專利名稱：一種雙粒子復合的c-反應蛋白檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學免疫體外診斷領域，具體涉及一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒。
背景技術：
C反應蛋白，1930年Tillet和Francis在急性大葉性肺炎患者血清中發現能在隹丐離子存在時與肺炎球菌C多糖起沉 淀反應而得名，是人類重要的急性期反應蛋白，急性期濃度可升高上千倍，循環中的CRP半衰期為19小時。人類CRP是由肝臟產生，由五個相同的亞基依靠非共價鍵形成的環狀五聚體，這一特征性結構使其歸類于五聚素(一組具有免疫防御特性的鈣結合蛋白)家族。低等動物同樣存在CRP，如在鱟、河蛘等中也發現過，但并不一定起急性期反應蛋白的作用。CRP特征反應是能在鈣離子存在的條件下特異性結合磷酸膽喊基團。膠乳顆粒增強比濁法是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分為兩種。一種是散射比濁檢測法；另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常相似，都是在高分子膠乳微球的表面交聯單克隆抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性能或透光性能。而且，反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性，在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應體系中進行抗原、抗體反應及結果的測定。由于血清CRP的含量分布差異較大從零點幾毫克每升到幾百毫克每升，其測定方法需要較高的靈敏度和特異性。目前，免疫比濁法是最為普遍通用的方法，但是免疫比濁法最高檢測限只能達到8mg/l，線性只能達到150mg/l，在臨床應用上存在著局限性。

發明內容
本發明的目的是提供一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，它采用復合膠乳顆粒包被抗體，靈敏度高，能夠檢測到O. 2mg/l樣本，提高了線性值，同時大大提高了抗體的純度和效價，最大限度避免了非特異反應，使結果準確性有了較大提高。為了解決背景技術所存在的問題，本發明是采用以下技術方案它由Rl試劑、R2試劑及校準品三部分組成，Rl試劑為磷酸鹽緩沖體系，其質量比組成為PH = 7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液30-80mmol/l、聚乙二醇-120mm/l和乙二胺四乙酸二鈉10-20mmol/L;R2試劑為抗體致敏顆粒懸浮液，其組成為復合CRP抗體致敏顆粒，PH=7. 0-7.6的磷酸鹽緩沖液和乙二胺四乙酸二鈉等；校準品為牛血清基質，包括疊氮鈉O. 2-2. 2 %、吐溫-201-10 %、牛血清白蛋白1-3 %，上述的百分比為人血清基質體積用量的百分比。所述的試劑R2中2種復合CRP抗體致敏顆粒，特征為小粒徑膠乳顆粒直徑在40-100nm之間，大粒徑膠乳顆粒直徑在150_190nm之間；
所述的試劑R2抗體包被過程中，大粒徑膠乳與小粒徑膠乳以1/3-1/6的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗體和聚苯乙烯膠乳包被質量比為1/10-6/10。所述的試劑R2的制備方法為將156nm的聚苯乙烯膠乳粒子與61nm的聚苯乙烯膠乳粒子按照I : 5的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗體和混合后的聚苯乙烯膠乳以50 100的質量比混合，緩沖液采用O. 02M的磷酸緩沖液，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體，加入封閉液O. I %脫脂奶粉、O. 2mm的甘氨酸，封閉2小時，離心去上清，用PH7. 4磷酸鹽緩沖液45mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/l,0. 05%脫脂奶粉，O. 9% NaN3稀釋至O. 18%。所述的校準品制備方法為將經過處理的牛血清，加入BAS 0.1%, NaN3 O. 9%得到校準品稀釋液，用重組CRP蛋白溶于制備的類似人血清基質的溶液，制備不同濃度的標準品。
本發明具有以下有益效果它采用復合膠乳顆粒包被抗體，靈敏度高，能夠檢測到O. 2mg/l樣本，提高了線性值，同時大大提高了抗體的純度和效價，最大限度避免了非特異反應，使結果準確性有了較大提高。


圖I為本發明中實施例的結構示意圖。
具體實施例方式本具體實施方式
采取以下技術方案它由Rl試劑、R2試劑及校準品三部分組成，Rl試劑為磷酸鹽緩沖體系，其質量比組成為PH = 7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液30-80mmol/l、聚乙二醇-120mm/l和乙二胺四乙酸二鈉10-20mmol/L ；R2試劑為抗體致敏顆粒懸浮液，其組成為復合CRP抗體致敏顆粒，PH = 7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液和乙二胺四乙酸二鈉等；校準品為牛血清基質，包括疊氮鈉O. 2-2. 2 %、吐溫-201-10%、牛血清白蛋白1-3%，上述的百分比為人血清基質體積用量的百分比。所述的試劑R2中2種復合CRP抗體致敏顆粒，特征為小粒徑膠乳顆粒直徑在40-100nm之間，大粒徑膠乳顆粒直徑在150_190nm之間；所述的試劑R2抗體包被過程中，大粒徑膠乳與小粒徑膠乳以1/3-1/6的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗體和聚苯乙烯膠乳包被質量比為1/10-6/10。