專利名稱：口蹄疫病毒定型試紙條及其制備和使用方法
技術領域：
本發明涉及對口蹄疫病毒的血清型進行快速準確診斷領域，具體說是一種口蹄疫病毒定型診斷試紙條，本發明包含有該試紙條的制備和使用方法。
背景技術：
口蹄疫(Foot-and-mouth diease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄類動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，其感染率之高，傳播速度之快，對社會危害之大，均居眾多疫病之最。國際獸疫局(OIE)將其列為A類烈性傳染病之首。由于口蹄疫的暴發，已經影響到國際關系、國家聲譽和世界各國的經濟發展，因此有人稱此病為“政治經濟病”。口蹄疫病毒有O、A、C、Asia I、SATl、SAT2和SAT3 7個血清型，80多個亞型，血清型間無交叉型免疫反應，而各亞型之間僅有部分交叉免疫原性，而且口蹄疫病毒不斷變異，新的變異株和來亞型的不斷出現，給口蹄疫的預防和控制帶來了極大的困難。在國際交流、外貿、進出口等方面各國都采取嚴加防范的措施，我國在進出境動植物檢疫法也將口蹄疫病的檢測放在第一位。
2005年5月國務院公布了我國Asia I型口蹄疫病毒疫情的流行狀況，這使各級防疫機構對口蹄疫診斷與防控更加重視。根據口蹄疫暴發時傳播迅速、來勢兇猛、發病范圍廣等特點，簡便快速的病原學診斷對疫情控制尤為重要。它可使一線防疫人員在疫情暴發時對現場做出正確的診斷，及時確定病原、切斷傳播途徑、采取有效的防范措施保障我國養畜業的健康、穩定發展。
目前，在世界口蹄疫參考實驗室口蹄疫病毒檢測及定型的常規方法仍是ELISA、病毒分離、RT-PCR等方法。這些方法不僅需要一定的儀器設備和實驗室設施，而且需要相關實驗技能的技術人員操作。同時操作復雜，過程繁多，成本高，不利于基層、田間口蹄疫流行病學調查及疫情防控的開展。

發明內容
本發明的目的在于提供一種可確定口蹄疫病毒O、A、Asia I、C型四種血清型的口蹄疫病毒定型診斷試紙條。該試紙條操作快速簡便，15min內即可顯示結果，判定直觀容易，結果敏感特異，費用低廉，運輸保存方便，非常適用于基層人員在田間檢測使用。
本發明的另一目的在于提供這種定型試紙條的制備方法。本發明的再一目的在于提供這種定型試紙條的使用方法。
本發明的目的是通過如下技術方案來實現的一種口蹄疫定型試紙條，由O、A、Asia I、C四種血清型檢測試紙條組成，其特征在于所述試紙條由PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊、樣品墊部分組成，所述PVC襯板設在最底部，襯板上部中段設有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上部左端貼有吸收墊，硝酸纖維素膜上部右端設有金標墊，金標墊的上部右端設有樣品墊。
所述的吸水紙和金標墊與硝酸纖維素膜的銜接處有交疊，金標墊與樣品墊之間也有交疊。
所述的硝酸纖維素膜上左端噴有抗兔、豚鼠和鼠IgG抗體為質控帶；硝酸纖維素膜上右端噴有口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體為檢測帶；金標墊上噴有膠體金標記的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體。
所述的硝酸纖維素膜和金標墊上噴有的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體為兔或豚鼠口蹄疫病毒抗體或口蹄疫病毒單克隆抗體上述口蹄疫定型試紙條的制備方法為1、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；2、膠體金標記的O、A、C、Asia I型口蹄疫病毒抗體制備首先將a步制得的膠體金用0.1mol/L K2CO3調整PH值為8.0-8.5；然后用目測法確定膠體金與待標記抗體應標記的最佳量，得到最佳標記量為4-10mg/100mL，在膠體金溶液中按4-10mg/100mL加入口蹄疫病毒抗體，攪拌10～20min；在膠體金溶液中按0.5-1g/100ml加入牛血清白蛋白，繼續攪拌10～20min，將上述膠體金經2000-4000r/min離心10-20分鐘，去除沉淀物，得上清液；將上清液經10000～12000r/min高速離心1h得到沉淀物，將沉淀懸浮于1/20-1/10初始膠體金體積的金膠緩沖液中，懸浮溶解，置4℃保存；3、定型診斷試紙條組裝3.1制備含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜用pH7.2-7.6 