維層3上附著有膠體金標記的抗MDV單克隆抗體的玻璃棉制成的金標抗體，纖維素膜層4為硝酸纖維素制成，吸水層5由吸水濾紙制成，將編號2、3、4、5各層依次粘貼在支撐層I上，彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透。纖維素膜層4上設有抗MDV多克隆抗體IgG溶液標記檢測印跡6(代號T)，以及以羊(兔)抗小鼠IgG溶液標記出對照印跡7 (代號C);檢測印跡與對照印跡的排列形式為“ I I ”。測試端保護膜8-1覆蓋在樣品吸附纖維層2和金標抗體纖維層3上面，在測試端保護膜8-1上偏向于樣品吸附纖維層2的一側0.5cm處印有印跡線9，印跡線右端印有箭頭及MAX字樣，吸水層5上覆蓋有其它顏色(如黃色或藍色)的手柄端保護膜8-2。用于對照印跡的羊(或兔)抗小鼠IgG抗體，及用于檢測印跡和金標抗體纖維層的抗MDV的多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法如下:
(I)羊(或兔)抗小鼠IgG的制備
以飽和硫酸銨法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，再加等體積的飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內2 h，在4°C、10000 r/min離心15 min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內2小時，在4°C、10000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2 3次，在4°C、10000 r/min條件下離心15min,收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。按50 yg/kg 100 yg/kg體重的劑量經皮下或肌肉注射IgG至抗體陰性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20 d后靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上，心臟采血或頸動脈放血，分離制備高免血清。以飽和硫酸銨法提取羊(或兔)抗小鼠的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于標記本發明試紙條的對照印跡。(2)抗MDV單克隆抗體細胞株的制備
用原核表達MDV囊膜糖蛋白B (Glycoprotein B, gB)的重組質粒PET_28a_gB轉化大腸桿菌BL-21，挑取陽性克隆菌株， 接種于5 mL LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜。取5mL培養物轉接于100 mL LB液體培養基中，37°C培養約3 h，達到對數生長期，即OD6tltl約0.8 1.2，按照每毫升培養基加入10 μ I 100 mmol/L IPTG至終濃度為1.0mmol/L誘導表達,28°C條件下緩慢振蕩培養4 5 ho在4°C、5000 r/min條件下離心15 20 min,棄上清，按I g濕重菌體/2 5 ml平衡緩沖液的比例充分懸浮菌體沉淀。用超聲波裂解儀裂解，直至云霧狀的菌液變得比較清亮，4°C、15000 rpm離心15 min，收集上清液備用。將上清液上樣至用平衡緩沖液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑5 mmol/L,pH 8.0)平衡的鎳離子親和層析柱,再依次分別用含30 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(NaCl 500 mmol/L.PB 20 mmol/L，pH7.4)進行分階段洗脫，收集各階段洗脫液。將各階段洗脫峰進行SDS-PAGE分析，電泳完畢后用考馬斯亮藍G2250 (甲醇:水:冰乙酸=4.5: 4.5:1)室溫染色2 h，用脫色液(40%甲醇、10%冰乙酸)脫色至背景清晰，觀察純化結果表明:重組菌經IPTG誘導后有明顯的與預期大小相符的目的蛋白條帶，說明gB蛋白在萬.coli中獲得了大量表達，經親和層析的重復洗脫液中，前兩次洗脫的純化蛋白含量最大，此后洗脫液中含量迅速減少，電泳與濃度測定結果一致，表明洗脫液中的MDV gB表達蛋白純度較高，可滿足單抗制備免疫原的需要。將純化的gB表達蛋白以20 30 μ g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原，免疫6周齡Balb/c系小鼠三次,每次間隔15-30天；最后一次加強免疫3 4天后,將免疫小鼠眼球放血，拉頸處死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌取其脾細胞、剪碎并經100 目尼龍網過濾，用 GNK 洗液(NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H20 10.68g、NaH2PO4.2H202.34g、葡萄糖6g、苯酹紅0.03g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115°C滅菌15 min)混懸脾細胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細胞；將IXlO8的脾細胞與2 X IO7 5 X IO7的NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸后，1000 r/min離心10 min,棄上清，細胞沉淀于37°C的水浴中，在I min內緩緩加入0.7 1.0 mL的PEG-1500 (pH 8.5 9.0)，邊加邊搖，然后緩慢加入GNK洗液15 ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5 min后補加GNK洗液至總體積40 ml, 1000 r/min離心10 min棄上清,將細胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養基中，以200 μ /孔鋪板至96孔細胞培養板，置于37°C、5%的CO2培養箱中培養7 10 d，用間接免疫突光試驗(Indirect immunofluorescence assay, IFA)檢測細胞培養上清,挑選突光較強的細胞克隆，用有限稀釋法連續進行三次細胞亞克隆，最后篩選得到特異性的抗MDV的單抗雜交瘤細胞株。(3)抗MDV金標單克隆抗體和金標單克隆抗體纖維膜的制備