所述的試劑R2的制備方法為將156nm的聚苯乙烯膠乳粒子與61nm的聚苯乙烯膠乳粒子按照I : 5的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗體和混合后的聚苯乙烯膠乳以50 100的質量比混合，緩沖液采用O. 02M的磷酸緩沖液，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體，加入封閉液O. I %脫脂奶粉、O. 2mm的甘氨酸，封閉2小時，離心去上清，用PH7. 4磷酸鹽緩沖液45mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/l,0. 05%脫脂奶粉，O. 9% NaN3稀釋至O. 18%。所述的校準品制備方法為將經過處理的牛血清，加入BAS 0.1%, NaN3 O. 9%得到校準品稀釋液，用重組CRP蛋白溶于制備的類似人血清基質的溶液，制備不同濃度的標準品。本具體實施方式
具有以下有益效果它采用復合膠乳顆粒包被抗體，靈敏度高，能夠檢測到O. 2mg/l樣本，提高了線性值，同時大大提高了抗體的純度和效價，最大限度避免了非特異反應，使結果準確性有了較大提高。實施例I :相關性試驗，參照圖I :使用本法發明試劑和對照試劑A公司的CRP膠乳增強型試劑，采用自動7170全自動生化分析儀對85份人血清按各自參數同時進行測定，對測定值進行相關性分析。按照與上述” CRP測定方法”中的參數進行測定，X，Y軸均為測定值(CRP的含量mg/L)。由圖I的結果看出，兩種試劑的相關系為R2 = O. 987，回歸方程為y =O. 983X+4. 096，結果表明本試劑與進口試劑測定病人血清相關性良好，具有很好的特異性
和準確性。
權利要求
1.一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，其特征在于它由Rl試劑、R2試劑及校準品三部分組成，Rl試劑為磷酸鹽緩沖體系，其質量比組成為PH = 7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液 30-80mmol/l、聚乙二醇 -120mm/1 和乙二胺四乙酸二鈉 10-20mmol/L ；R2試劑為抗體致敏顆粒懸浮液，其組成為復合CRP抗體致敏顆粒，PH = 7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液和乙二胺四乙酸二鈉等；校準品為牛血清基質，包括疊氮鈉O. 2-2. 2%、吐溫-201-10%、牛血清白蛋白1_3%，上述的百分比為人血清基質體積用量的百分比。
2.根據權利要求I所述的一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑R2中2種復合CRP抗體致敏顆粒，特征為小粒徑膠乳顆粒直徑在40-100nm之間，大粒徑膠乳顆粒直徑在150-190nm之間。
3.根據權利要求I所述的一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑R2抗體包被過程中，大粒徑膠乳與小粒徑膠乳以1/3-1/6的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗體和聚苯乙烯膠乳包被質量比為1/10-6/10。
4.根據權利要求I所述的一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑R2的制備方法為將156nm的聚苯乙烯膠乳粒子與61nm的聚苯乙烯膠乳粒子按照I 5的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗體和混合后的聚苯乙烯膠乳以50 100的質量比混合，緩沖液采用O. 02M的磷酸緩沖液，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體，加入封閉液O. I %脫脂奶粉、O. 2mm的甘氨酸，封閉2小時，離心去上清，用PH7. 4磷酸鹽緩沖液45mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/l,0. 05%脫脂奶粉，O. 9% NaN3稀釋至 O. 18%。
5.根據權利要求I所述的一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的校準品制備方法為將經過處理的牛血清，加入BAS O. 1%, NaN30.9%得到校準品稀釋液，用重組CRP蛋白溶于制備的類似人血清基質的溶液，制備不同濃度的標準品。
全文摘要
一種雙粒子復合的C-反應蛋白檢測試劑盒，它涉及醫學免疫體外診斷領域，它由R1試劑、R2試劑及校準品三部分組成，R1試劑為磷酸鹽緩沖體系，其質量比組成為pH＝7.0-7.6的磷酸鹽緩沖液30-80mmol/l、聚乙二醇-120mm/l和乙二胺四乙酸二鈉10-20mmol/L；R2試劑為抗體致敏顆粒懸浮液，其組成為復合CRP抗體致敏顆粒，pH＝7.0-7.6的磷酸鹽緩沖液和乙二胺四乙酸二鈉等；校準品為牛血清基質，包括疊氮鈉0.2-2.2％、吐溫-20 1-10％、牛血清白蛋白1-3％，它采用復合膠乳顆粒包被抗體，靈敏度高，能夠檢測到0.2mg/l樣本，提高了線性值。
文檔編號G01N33/536GK102809654SQ20121030277
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月23日 優先權日2012年8月23日
發明者房君江, 李偉奇, 張秀文, 林清玉 申請人:上海睿康生物科技有限公司