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液分別將抗兔、豚鼠和鼠IgGG抗體和O、A、C、Asia I口蹄疫抗體調整至1-2mg/ml和1.4-2.2mg/ml工作濃度，分別按1.8-2ul/cm設置噴膜，將上述兩種抗體噴涂于硝酸纖維素膜上，形成質控帶與檢測帶，37℃烘干或室溫晾干后，置于封閉液中浸泡5-15min，取出后室溫下晾干，保存備用；3.2制備膠體金墊取玻璃纖維紙，按10-20μL/cm將膠體金標記的O、A、C、Asia I口蹄疫抗體分別噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存備用；3.3試紙條的組裝在PVC背襯板由下至上分別將樣品墊、膠體金墊，包括檢測帶、質控帶的硝酸纖維素膜以及吸收墊按順序裝配，剪切成條狀，即制成不同型口蹄疫病毒診斷試紙條，口蹄疫O、A、C、Asia I型四種試紙條作為一個包裝裝入鋁塑袋中即為口蹄疫定型診斷試紙條。
上述金膠緩沖液為含5-15％蔗糖、1％BSA、0.5-1‰PEG20000、0.5-1‰Tween-20的PH7.5 0.11mol/L的磷酸鹽緩沖液。
上述封閉液為含2.5-5％犢牛血清，0.5-1‰Tween-20的PH7.4 0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液。
本發明口蹄疫定型試紙條的使用方法為1、待檢樣品的處理無菌操作將待檢水皰皮或乳鼠組織用PH7.2-7.50.02-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液洗2-3次，并用消毒濾紙吸去水份稱重，加入玻璃砂研磨，按1∶3～1∶10w/v加入PH7.2-7.5 0.02-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，制成懸液；室溫浸毒2小時或4℃冰箱內浸毒一夜。振搖后以4000r/min離心10min，取上清液即為待檢樣品；待檢水皰液可直接作為待檢樣品；2、樣品檢測待檢樣品、檢測試紙或其它檢測用材料等均在室溫平衡，將檢測試紙有標志線的一端插入待檢樣品中，當液體全部浸濕硝酸纖維素膜后，5-15分鐘內觀察結果；3、結果判定3.1單支試紙條結果判定陽性質控帶(6)與檢測帶(7)都出現清晰可見紅色條帶；陰性只有質控帶(6)出現清晰可見紅色條帶；可疑質控帶(6)出現一條顏色清晰可見的紅色條帶，而在檢測帶(7)出現一條淺色帶；無效質控帶(6)沒有出現紅色條帶；3.2定型結果判定O型O型試紙條結果為陽性，Asia I、A、C型試紙條結果為陰性或可疑；Asia I型Asia I型試紙條結果為陽性，O、A、C型試紙條結果為陰性或可疑。
A型A型試紙條結果為陽性，O、Asia I、C型試紙條結果為陰性或可疑。
C型C型試紙條結果為陽性，O、Asia I、A型試紙條結果為陰性或可疑。
陰性O、Asia I、A、C型試紙條結果均為陰性。
可疑O、Asia I、A、C型試紙條結果均為可疑，或其中三種、兩種試紙條結果為可疑。
當四種、三種和兩種試紙條對同一待檢抗原顯色結果均為陽性時，可將待檢樣品用稀釋液做對倍稀釋，再進行檢測，以c.2進行結果判定；上述稀釋液為含0.5-1‰吐溫-20的PH7.5 0.11Mol/L磷酸鹽緩沖液。
本發明采用的膠體金免疫層析技術(A gold immunochromatographic assayGICA)是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術。它是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(抗原或抗體)發生高特異性、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，運用可目測的標記物(膠體金)而得到直觀的實驗現象(顯色)。而游離標記物則越過檢測帶，與結合標記物自動分離。這種分析技術具有操作簡單快速、不需儀器設備；結果判定直觀、靈敏準確；無放射性同位素與苯二胺等有害物質參與，不會污染環境，安全性好；可單份測定，所需試劑和樣本量少，成本低廉；保存與運輸簡單方便等優點。
