專利名稱：：一種含龍血竭提取物的藥物制劑的質量控制方法
技術領域：
：本發明屬于中藥分析領域，涉及一種含中藥材提取物藥物制劑的質量控制方法，特別涉及一種含龍血竭藥材提取物的藥物制劑的質量控制方法。
背景技術：
：龍血竭為百合科劍葉龍血樹Dranaenacochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材經提取得到的樹脂。主產于廣西、云南。據《本草綱目》記載，性溫、平，味甘、咸，無毒，入血分，歸肺、脾、腎三經，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅散結、生肌斂瘡等顯著功效。現代醫學研究證實，龍血竭具有改善機體微循環、調整機體新陳代謝、改善機體免疫功能等作用。含龍血竭藥材提取物的藥物制劑(以下簡稱"龍血通藥物制劑")的處方為龍血竭提取物300g，制備方法為取淀粉加沸水攪拌制成20%淀粉漿，將淀粉漿加入龍血竭提取物中，制成顆粒，干燥，裝入膠囊或壓片或制丸，制成1000粒(片)，即得；本品每粒(片)裝0.33g。本品為紅棕色至紅褐色顆粒；氣微，味淡。龍血通藥物制劑具有活血化瘀，通脈舒絡的功效，用于中風血瘀證，證見半身不遂，口舌歪斜，言語謇澀或不語，偏身麻木，頭暈目眩，舌質紫黯或有瘀點瘀斑，苔薄白或白膩，脈弦或澀；本品口服，一次2粒，一日3次。本發明的申請人于2002年9月12日申請了名稱為一種龍血竭總黃酮制劑的制備方法及其質量控制方法的專利，專利申請號為02129687.l，此件專利提供了龍血竭總黃酮制劑的質量控制方法，包括對龍血素B進行薄層鑒別，采用分光光度法對龍血素B和7，4'_二羥基黃酮進行含量測定，采用高效液相色譜法對7，4'-二羥基黃酮進行含量測定，這些方法可以對龍血通藥物制劑進行質量控制，但是檢測的項目較少，而且薄層鑒別和分光光度法的準確度不夠好，本發明在原有技術的基礎上增加了對總酚的含量測定，增加了采用較為準確的高效液相色譜法對龍血素B進行含量測定的方法，不僅如此，本發明還提供了一種龍血通藥物制劑溶出度的測定方法，此外，本發明還提供了龍血通藥物制劑的標準指紋圖譜與該圖譜的應用方法，可以更加有效地控制龍血通藥物制劑的質量。
發明內容本發明的目的是提供一種對龍血通藥物制劑中總酚和龍血素B兩種指標成分進行含量測定的方法。本發明的目的還在于提供了龍血通藥物制劑的標準指紋圖譜，并提供了該圖譜的應用方法。本發明的目的還在于提供了龍血通藥物制劑的溶出度測定方法。上述的龍血通藥物制劑，其特征在于藥物劑型為包括但不僅限于膠囊劑、片劑、丸劑、軟膠囊的常規藥物制劑。本發明的目的是通過下列方式實現的—種含有龍血竭藥材提取物的藥物制劑(龍血通藥物制劑)的質量控制方法，可以采用以下方法中的任意一種或幾種(1)采用紫外-可見分光光度法檢測，藥物制劑每單位劑量含總酚以7，4'_二羥基黃酮計，不得低于165.0mg;(2)采用高效液相色譜法檢測，藥物制劑每單位劑量含龍血素B不得低于1.50mg;(3)采用高效液相色譜指紋圖譜檢測，藥物制劑的標準指紋圖譜有8個共有峰，各共有峰的相對保留時間分別為l號峰O.400.60，2號峰0.420.65，3號峰0.550.78，4號峰0.600.85，5號峰0.700.95，6號峰0.821.15，S號峰1.00，7號峰1.011.30，其中S號峰為龍血素B的色譜峰；(4)采用高效液相色譜法，結合溶出度測定法檢測，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B計，不得少于75X。所述龍血通藥物制劑中總酚的含量測定方法為a.對照品溶液的制備取7，4'_二羥基黃酮，加無水乙醇制成對照品溶液；b.標準曲線的制備量取不同劑量的對照品溶液，加無水乙醇，加十二烷基磺酸鈉溶液，鐵氰化鉀溶液，三氯化鐵溶液，搖勻，再加鹽酸稀釋；照紫外_可見分光光度法，測定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.供試品溶液制備與測定法取本品，加無水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，揮干乙醇，裝入層析柱，用1030%的乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇洗脫，收集洗脫液；量取該溶液置棕色量瓶中，加無水乙醇，量取該溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸鈉溶液，鐵氰化鉀溶液，三氯化鐵溶液，再加鹽酸，搖勻，得供試品溶液；照紫外_可見分光光度法，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得。上述總酚的含量測定方法的優選為a.對照品溶液的制備取7，4'-二羥基黃酮適量，加無水乙醇制成1!111中含2040iig的溶液，即得;b.標準曲線的制備量取對照品溶液Oml，1.Oml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.Oml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸鈉溶液2ml，鐵氰化鉀溶液lml，三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置，以第一份為空白；照紫外_可見分光光度法，在750800nm處測定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.供試品溶液制備與測定法取本品，研細，約取515mg，置25ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取聚酰胺13g，置蒸發皿中，加入上述溶液10ml，拌勻，置熱水浴上揮干乙醇，裝入層析柱，用1030%的乙醇4060ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇80120ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，量取該溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸鈉溶液2ml，鐵氰化鉀溶液lml，三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置，得供試品溶液；照紫外-可見分光光度法，在750800nm處測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得。