將篩選到的特異性抗MDV的單抗細胞株擴大培養，PBS洗2遍后1000 r/min離心10min,收集細胞并以I X IO6 2X IO6個/只的細胞量腹腔注射經產母鼠，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min，上清即為所需的單克隆抗體腹水。以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2% (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑15 nm左右的膠體金。以0.1 mol/I^AK2CO3調膠體金pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將待印跡的抗MDV的單抗腹水加入PH8.5 9.5的金溶膠中，印跡10 min后，加20% (wt)的PEG-10000至PEG-10000終濃度達到0.05%，4°C、1500 3000 r/min條件下離心20 min,除去未結合的膠體金顆粒，4°C、15000 r/min條件下離心I h,棄上清液,獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，獲得膠體金印跡的抗MDV單抗。將1:100 1:500稀釋的膠體金印跡的上述單克隆抗體吸附于精制玻璃棉(尼龍纖維或聚酯纖維)中，4°C下低溫真空干燥，即制得抗MDV金標單克隆抗體纖維膜。(4)抗MDV多克隆抗體的制備
差速離心或蔗糖密度梯度離心對MDV CEF細胞毒進行濃縮、純化，甲醛滅活后用福氏佐劑乳化制備免疫抗原，單獨多次免疫接種抗體陰性健康羊或兔。末次免疫20 d后靜脈采血，以IFA檢測其血清抗體效價在1:2000以上時，心臟采血或頸動脈放血，分離制備高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)。(5)試紙條的檢測操作方法
a、樣品液的制備無菌取病雞的全血，以抗凝劑生理鹽水作1:1(Γ1:50倍稀釋，離心分離血液淋巴細胞懸液待檢。若取病雞的組織(如羽髓、肝臟、脾臟等)將其剪碎、研磨，以生理鹽水制成1:2 1:5的待檢測樣品懸液，置4°C澄清或離心。b、檢測操作將試紙條測試端插入待檢測樣品上清中，插入深度不超過印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時觀察結果。C、結果判斷如果在試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對照印跡C，表示測檢結果呈陰性，說明在被檢樣品液中未檢測出MDV ;如果檢測試紙條上的纖維素膜上出現棕紅色的對照印跡C和檢測 印跡T，表示檢測結果呈陽性，即在待檢樣品中檢測出MDV ;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。
(6)本發明試紙條的靈敏性、特異性試驗
a、靈敏性試驗。將MDV的CEF細胞培養液用PBS (PH7.4)或雙蒸水分別配制成不同病毒滴度的病毒溶液(100 PFU/mL、50 PFU/mL、25 PFU/mL、12.5 PFU/mL)，-20°C反復凍融3次后，將試紙條測試端插入病毒液中，插入深度不超過印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時觀察結果。插入100 PFU/mL和50PFU/mL病毒液中的試紙條均出現棕紅色的對照印跡C和檢測印跡T，即檢測結果為陽性；插入25 PFU/mL病毒液的試紙條出現棕紅色的對照印跡C，但檢測印跡T的棕紅色較弱，即檢測結果為弱陽性；插入12.5PFU/mL病毒液的試紙條只顯示出一條棕紅色對照印跡C，即檢測結果為陰性。由此可見，該試紙條對MDV具有較高的靈敏度，檢測MDV的最低病毒滴度為25 PFU/mL。b、特異性試驗。用本發明的試紙條檢測與MD同類的家禽免疫抑制病病毒如禽白血病病毒(ALV)、網狀內皮組織增生癥病毒(REV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的病毒培養液，結果顯示該試紙條的檢測結果均為陰性，說明該試紙條用于檢測MDV具有良好的特異性，可用于MDV的快速檢測。(7)上述試紙條的測試原理
當該試紙條測試端(樣品吸附帶)插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過層析作用帶動待檢病雞病料中的MDV病毒粒子及金標抗體纖維膜中的金標抗體一起向纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端吸水層中，擴散過程中待檢MDV可與相對應的金標單抗相結合，進而與纖維素膜上檢測印跡中的抗MDV的多抗IgG結合，從而顯示出棕紅色的檢測印跡T ;而對照印跡中的羊抗或兔抗小鼠IgG則可與金標單抗結合，形成棕紅色對照印跡C。如果待檢樣品液中沒有MDV，試紙條只顯示出一條棕紅色對照印跡C ;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。

實施例2:檢測馬立克氏病病毒的試紙條，其結構、制備方法與實施例1基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標抗體纖維層3上附著以膠體金標記的抗MDV金標多克隆抗體；在硝酸纖維素制成的纖維素膜層4上設有以抗MDV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測印跡T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對照印跡C。其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均與實施例1相同，不重述。實施例3:檢測馬立克氏病病毒的試紙條，其結構、制備方法與實施例1基本相同，不同之處在于:由聚酯纖維制成的金標抗體纖維層3上附著有抗MDV金標單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上以對應的抗MDV多克隆抗體IgG溶液標記出檢測印跡，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液印上對照印跡C。實施例4:檢測馬立克氏病病毒的試紙條，其結構、制備方法與實施例3基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標抗體纖維層3上附著抗MDV金標多克隆抗體；聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上以對應的抗MDV單克隆抗體IgG溶液標記出檢測印跡，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液標記出對照印跡C。實施例5:檢測馬立克氏病病毒的試紙條，其結構、制備方法與實施例1基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標抗體纖維層3上附著有抗MDV金標單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上以識別另一表位的抗MDV單克隆抗體IgG溶液印制出檢測印跡，以羊(兔)抗鼠IgG溶液標記出對照印跡C，檢測印跡與對照印跡的排列組合為“/廠，、“ + +，，、“_L_L，，、“丁丁”、“ |_ 卜”中的任意一種。
實施例6:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:支撐層I由不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2由尼龍纖維制成，纖維素膜層4用純纖維素膜制成。實施例7:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2由聚酯纖維膜制成，纖維素膜層4用羧化纖維素膜制成。實施例8:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖維素膜層4用聚偏二氟乙烯(PVDF)纖維膜制成。實施例9:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2采用聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