因此，對國家重點防控的傳染病原口蹄疫來說，利用GICA發展新的快速簡便診斷技術，一方面可作為常規實驗室診斷方法的有益補充，另一方面將為口蹄疫定型診斷基層工作人員提供極大的方便。
評價實驗實例1.敏感性實驗取國家口蹄疫參考實驗室已確診為口蹄疫O、A、C、Asia I血清型的陽性樣本50份用定型試紙條檢測。符合率為92％。
2.特異性實驗用定型試紙條檢測國家口蹄疫參考實驗室已確診為口蹄疫陰性的水泡皮、水泡液及正常乳鼠組織樣本共計20份。檢測符合率為100％。
3.重復性實驗分別取不同生產批次041122、050310、050815試紙條對上述陽性與陰性樣品進行重復檢測，三次檢測的符合率為100％。
4.穩定性實驗將試紙條分別放在不同條件下貯存37℃一周、4℃一年，每隔1天和1月取出對相同陽性與陰性樣品進行測試。測試時均有表明實驗成功的質控帶出現，同時對陽性樣品的檢測，質控帶與檢測帶顯色程度與顯色時間無顯著性差異，說明其穩定性較好。
5.田間樣品的檢測應用試紙條對送檢的樣品和分離培養物進行檢測，包括細胞毒、鼠毒、水泡皮、水泡液、O/P液等共計107份樣品分別與反向間接血凝進行平行對比實驗。金標試紙與反向間接血凝法檢出的符合率為93.61％，無顯著性差異。
本發明的優點在于1、操作簡便，判定直觀容易，不需任何儀器和設備。一般人員按照說明書即可完成操作，勿需專門培訓。、2、測試方法快捷迅速，整個測試過程僅需15分鐘即可完成。
3、制做成本低廉，所需試劑和樣本量少。
4、運輸保存方便。由于膠體金標記蛋白質是一物理結合過程，結合牢固，很少引起蛋白質活性改變，所以試紙條質量穩定，不受溫度等外界因素影響，可在室溫中運輸保存。
5、安全無污染更環保。沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質參與，所以也不會污染環境，具有放射性同位素或酶標等檢測方法所無法比擬的安全性。
6、結果靈敏準確、特異性好，結果受外界因素影響較少。
由上述優點可以預見，在農村、野外、基層，對FMDV疫情跟蹤和流行病學調查工作中，該發明將具備更大的應用前景。


圖1為本發明試紙條結構示意2為膠體金顆粒透射電鏡示意3為試紙條陽性結果示意4為試紙條陰性結果示意5為試紙條可疑結果示意6為檢測帶顯色的試紙條無效結果示意7為檢測帶不顯色的試紙條無效結果示意圖具體實施方式
下面結合實施例對本發明進行進一步詳細說明。
實施例1O型口蹄疫診斷試紙條的制備1、膠體金的制備用檸檬酸三鈉還原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加熱至沸，攪動下準確加入1％檸檬酸三鈉水溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內變為紫紅色，繼續煮沸15min，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制備的膠體金中加入0.02％的NaN3，經一次性滅菌濾器過濾，裝入潔凈的玻璃瓶中備用。工作中所制備的膠體金直徑通過在透射電鏡(TEM像)觀察顆粒大小。測得平均粒徑為30.06±0.7nm，結果如圖2所示。
2、免疫膠體金的制備用0.1mol/L K2CO3調節膠體金溶膠至所需pH為8.2，按45μg/mL膠體金加入O型口蹄疫豚鼠IgG，磁力攪拌15min。在膠體金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，繼續攪拌15min，將上述膠體金經.3000r/min離心15分鐘去除沉淀物，得上清液；將上清液經10000r/min高速離心1h得到沉淀物，將沉淀懸浮于8/100初始膠體金體積的含10％蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的PH7.50.11mol/LPBS金膠緩沖液中，懸浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型診斷試紙條的制備方法3.1制備含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜用pH7.2 0.02mol/LPBS分別將純化的O型FMDV兔IgG調整至濃度為2.2mg/mL，兔抗豚鼠IgG濃度為1.0mg/mL。分別按1.8ul/cm設置噴膜，將兩種IgG噴涂于300mm×20mm的NC膜上，形成檢測帶與質控帶，兩線相距8mm，置于含2.5％犢牛血清1‰Tween-20的PH7.2 0.02mol/LPBS包被液中浸泡5min。取出后37℃烘干1h，保存備用。