上述總酚含量測定方法的優選為a.對照品溶液的制備取7，4'_二羥基黃酮適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加無水乙醇制成每1ml中含32g的溶液，即得；b.標準曲線的制備精密量取對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液1ml，0.9%三氯化鐵溶液1ml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，以第一份為空白；照中國藥典2005年版一部附錄VB的紫外-可見分光光度法，在780nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.供試品溶液制備與測定法取本品12mg，精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取80100目的聚酰胺2g，置蒸發皿中，精密加入上述溶液10ml，拌勻，置7(TC水浴上揮干乙醇，裝入內徑為1.5cm層析柱，用20X的乙醇50ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇100ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，精密量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，即得供試品溶液；照紫外_可見分光光度法，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得；d.測定結果本品每單位劑量含總酚以7，4'-二羥基黃酮計，不得低于165.Omg。所述龍血素B的含量測定方法為采用高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈_1%冰醋酸水溶液為流動相；b.對照品溶液的制備稱取龍血素B對照品，加甲醇制成對照品溶液；c.供試品溶液的制備取本品，研細，稱定，置燒瓶中，加乙醚，加熱回流，濾過，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解，搖勻，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀釋，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。上述龍血素B的含量測定方法的優選為高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例為3050:5070為流動相，流速0.51.5ml/min，檢測波長為250300nm;b.對照品溶液的制備稱取干燥的龍血素B對照品適量，加甲醇制成lml含40iig的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制備取本品，研細，取約O.10.3g，稱定，置燒瓶中，加乙醚，置水浴鍋表面，加熱回流，濾過，用乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各520ii1，注入液相色譜儀，測定，即得。9上述龍血素B的含量測定方法的優選為照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例為40:60為流動相，流速1.0ml/min，檢測波長為278nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.對照品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B對照品適量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制備取本品O.2g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴鍋表面，加熱回流30分鐘，濾過，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10iU，注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果本品每單位劑量含龍血素B不得低于1.50mg。所述龍血通藥物制劑指紋圖譜測定方法為采用高效液相色譜法測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為A:0.1X的磷酸與B:乙腈，梯度洗脫；b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品，加甲醇制成參照物溶液；c.供試品溶液的制備取本品，研細，加入甲醇，超聲處理，濾過，取續濾液，濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測定，即得。