權利要求
1.一種快速檢測馬立克氏病病毒MDV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，其特征在于:所述纖維素膜層上標記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對照印跡，以及含有抗MDV抗體的檢測印跡，所述抗MDV抗體為抗MDV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標抗體纖維層上附著有與檢測印跡對應的以膠體金標記的抗MDV的多克隆抗體或單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述支撐層由不吸水的硬質塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述金標抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水層上敷設有保護膜，且在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向樣品吸附纖維層一側0.3 0.7 cm處印制有樣品標記線。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:檢測印跡與對照印跡的排列組合為“ Il，，、“/ /”、“ ++”、“丄丄”、“丁丁”、“ 1- P’中的一種。
8.根據權利要求1 7任一項所述的試紙條，其特征在于:所述膠體金標記的抗MDV的單克隆抗體是通過以下方法制備的: 篩選抗MDV的單克隆細胞株，擴大培養，用PBS洗滌后1000 r/min離心10 min，PBS洗2遍，收集細胞，以每只IX IO6 2X IO6個細胞量對經產母鼠進行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清,得到單克隆抗體腹水； 用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% -2 % (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑為15-20 nm的膠體金溶膠；以0.lmol/L的K2CO3調節膠體金溶膠的pH值至8.5-9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將所述的單克隆抗體腹水加入膠體金溶膠中，印跡10 min后，加20 % (wt)的PEG-10000 至 PEG-10000 的終濃度為 0.05 %(wt)，4°C下、1500 3000 r/min 離心 20 min,除去未結合的膠體金顆粒，4°C下、15000 r/min離心I h,棄上清液,獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，得到膠體金印跡的抗MDV單抗。
9.根據權利要求8所述的試紙條，其特征在于:所述抗MDV的單克隆細胞株是由以下方法制備的: 用原核表達MDV囊膜糖蛋白gB的重組質粒PET-28a-gB轉化大腸桿菌BL-21，挑取陽性克隆菌株；陽性菌液經IPTG誘導表達和培養，上清液經超聲波裂解后過鎳柱純化，得到純化的重組gB蛋白； 將純化的重組gB蛋白以20 30 μ g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原免疫6周齡Balb/c系小鼠三次,每次間隔15 30 d ;最后一次加強免疫后3 4 d,將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死后置于75% (V)酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌取其脾細胞，剪碎并經100目尼龍網過濾，用GNK洗液混懸脾細胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細胞；將IX IO8個脾細胞與2X IO7 5X IO7個NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸后，1000r/min離心10 min,棄上清,將細胞沉淀于37°C水浴中，在I min內緩緩加入0.7 1.0 mL的pH為8.5 pH 9.0的PEG-1500中，邊加邊搖晃，然后再緩慢加入GNK洗液15 ml, 37 °C水浴5 min后補足GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min,棄上清；將細胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養基中，最后以200 VL/孔鋪板至96孔培養板，置于37°C、5%的CO2培養箱中培養7 10 d，雜交瘤的培養上清用間接免疫熒光試驗檢測，挑選熒光較強的細胞克隆，用有限稀釋法連續進行三次細胞亞克隆，最后篩選得到特異性的抗MDV的單抗雜交瘤細胞株。
10.根據權利要求9所述的試紙條，其特征在于:所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取 NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H20 10.68g、NaH2PO4.2H20 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚紅0.03g,混合后加雙 蒸水至3000 ml,115°C滅菌15 min。
全文摘要
本發明公開一種快速檢測馬立克氏病病毒MDV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，吸附層由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜層上標記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對照印跡，以及含有抗MDV抗體的檢測印跡，所述抗MDV抗體為抗MDV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標抗體纖維層上附著有與檢測印跡對應的以膠體金標記的抗MDV的多克隆抗體或單克隆抗體。該試紙條檢測的特異性強、敏感性高，操作簡便，快速，結果顯示直觀、準確，檢測成本較低，適合馬立克氏病病毒的現場快速檢測；使用范圍廣，便于推廣應用。
文檔編號G01N33/532GK103235127SQ201310133198
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者羅俊, 滕蔓, 張改平, 崔治中, 鄧瑞廣, 江國托, 邢廣旭, 趙鵬, 楊繼飛, 郅玉寶, 楊艷艷, 郭軍慶, 王方雨, 喬松林, 王麗 申請人:河南省農業科學院