3.2制備膠體金墊取玻璃纖維紙，用噴膜機按15μL/cm，將膠體金標記的O型FMDV豚鼠IgG，噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存備用。
3.3試紙條的組裝在PVC背襯板分別將吸取樣品用的樣品吸收墊、固定有膠體金標記O型口蹄疫抗體的膠體金墊，包被檢測帶、質控帶的硝酸纖維素膜以及吸水濾紙制成的吸收墊按由下至上按圖示1裝配，吸水紙和金標墊必須與硝酸纖維素膜膜有交疊0.1cm，而金標墊與樣品墊也應用交疊0.1cm。配件與塑料底板的結合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5mm的條狀，即制成O型FMDV診斷試紙條。
實施例2A型口蹄疫診斷試紙條的制備1、膠體金的制備用檸檬酸三鈉還原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加熱至沸，攪動下準確加入1％檸檬酸三鈉水溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內變為紫紅色，繼續煮沸15min，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制備的膠體金中加入0.02％的NaN3，經一次性滅菌濾器過濾，裝入潔凈的玻璃瓶中備用。工作中所制備的膠體金直徑通過在透射電鏡(TEM像)觀察顆粒大小。測得平均粒徑為30.06±0.7nm，結果如圖2所示。
2、免疫膠體金的制備用0.1mol/L K2CO3調節膠體金溶膠至所需pH為8.0，按40μg/mL膠體金加入A型口蹄疫兔IgG，磁力攪拌10min。在膠體金溶液中按0.5％加入牛血清白蛋白，繼續攪拌10min，將上述膠體金經2000r/min離心10分鐘去除沉淀物，得上清液；將上清液經10000r/min高速離心1h得到沉淀物，將沉淀懸浮于1/20初始膠體金體積的含5％蔗糖、0.5％BSA、0.5‰PEG20000、0.5‰Tween-20的PH7.40.11mol/LPBS金膠緩沖液中，懸浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型診斷試紙條的制備方法3.1制備含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜用pH7.2 0.02mol/LPBS分別將純化的A型FMDV豚鼠IgG調整至濃度為1.4mg/mL，羊抗兔IgG濃度為1.0mg/mL。分別按2ul/cm設置噴膜，將兩種IgG噴涂于300mm×20mm的NC膜上，形成檢測帶與質控帶，兩線相距8mm，置于含2.59％犢牛血清0.5‰Tween-20的PH7.4 0.02mol/L PBS包被液中浸泡5min。取出后37℃烘干1h，保存備用。
3.2制備膠體金墊取玻璃纖維紙，用噴膜機按10μL/cm，將膠體金標記的A型FMDV兔IgG，噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存備用。
3.3試紙條的組裝在PVC背襯板分別將吸取樣品用的樣品吸收墊、固定有膠體金標記A型口蹄疫抗體的膠體金墊，包被檢測帶、質控帶的硝酸纖維素膜以及吸水濾紙制成的吸收墊按由下至上按圖示1裝配，吸水紙和金標墊必須與硝酸纖維素膜膜有交疊0.1cm，而金標墊與樣品墊也應用交疊0.1cm。配件與塑料底板的結合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5mm的條狀，即制成A型FMDV診斷試紙條。