上述龍血通藥物制劑指紋圖譜測定方法的優選為采用高效液相色譜法測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為A:0.1X的磷酸與B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70X線性下降至20%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.41.Oml/min，檢測波長為250300nm;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成lml含50iig的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取本品內容物，研細，取約0.30.8g，置錐形瓶中，加入甲醇，超聲處理，濾過，取續濾液用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各520ii1，分別注入液相色譜儀，測定，即得；上述龍血通藥物制劑指紋圖譜測定方法的優選為參照中國藥典2005版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合指紋圖譜的要求進行a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為A:0.1X的磷酸與B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70X線性下降至1020%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.7ml/min，檢測波長為280nm，理論板數按參照物龍血素B峰計算，不低于6000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每lml含50iig的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取本品內容物，研細，取約0.5g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超聲處理30min，濾過，取續濾液用0.45ym的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10iU，分別注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜經計算軟件計算，相似度應大于0.80。所述溶出度測定方法為采用高效液相色譜法，結合溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇_0.1%磷酸水溶液為流動相；b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成參照物溶液，c.供試品溶液的制備取本品，以十二烷基硫酸鈉與氫氧化鈉溶液為溶劑，旋轉使溶出，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。上述溶出度測定方法的優選為參照高效液相色譜法，結合溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例為5055:4550為流動相；檢測波長為275280nm;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含1020iig的溶液；c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘6585轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液520ia，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。上述溶出度測定方法的優選為參照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例為53:47為流動相；檢測波長為278nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含15iig的溶液，c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘75轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液10ii1，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；e.測定結果按外標法以峰面積計算每單位劑量的溶出量，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B計，不得少于75%。對上述質量控制方法的研究與說明—、對總酚含量測定的研究說明1、系統適應性研究(1)儀器與試藥高效液相色譜儀，紫外檢測儀，記錄儀，柱箱，7，4'-二羥基黃酮對照品，純度為98.23%，水為超純水，其余試劑均為分析純；(2)測定方法的選擇根據化學成分研究結果，采用三氯化鐵_鐵氰化鉀顯色法測定總酚類化合物的含量；(3)對照品的選擇經研究，選擇7，4'-二羥基黃酮作為本品含量測定的對照PR(4)供試品制備方法與測定方法經研究，確定供試品制備方法為取本品12mg，精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取80100目的聚酰胺2g，置蒸發皿中，精密加入上述溶液10ml，拌勻，置7(TC水浴上揮干乙醇，裝入內徑為1.5cm層析柱，用20%的乙醇50ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇100ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，精密量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，即得供試品溶液；本發明中0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液的配置方法為取0.3g十二烷基磺酸鈉，置100ml容量瓶中，加50%乙醇溶液微熱使溶解，放冷，加50%乙醇溶液定容至刻度，即得。2、7，4'-二羥基黃酮線性關系和回歸方程(1)對照品溶液的制備精密稱取7，4'-二羥基黃酮10mg，置25ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2ml，置25ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每lml中含7，4'_二羥基黃酮321^);(2)標準曲線的制備精密量取對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，以第一份為空白；照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VB)，在780nm處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；測定結果見表l，標準曲線見附圖l;回歸方程:y=0.0995x+0.079其中x為濃度(iig/ml)，y為吸收度，相關系數r=0.9996。