專利名稱：：測定土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷有效成分的方法
技術領域：
：本發明涉及藥物分析方法領域，具體地說是測定土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷有效成分的方法。
背景技術：
：土茯苓為百合科植物光葉菝葜(SmilaxglabraRoxb.)的干燥根莖；具有除濕，解毒，通利關節。用于濕熱淋濁、帶下、癰腫、瘰疬、疥癬、梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛。由于在采收、流通、臨床應用等環節不太注重品種的鑒別，因此在土茯苓生產經營中品種比較混亂。例如Smilax屬菝葜S.chinaL.為混淆品。黑果菝葜S.glauco-chinaWarb.在四川南川作紅土苓，江蘇鎮江稱"鮮土苓"，為地方習用品。白土苓為同科肖菝葜屬(Heterosmilax屬)植物華肖菝葜H.chi體sisWang、短柱肖菝葜H.yu皿anensisGagnep.及肖菝葜H.j即onicaK皿th.的根莖。前兩種為白土苓的主流種，在四川、湖北、河北、山東、新疆、寧夏、浙江等地分布及使用。CN1772170A公開了"土茯苓總苷提取物及其制備方法和用途"，具體是用土茯苓藥材經乙醇水溶液提取，用乙酸乙酯純化的方法得到土茯苓總苷。土茯苓總苷為土茯苓藥材經過提取、純化的具有活性成分的一類物質的總稱，用于治療各種炎癥和免疫性疾病。對于土茯苓總苷的質量控制，目前還未見文獻報道。中藥提取物為多組分的復雜體系，因此評價其質量應采用與之相適應的，能提供豐富鑒別信息的檢測方法。中藥指紋圖譜技術已成為公認的控制中藥質量的有效手段之一。因此建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥材提取物中所含化學成分，進而對其質量進行整體描述和評價。
發明內容本發明的目的是建立土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷的標準指紋圖譜，并用此方法來測定土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷中的有效化學成分，作為土茯苓總苷的質量控制及真偽鑒別的指標之一。本發明的技術方案是采用高效液相色譜法建立以落新婦苷色譜峰為內參比峰為特征峰的標準指紋圖譜，具體是采取如下方法(a)供試品溶液的制備精密稱取土茯苓乙醇水溶液提取物(簡稱土茯苓總苷，以下同)的干粉lg，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再稀釋至刻度，搖勻，得土茯苓總苷供試品溶液；(b)對照品溶液的制備取落新婦苷對照品，用甲醇溶解配成每lmL含O.lmg落新婦苷的溶液；(c)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相由A相為甲醇，B相為0.3%(V/V)的乙酸水溶液組成的梯度洗脫液；流速為0.8mL/min;檢測波長325士2nm;柱溫為30±5°C;理論塔板數以落新婦苷峰計算，不低于3000;(d)測定分別吸取落新婦苷對照品溶液及供試品溶液5iiL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。按照本發明所提供的方法測定土茯苓總苷，以落新婦苷的色譜峰為內參比峰，其保留時間為l，計算相對保留時間，得土茯苓總苷的標準指紋圖譜至少有io個特征共有峰。1號峰平均相對保留時間(簡稱RT，以下同)0.580，相對標準偏差(簡稱RSD，以下同)為O.13%2號峰RT為0.651，RSD為0.12%3號峰RT為0.666，RSD為0.13%4號峰RT為0.730，RSD為0.13%5號峰RT為0.833，RSD為0.08%6號峰RT為0.964，RSD為0.06%7號峰RT為l，此峰為內參比峰8號峰RT為1.085，RSD為0.30%9號峰RT為1.116，RSD為0.05%10號峰RT為1.164，RSD為0.06%。本發明的優點如下1)以土茯苓總苷建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著土茯苓總苷中有主要藥理活性的有效成分，能表征土茯苓總苷的質量。2)以土茯苓總苷整個指紋圖譜作為一個整體來評判，避免了因只測定一、二個化學成分而判定土茯苓總苷整體質量的片面性。3)本發明具有方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易于掌握的特點。下面結合實施例和附圖進一步闡述本發明的技術方案圖1落新婦苷的HPLC圖譜圖2土茯苓總苷標準指紋圖譜圖3十批次土茯苓總苷指紋圖譜的組合圖下面結合具體實施例和附圖進一步闡述本發明的技術方案。具體實施方案實施例1土茯苓總苷的制備按CN1772170A所公開的文獻中實施例2的方法。共制備了十批土茯苓總苷。批號分別是S1批、S2批、S3批、S4批、S5批、S6批、S7批、S8批、S9批、S10批。實施例2高效液相色譜法測定土茯苓總苷中有效化學成分，建立以落新婦苷色譜峰為內參比峰的標準指紋圖譜1儀器與試藥1.1儀器1.2高效液相色譜儀AgilentllOO高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器。1.3試藥對照品落新婦苷，自制，無色針狀結晶，mpl82-186t:，薄層圖譜上為一個單一斑點，HPLC檢測為單峰，面積歸一化法測定含量大于99%。甲醇為色譜純，，其他所用試劑均為分析純。2方法與結果色譜條件色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，型號為LichrospherC-18(4.6mmX250mm，5iim);流動相A相為甲醇，B相為0.3%(V/V)的乙酸溶液組成液梯度洗脫，洗脫條件見表1;流速0.8mLmin—1;檢測波長325士2nm;檢測時間105min;柱溫30士5t:;進樣量5yL。理論塔板數以落新婦苷峰計算，應不低于3000。表1指紋圖譜梯度洗脫條件時間(min)A%B%0595403070503070559570951054060110卯101151000注表中A相為甲醇，B相為O.3%的乙酸溶液。