實施例3C型口蹄疫診斷試紙條的制備1、膠體金的制備用檸檬酸三鈉還原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加熱至沸，攪動下準確加入1％檸檬酸三鈉水溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內變為紫紅色，繼續煮沸15min，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制備的膠體金中加入0.02％的NaN3，經一次性滅菌濾器過濾，裝入潔凈的玻璃瓶中備用。工作中所制備的膠體金直徑通過在透射電鏡(TEM像)觀察顆粒大小。測得平均粒徑為30.06±0.7nm，結果如圖2所示。
2、免疫膠體金的制備用0.1mol/L K2CO3調節膠體金溶膠至所需pH為8.5，按100μg/mL膠體金加入C型口蹄疫病毒單克隆抗體，磁力攪拌20min。在膠體金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，繼續攪拌20min，將上述膠體金經4000r/min離心20分鐘去除沉淀物，得上清液；將上清液經12000r/min高速離心1h得到沉淀物，.將沉淀懸浮于1/10初始膠體金體積的含15％蔗糖、1％BSA、1‰PEG20000、1‰Tween-20的PH7.6 0.11mol/L PBS金膠緩沖液中，懸浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型診斷試紙條的制備方法3.1制備含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜用pH7.2 0.02mol/LPBS分別將純化的C型FMDV豚鼠IgG調整至濃度為2.2mg/mL，兔抗鼠IgG濃度為2.0mg/mL。分別按1.8ul/cm設置噴膜，將兩種IgG噴涂于300mm×20mm的NC膜上，形成檢測帶與質控帶，兩線相距8mm，置于含5％犢牛血清1‰Tween-20的PH7.6 0.02mol/LPBS包被液中浸泡15min。取出后37℃烘干1h，保存備用。
3.2制備膠體金墊取玻璃纖維紙，用噴膜機按10μL/cm，將膠體金標記的C型口蹄疫病毒單克隆抗體，噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存備用。
3.3試紙條的組裝在PVC背襯板分別將吸取樣品用的樣品吸收墊、固定有膠體金標記C型口蹄疫抗體的膠體金墊，包被檢測帶、質控帶的硝酸纖維素膜以及吸水濾紙制成的吸收墊按由下至上按圖示1裝配，吸水紙和金標墊必須與硝酸纖維素膜膜有交疊0.1cm，而金標墊與樣品墊也應用交疊0.1cm。配件與塑料底板的結合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5mm的條狀，即制成C型FMDV診斷試紙條。
實施例4Asia I型口蹄疫診斷試紙條的制備1、膠體金的制備用檸檬酸三鈉還原法，取0.01％氯金酸水溶液100mL加熱至沸，攪動下準確加入1％檸檬酸三鈉水溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內變為紫紅色，繼續煮沸15min，冷卻后以蒸餾水恢復到原體積，如此制備的金溶膠其可見光區最高吸收峰在523nm，A1cm/523＝1.188。制備的膠體金中加入0.02％的NaN3，經一次性滅菌濾器過濾，裝入潔凈的玻璃瓶中備用。工作中所制備的膠體金直徑通過在透射電鏡(TEM像)觀察顆粒大小。測得平均粒徑為30.06±0.7nm，結果如圖2所示。
2、免疫膠體金的制備用0.1mol/L K2CO3調節膠體金溶膠至所需pH為8.4，按60μg/mL膠體金加入Asia I型FMDV兔IgG，磁力攪拌20min。在膠體金溶液中按1％加入牛血清白蛋白，繼續攪拌20min，將上述膠體金經3000r/min離心15分鐘去除沉淀物，得上清液；將上清液經11000r/min高速離心1h得到沉淀物，將沉淀懸浮于8/100初始膠體金體積的含10％蔗糖、1％BSA、0.5‰PEG20000、0.5‰Tween-20的PH7.5 0.11mol/LPBS金膠緩沖液中，懸浮溶解，置4℃保存。