表17，4'-二羥基黃酮標準曲線12標準品濃度0ig/ml)1.4282.8564.2845.7127.140吸收度A0.1550.3020.4530.5890.7223、精密度試驗取龍血通藥物制劑，按供試品制備方法制備成供試品溶液，在6分鐘內，連續測定6次，結果見表2，結果表明精密度良好。表2精密度試驗結果序號123456RSD%吸收度A0.2800.2810.2810.2800.2820.2820.324、穩定性試驗取龍血通藥物制劑，按供試品制備方法制備成供試品溶液，分別在不同時間測定其吸收度，結果見表3，表明供試品溶液在06分鐘吸收度保持相對穩定。表3樣品穩定性考察數據測定時間(min)0123456RSD(%)吸收度A0.2800.2800.2810.2820.2820.2830.2840.53測定時間(min)78910203040RSD(%)吸收度A0.2860.2870.2900.2920.3000.3100.3103.605、重復性試驗取龍血通藥物制劑，按供試品制備方法制備成供試品溶液，測定，結果見表4，結果表明樣品測定重現性好。表4重復性試驗序號123456平均RSD%稱樣量(mg)12.2012.0612.1512.2212.2112.09--吸收度A0.2850.2760.2800.2880.2890.277--總酚量(mg/粒)226.91221.81223.58229.08230.12222.12225.601.606、加樣回收試驗取同一批號已知含量的龍血通藥物制劑(含量為225.6mg/粒)6份，每份約6mg，精密稱定，置25ml棕色容量瓶中，分別加入7，4'-二羥基黃酮對照品5!1^，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，按樣品測定方法測定，計算總酚的含量和加樣回收率，結果見表5，表明本方法準確性高。表5加樣回收試驗結果序號取樣量總酚含量加對照品實測量加樣回收率平均加樣RSD(g)(mg)量(mg)(mg)(%)回收率(％)(o/o)16.064.145.019.0197.1526.124.185.12'9.1897.5836.014.115.039.0698.4445.984.094.968.8596.0197.511.445.994.094.979.0599.7066.234.264.969.0396.19137、十批樣品含量測定取本品十批進行含量測定，測定結果見表6。表6十批樣品含量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>限度確定根據龍血通藥物制劑10批20個數據的含測結果，規定本品按干燥品計算，含龍血素B不得少于165.Omg/粒(片)。二、龍血素B含量測定方法的研究與說明1、系統適應性研究(l)儀器與試藥高效液相色譜儀，紫外檢測器；龍血素B對照品，供含量測定用；乙腈(色譜純)，水(超純水)；(2)色譜條件①流動相的選擇經研究，選擇乙腈-l^HAC比例為40:60系統作為流動相；②測定波長的選擇經研究，將測定波長定為278nm;③柱溫30。C;④系統適用性研究經研究，在系統實驗中龍血素B的理論塔板數不得低于4000。2、供試品溶液、對照品溶液的制備和陰性供試液的制備(1)供試品溶液的制備經研究，確定供試品制備方法為精密稱取龍血通藥物制劑內容物O.lg，置50ml圓底燒瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴鍋表面，加熱回流30分鐘，濾過，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得；(2)對照品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B對照品適量，加甲醇制成每lml含40iiiig的溶液，作為對照品溶液；(3)陰性供試液的制備取陰性樣品(除主藥外的輔料制得的樣品)，參照供試液制備方法，制成陰性供試液。3、方法學考察[one](1)線性關系考察標準品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B16.78mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液儲備液；分別吸取對照品溶液0.5，1，2，4，6，8ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；分別進樣10iU，以進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，見表7和附圖2;線性關系和回歸方程回歸方程為Y=28388X-11375;r=1;線性范圍為8.39134.24iig/ml。表7龍血素B標準曲線實驗數據進樣濃度((ig/ml)8.3916.7833.5667.12100.68134.24峰面積積分值(Y)2935168.51896925.52853442.56221773(2)精密度試驗取C=86.72ug/ml的標準品，連續進樣6次測定峰面積，結果見表8，結果表明精密度較好。表8精密度試驗結果序號123456峰面積6839998140RSD%2.24[OH6](3)穩定性試驗取樣品，分別在配置后0、1、2、4、8、12小時測定，結果見表9，表明供試品在12小時內穩定。表9穩定性考察數據:0149]測定時間(h)0124812濃度(ug/ml)18.87319.27419.46919.34019.39919.402RSD%1.12[O巧O](4)重復性試驗精密稱取同一批號樣品5份，測定，每次進樣101，結果見表10，結果表明方法重復性較好。