對照品溶液的制備取落新婦苷對照品適量，用流動相稀釋，制成制成0.10mg/mL對照品溶液。內參比峰選用落新婦苷色譜峰為內參比峰。供試品溶液制備分別精密稱取取土茯苓總苷SI批、S2批、S3批、S4批、S5批、S6批、S7批、S8批、S9批、S10批lg，置25mL的容量瓶中，加入甲醇溶解，再稀釋至刻度，搖勻，濾過，得土茯苓總苷供試品溶液；測定分別吸取落新婦苷對照品溶液及供試品溶液5L，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖，落新婦苷對照品溶液的色譜圖見附圖1;建立的標準指紋圖譜見附圖2。實施例3測定IO批土茯苓總苷的指紋圖譜，確定土茯苓總苷的特征共有峰試驗方法同實施例2。結果如圖3所示。以落新婦苷的色譜峰為內參比峰，其保留時間為1計算相對保留時間。通過對10批土茯苓總苷指紋圖譜測定，比較其色譜圖，根據國家藥品監督管理局頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》相關原則，確定共有峰為10個。10批總苷共有峰相對保留時間統計結果見表2。從表2的結果看，10個共有峰的相對保留時間RSD均小于3%，比較穩定。通過對10批土茯苓總苷指紋圖譜測定，比較其色譜圖，確定共有峰為IO個1號峰RT為0.580，RSD為0.13%2號峰RT為0.651，RSD為0.12%3號峰RT為0.666，RSD為0.13%4號峰RT為0.730，RSD為0.13%5號峰RT為0.833，RSD為0.08%6號峰RT為0.964，RSD為0.06%7號峰RT為1，此峰為內參比峰8號峰RT為1.085，RSD為0.30%9號峰RT為1.116，RSD為0.05%10號峰RT為1.164，RSD為0.06%。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>總苷批號相似度SI0.989S20.975S30.968S40.981S50.958S60.937S70.991S80.945S90.937S100.971實施例4本發明的方法的精密度試驗以土茯苓總苷SI批為供試品，取同一份供試品溶液，在上述色譜條件下重復進樣6次，記錄各特征峰的保留時間和峰面積，以落新婦苷為參照，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD不大于0.5%，相對峰面積的RSD不大于1.0%。結果見表4、表5。表4精密度試驗共有峰相對保留時間統計<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>明，各共有峰相對保留時間的RSD不大于1.5X，相對峰面積的RSD不大于2.5%，說明供試品溶液在24h內穩定。結果見表8、表9。表8穩定性試驗共有峰相對保留時間統計<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上試驗顯示，該方法穩定可靠，符合方法學驗證的要求。權利要求一種測定土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷有效成分的方法，其特征是采用高效液相色譜法建立以落新婦苷色譜峰為內參比峰為特征峰的標準指紋圖譜，具體是采取如下方法(a)供試品溶液的制備精密稱取土茯苓總苷的干粉1g，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再稀釋至刻度，搖勻，得土茯苓總苷供試品溶液。(b)對照品溶液的制備取落新婦苷對照品，用甲醇溶解配成每1mL含0.1mg落新婦苷的溶液，作為對照品溶液；(c)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相A相為甲醇，B相為0.3％的乙酸水溶液組成的梯度洗脫；流速為0.8mL/min；檢測波長325±1nm；柱溫為35℃；理論塔板數以落新婦苷峰計算，不低于3000；(d)測定分別吸取落新婦苷對照品溶液及供試品溶液5μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。2.如權利要求1所述的測定土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷有效成分的方法，其特征在于，所說的以落新婦苷色譜峰為內參比峰為特征峰的標準指紋圖譜，至少有10個特征共有峰1號峰RT為0.580，RSD為0.13%2號峰RT為0.651，RSD為0.12%3號峰RT為0.666，RSD為0.13%4號峰RT為0.730，RSD為0.13%5號峰RT為0.833，RSD為0.08%6號峰RT為0.964，RSD為0.06%7號峰RT為l，此峰為內參比峰8號峰RT為1.085，RSD為0.30%9號峰RT為1.116，RSD為0.05%10號峰RT為1.164，RSD為0.06%。全文摘要測定土茯苓乙醇水溶液提取物中的總苷有效成分的方法，涉及藥物分析方法領域。是采用高效液相色譜法建立以落新婦苷色譜峰為內參比峰為特征峰的標準指紋圖譜，具體是(a)取土茯苓總苷的干粉1g，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，稀釋至刻度，得供試品溶液；(b)取落新婦苷，用甲醇溶解配成每1mL含0.1mg落新婦苷的對照品溶液；(c)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相A相為甲醇，B相為0.3％乙酸水溶液組成的梯度洗脫；流速為0.8mL/min；檢測波長325±2nm；柱溫為30±5℃；理論塔板數以落新婦苷峰計算，不低于3000；(d)測定。本發明具有方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易于掌握，能表征土茯苓總苷的質量。文檔編號G01N30/36GK101732540SQ20091019438公開日2010年6月16日申請日期2009年12月4日優先權日2009年12月4日發明者嚴志標,周翔,彭紅英,徐強,曾利杰,陸頌規,陳婷申請人:廣州敬修堂(藥業)股份有限公司