3、口蹄疫定型診斷試紙條的制備方法3.1制備含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜用pH7.5 0.02mol/LPBS分別將純化的Asia I型口蹄疫病毒單克隆抗體調整至濃度為1.8mg/mL，羊抗兔IgG濃度為1.5mg/mL。分別按2ul/cm設置噴膜，將兩種IgG噴涂于300mm×20mm的NC膜上，形成檢測帶與質控帶，兩線相距8mm，置于含5％犢牛血清1‰Tween-20的PH7.5 0.02mol/L PBS包被液中浸泡15min。取出后37℃烘干1h，保存備用。
3.2制備膠體金墊取玻璃纖維紙，用噴膜機按15μL/cm，將膠體金標記的Asia I型FMDV兔IgG，噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存備用。
3.3試紙條的組裝在PVC背襯板分別將吸取樣品用的樣品吸收墊、固定有膠體金標記Asia I型口蹄疫抗體的膠體金墊，包被檢測帶、質控帶的硝酸纖維素膜以及吸水濾紙制成的吸收墊按由下至上按圖示1裝配，吸水紙和金標墊必須與硝酸纖維素膜膜有交疊0.1cm，而金標墊與樣品墊也應用交疊0.1cm。配件與塑料底板的結合可用雙面膠或其它粘性材料粘接。裝配好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5mm的條狀，即制成Asia I型FMDV診斷試紙條。
實施例5口蹄疫病毒定型診斷實驗方法1.待檢樣品的處理無菌操作將待檢水皰皮(采取新鮮末破裂、沒有異味的水泡皮)用PH7.5 0.05mol/L PBS緩沖液洗2次，并用消毒濾紙吸去水份稱重，加入玻璃砂研磨，按1∶10(w/v)PH7.5 0.05mol/LPBS緩沖液制成懸液，4℃冰箱內浸毒一夜。振搖后以4000r/min離心10min，取上清液即為待檢樣品。可直接作為待檢樣品。
2.樣品檢測待檢樣品、檢測試紙或其它檢測用材料等均在室溫平衡。沿鋁袋切口部位撕開，取出試紙條。將檢測試紙有標志線的一端插入待檢樣品中，當液體全部浸濕硝酸纖維素膜后，5分鐘內觀察結果。
3.結果判定3.1單支試紙條結果判定陽性質控帶(6)與檢測帶(7)都出現清晰可見紅色條帶。樣品中的口蹄疫病毒含量越高，檢測帶紅色帶顏色越深。見圖示3陰性只有質控帶(6)出現清晰可見紅色條帶。見圖示4可疑質控帶(6)出現一條顏色清晰可見的紅色線，而在檢測帶(7)出現一條顏色很淺，若隱若顯的紅色帶。見圖示5無效質控帶(6)不出現紅色條帶。見圖示6、圖示73.2定型結果判定O型O型試紙條結果為陽性，Asia I、A、C型試紙條結果為陰性或可疑。
Asia I型AsiaI型試紙條結果為陽性，O、A、C型試紙條結果為陰性或可疑。
A型A型試紙條結果為陽性，Asia I、O、C型試紙條結果為陰性或可疑。
C型C型試紙條結果為陽性，Asia I、O、A型試紙條結果為陰性或可疑。
陰性O、Asia I、A、C型試紙條結果均為陰性。
可疑O、Asia I、A、C型試紙條結果均為可疑，或其中三種、兩種試紙條結果為可疑。
注當四種、三種和兩種試紙條對同一待檢抗原顯色結果均為陽性時，可將待檢樣品用含0.5‰Tween-20的PH7.4 0.11MPBS做對倍稀釋，再進行檢測，以同上方法進行結果判定。
實施例6口蹄疫病毒定型診斷實驗方法1、待檢樣品的處理無菌操作將乳鼠組織用PH7.2的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液洗3次，并用消毒濾紙吸去水份稱重，加入玻璃砂研磨，按1∶3w/v加入PH7.2 0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，制成懸液；室溫浸毒2小時。振搖后以4000r/min離心10min，取上清液即為待檢樣品；待檢水皰液可直接作為待檢樣品；2、樣品檢測待檢樣品、檢測試紙或其它檢測用材料等均在室溫平衡，將檢測試紙有標志線的一端插入待檢樣品中，當液體全部浸濕硝酸纖維素膜后，15分鐘內觀察結果；3、結果判定3.1單支試紙條結果判定陽性質控帶(6)與檢測帶(7)都出現清晰可見紅色條帶；陰性只有質控帶(6)出現清晰可見紅色條帶；可疑質控帶(6)出現一條顏色清晰可見的紅色條帶，而在檢測帶(7)出現一條淺色帶；無效質控帶(6)沒有出現紅色條帶；3.2定型結果判定O型O型試紙條結果為陽性，Asia I、A、C型試紙條結果為陰性或可疑；Asia I型Asia I型試紙條結果為陽性，O、A、C型試紙條結果為陰性或可疑。