表IO重復性試驗結果:0153]序號12345稱樣量(g)0.206640.201280.206950.205400.20568含量(mg/g)4.624.924.814.844.73平均含量(mg/g)4.78RSD%2.39(5)加樣回收試驗精密稱取樣品(龍血素B含量為4.78mg/g)5份，每份0.lg，分別加入濃度為0.1678mg/ml的龍血素B對照品溶液2ml，按照供試品溶液制備方法制備，測定，計算回收率，結果見表ll，平均回收率為99.95%。表ll加樣回收試驗結果15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(6)樣品含量測定及含量取十批本品，按說明書中含量測定項下龍血素B的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進行十批成品中龍血素B的含量測定，結果見下表12。表12龍血通藥物制劑中龍血素B含量測定<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>限度確定根據龍血通藥物制劑10批20個數據的含測結果，規定本品按干燥品計算，含龍血素B不得少于1.50mg/粒(片)。三、指紋圖譜測定方法的研究與說明1、概述龍血通藥物制劑由龍血竭單味藥材組成，具有活血化瘀，通脈舒絡的功效，用于血瘀引起的中風。為了更全面、有效的控制龍血通藥物制劑的質量，提高中藥口服制劑的質量控制水平，讓臨床用藥安全及療效更加有所保證，發明人參照中藥注射劑指紋圖譜的要求，對龍血通藥物制劑指紋圖譜進行了研究，經過對供試品制備方法的考察及測定指紋圖譜的儀器，色譜柱、流動相、檢測波長等條件進行系統的優選，建立了指紋圖譜測定條件并進行了方法學考察。在對多批龍血通藥物制劑指紋圖譜檢測結果的基礎上，逐漸積累數據，提出了龍血通藥物制劑的指紋圖譜標準草案，作為本品指紋圖譜標準，從而達到能夠更全面、有效地控制藥物制劑質量的目的。對所測得的指紋圖譜的辨認，發明人采用國家藥典委員會提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，經多次試驗研究，且通過與計算相對保留時間及相對保留峰面積的方法相比較，所得出的評價結論基本一致，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統評價指紋圖譜的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度結果，對制劑指紋圖譜進行評價，結論較為客觀、準確。所以發明人采用該軟件做為龍血通藥物制劑指紋圖譜相似度計算軟件。2、指紋圖譜標準研究說明(1)參照物溶液的制備根據對龍血通藥物制劑成分的分析，選擇龍血素B作為參照物；[OWO](2)供試品溶液的制備經研究，最終確定龍血通藥物制劑指紋圖譜測定供試品的制備方法為取裝量差異項下的龍血通藥物制劑內容物，混勻，研細，取約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加50%甲醇25ml，超聲(250W、40KHz)30min，過濾，取續濾液做為供試品溶液，即得。(3)檢測方法①儀器和試劑儀器高效液相色譜儀，多波長紫外_可見檢測器，全自動進樣器，色譜工作站，色譜柱，流動相為A:0.1X的磷酸和B:甲醇，梯度洗脫，洗脫順序為時間(min)A%(0.1%磷酸)B%(乙腈)07030502080602080流速為0.7ml/min;檢測波長為280nm;論板數按參照物(龍血素B)峰計算，應不低于6000;試劑甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。②色譜柱經試驗考察，發現WatersXterraC188色譜柱對制劑中各成分分離效果最好，因此選擇用該類型色譜柱作為龍血通藥物制劑指紋圖譜測定專用色譜柱。③測定波長發明人檢測了五個波長下的指紋圖譜，經比較分析，確定280nm為指紋圖譜的檢測波長，在該波長下的指紋圖譜中，除已知成分龍血素B能夠較好的檢測出外，其它成分指紋峰也能被較好地體現，且各峰分離度好，基線較平穩、重復性好；(4)穩定性試驗取龍血通藥物制劑成品，按上述供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，每隔3小時測定一次其指紋圖譜，共測6次，結果見表13，以0小時進樣所得指紋圖譜為對照計算相似度，相似度結果均不小于O.99，表明供試品溶液15小時內成分是穩定的，符合指紋圖譜的技術要求。表13穩定性分析結果(參照文件名為龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep)時間數據文件相似度(參照)相似度(對照)對照圖譜龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep1.0000.9570小時SIGNAL01.cdf0.9340.9973小時SIGNAL01.cdf0.9340.9976小時SIGNAL01.cdf0.9340.99717<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(5)精密度試驗取龍血通藥物制劑，按本發明中供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，連續進樣6次進行測定；測定結果見表14、15、16;結果表明，供試品溶液中各共有峰的保留時間及主要峰(占總峰面積5%以上)的峰面積基本一致(RSD<3%)，又以第1次進樣所得指紋圖譜做為對照計算后5次進樣所得指紋圖譜的相似度，結果相似度結果均不小于0.99，均符合指紋圖譜的技術要求，表明該方法精密度良好。表14精密度考察結果(占總峰面積5%以上主要峰的保留時間)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表15精密度考察結果(占總峰面積5%以上的主要峰的峰面積)123456averRSD%AAAAAAAAs3593.4483580.9963605.3173578.0553593.4483600.0723591.8890.30i1307.4961291.5371288.7881290.7921307.4961314.4791300.0980.8521707.9291673.7191693.9461689.4941707.9291715.2521698.045O.