A型A型試紙條結果為陽性，O、Asia I、C型試紙條結果為陰性或可疑。
C型C型試紙條結果為陽性，O、Asia I、A型試紙條結果為陰性或可疑。
陰性O、Asia I、A、C型試紙條結果均為陰性。
可疑O、Asia I、A、C型試紙條結果均為可疑，或其中三種、兩種試紙條結果為可疑。
當四種、三種和兩種試紙條對同一待檢抗原顯色結果均為陽性時，可將待檢樣品用稀釋液做對倍稀釋，再進行檢測，以c.2進行結果判定；上述稀釋液為含1‰吐溫-20的PH7.6 0.11Mol/L磷酸鹽緩沖液。
權利要求
1一種口蹄疫定型試紙條，由O、A、Asia I、C四種血清型檢測試紙條組成，其特征在于所述檢測試紙條由PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊、樣品墊5部分組成，所述PVC襯板(1)設在最底部，襯板(1)上部中段設有硝酸纖維素膜(2)，硝酸纖維素膜(2)上部左端貼有吸收墊(3)，硝酸纖維素膜(2)上部右端設有金標墊(4)，金標墊(4)的上部右端設有樣品墊(5)。
2.根據權利要求1所述的口蹄疫定型試紙條，其特征在于所述的吸水紙(3)和金標墊(4)與硝酸纖維素膜(2)的銜接處有交疊，金標墊(4)與樣品墊(5)之間也有交疊。
3.根據權利要求1所述的口蹄疫定型試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜(2)上左端噴有抗兔、豚鼠和鼠IgG抗體作為質控帶(6)；硝酸纖維素膜(2)上右端噴有口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體作為檢測帶(7)；金標墊(4)上噴有膠體金標記的口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體。
4.根據權利要求3所述的口蹄疫定型試紙條，其特征在于所述的金標墊(4)上噴有的膠體金標記口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體為兔或豚鼠口蹄疫病毒抗體或口蹄疫病毒單克隆抗體。
5.根據權利要求3所述的口蹄疫定型試紙條，其特征在于所述的檢測帶(7)噴有口蹄疫O、A、C、Asia I型抗體為兔或豚鼠口蹄疫病毒抗體或口蹄疫病毒單克隆抗體。
6.一種制備如權利要求1所述口蹄疫定型試紙條的方法，其特征在于由以下步驟制備而成a、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；b、膠體金標記的O、A、C、Asia I型口蹄疫病毒抗體制備首先將a步制得的膠體金用0.1mol/L K2CO3調整PH值為8.0-8.5；然后用目測法確定膠體金與待標記抗體應標記的最佳量，得到最佳標記量為4-10mg/100mL，在膠體金溶液中按4-10mg/100mL加入口蹄疫病毒抗體，攪拌10～20min；在膠體金溶液中按0.5-1g/100ml加入牛血清白蛋白，繼續攪拌10～20min，將上述膠體金經2000-4000r/min離心10-20分鐘，去除沉淀物，得上清液；將上清液經10000～12000r/min高速離心1h得到沉淀物，將沉淀懸浮于1/20-1/10初始膠體金體積的金膠緩沖液中，懸浮溶解，置4℃保存；c、定型診斷試紙條組裝c.1制備含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜用pH 7.2-7.6 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液分別將抗兔、豚鼠和鼠IgG抗體和O、A、C、Asia I口蹄疫抗體調整至1-2mg/ml和1.4-2.2mg/ml工作濃度，分別按1.8-2ul/cm設置噴膜，將上述兩種抗體噴涂于硝酸纖維素膜上，形成質控帶與檢測帶，37℃烘干或室溫晾干后，置于封閉液中浸泡5-15min，取出后室溫下晾干，保存備用；c.2制備膠體金墊取玻璃纖維紙，按10-20μL/cm將膠體金標記的O、A、C、Asia I口蹄疫抗體分別噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存備用；c.3試紙條的組裝在PVC背襯板(1)由下至上分別將樣品墊(5)、膠體金墊(4)，包括檢測帶(7)、質控帶(6)的硝酸纖維素膜(2)以及吸收墊(3)按順序裝配，剪切成條狀，即制成不同型口蹄疫病毒診斷試紙條，口蹄疫O、A、C、Asia I型四種試紙條作為一個包裝裝入鋁塑袋中即為口蹄疫定型診斷試紙條。
7.根據權利要求6所述的口蹄疫定型試紙條的制備方法，其特征在于所述的金膠緩沖液為含5-15％蔗糖、0.5-1％BSA、0.5-1‰PEG20000、0.5-1‰Tween-20的PH7.4-7.6 0.11mol/L的磷酸鹽緩沖液。
8.根據權利要求6所述的口蹄疫定型試紙條的制備方法，其特征在于所述的封閉液為含2.5-5％犢牛血清，0.5-1‰Tween-20的PH7.4-7.6 0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液。
9.一種使用如權利要求1所述的口蹄疫定型試紙條的方法，其特征在于按以下步驟使用a、待檢樣品的處理無菌操作將待檢水皰皮或乳鼠組織用PH7.2-7.50.02-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液洗2-3次，并用消毒濾紙吸去水份稱重，加入玻璃砂研磨，按1∶3～1∶10w/v加入PH7.2-7.5 0.02-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，制成懸液；室溫浸毒2小時或4℃冰箱內浸毒一夜.振搖后以4000r/min離心10min，取上清液即為待檢樣品；待檢水皰液可直接作為待檢樣品；b、樣品檢測待檢樣品、檢測試紙及其它檢測用材料均在室溫平衡，將檢測試紙有標志線的一端插入待檢樣品中，當液體全部浸濕硝酸纖維素膜后，5-15分鐘內觀察結果；c、結果判定c.1單支試紙條結果判定陽性質控帶(6)與檢測帶(7)都出現清晰可見紅色條帶；陰性只有質控帶(6)出現清晰可見紅色條帶；可疑質控帶(6)出現一條顏色清晰可見的紅色條帶，而在檢測帶(7)出現一條淺色帶；無效質控帶(6)沒有出現紅色條帶；c.2定型結果判定O型O型試紙條結果為陽性，Asia I、A、C型試紙條結果為陰性或可疑；Asia I型Asia I型試紙條結果為陽性，O、A、C型試紙條結果為陰性或可疑。A型A型試紙條結果為陽性，O、Asia I、C型試紙條結果為陰性或可疑。C型C型試紙條結果為陽性，O、Asia I、A型試紙條結果為陰性或可疑。陰性O、Asia I、A、C型試紙條結果均為陰性。可疑O、Asia I、A、C型試紙條結果均為可疑，或其中三種、兩種試紙條結果為可疑。當四種、三種和兩種試紙條對同一待檢抗原顯色結果均為陽性時，可將待檢樣品用稀釋液做對倍稀釋，再進行檢測，以c.2進行結果判定。
10.根據權利要求9所述的口蹄疫定型試紙條的使用方法，其特征在于所述稀釋液為含0.5-1‰吐溫-20的PH7.4-7. 60.11Mol/L磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
一種口蹄疫病毒定型試紙條及其制備和使用方法，由O、A、Asia I、C四種血清型檢測試紙條組成，試紙條由PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊、樣品墊部分組成，所述PVC襯板設在最底部，襯板上部中段設有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上部左端貼有吸收墊，硝酸纖維素膜上部右端設有金標墊，金標墊的上部右端設有樣品墊。本發明還提供這種定型試紙條的制備和使用方法。本發明可確定口蹄疫病毒O、A、Asia I、C型四種血清型，該試紙條操作快速簡便，15min內即可顯示結果，判定直觀容易，結果敏感特異，費用低廉，運輸保存方便，非常適用于基層人員在田間檢測使用。
文檔編號G01N33/544GK1877331SQ20061004314
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月7日 優先權日2006年7月7日
發明者蔣韜, 梁仲, 劉湘濤, 劉在新, 陳涓, 馬軍武 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所