卯33106.2173065.9643093.7513078.1773106.2173115.0333094.2270.6141489.0401467.2301480.9351475.6811489.0401494.7501482.7790.6952143.1272139.5122150.7312134.2982143.1272137.9522141.4580.2662931.2372895.2672921.5602910.9432931.2382933.9202920.6940.52,74265.5164237.7154265.8734242.8684265.5194278.9824259.4120.37表16精密度分析結果(參照文件名為龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep)次數數據文件相似度(參照)相似度(對照)對照圖譜龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep1.0000.9571SIGNAL01.cdf0.9330.9972SIGNAL01.cdf0.9330.9973SIGNAL01.cdf0.9330.9974SIGNAL01.cdf0.9330.9975SIGNAL01.cdf0.9330.9976SIGNAL01.cdf0.9330.997(6)重復性試驗取龍血通藥物制劑，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，同法制備供試品溶液5份，依法測定，結果見表17，計算相似度，相似度結果均不小于0.95，符合指紋圖譜的技術要求。表17重復性分析結果(參照文件名為龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep)次數數據文件相似度(參照)相似度(對照)對照圖譜龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep1.0000.9591SIGNAL01.cdf0.9310.99619<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>根據以上方法學考察結果，表明該方法測定龍血通藥物制劑的指紋圖譜，精密度、重復性、穩定性均較好，能夠準確測定該制劑的指紋圖譜。(7)十批大生產成品的測定及標準指紋圖譜的獲得取十批成品，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，依法測定，結果見表18，結果計算相似度，用相似度軟件中以這十批供試品指紋圖譜為基礎獲得"共有模式"作為標準指紋圖譜，見附圖3，并規定龍血通藥物制劑指紋圖譜與對照指紋圖譜經相似度軟件計算，相似度應大于O.80。表18十批分析結果(參照文件名為龍血通藥物制劑對照圖譜.Sep)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>四、溶出度測定方法的研究說明1、溶出度測定指標成分的選擇龍血通藥物制劑所含成分類別較多，難以考察所有成分的溶出情況，為了建立溶出度測定方法，更好地控制產品質量，選擇其中的一個成分作為指標性成分，進行溶出度考察，經研究，選擇龍血素B作為溶出度測定的指標性成分。2、溶出介質的選擇經考察本品在不同溶出介質中的溶出量，分別采用40%乙醇溶液、不同濃度氫氧化鈉溶液、0.1%十二烷基硫酸鈉的氫氧化鈉溶液作為溶出介質，以龍血素B含量為指標性成分，進行溶出量測定；結果表明，在O.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液中溶出最好，故確定溶出介質為0.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液。3、溶出介質體積的選擇經研究，選擇溶出介質體積為100ml，以滿足高效液相色譜儀的檢測限。4、轉速的選擇在固定溶出介質和溶出介質體積的條件下，比較50r/min、75r/min、100r/min對龍血通藥物制劑中龍血素B溶出量的影響。取本品，照溶出度測定法(中國藥典2005年版二部附錄XC第三法)，以0.1%十二烷基硫酸鈉的O.025mol/L氫氧化鈉溶液100ml為溶出介質，轉速分別為每分鐘50轉、75轉和100轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定，結果見表19。表19轉速對溶出量的影響轉速50r/min75r/min100r/min平均溶出量78.64%96.75%97.43%結果表明在相同的時間點轉速對溶出量有一定影響，75r/min時溶出已能較好溶出，故選擇轉速為75r/min。5、溶出度測定方法的驗證(1)系統適應性研究①儀器與試藥高效液相色譜儀，紫外檢測器，龍血素B對照品，甲醇(色譜純)，水(超純水)。②色譜條件流動相的選擇經研究，選擇甲醇-0.1%磷酸比例為53:47系統作為流動相；測定波長的選擇經研究，將測定波長定為278nm;柱溫30。C;系統適用性研究為確保定量分析的準確，經研究，在系統實驗中龍血素B的理論塔板數不得低于10000。(2)驗證試驗①線性關系考察標準品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B5.04mg置100ml量21瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液儲備液；分別吸取對照品溶液0.6，1.3，2.5，5，10ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；分別進樣10iU，以進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。線性關系和回歸方程結果表明，龍血素B在3.250.4ug/ml范圍內呈良好線性關系，回歸方程為Y=28.819X-3.1591;r=0.9999;結果見表20、附圖4。表20龍血素B標準曲線實驗數據<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>②精密度試驗精密吸取龍血素B對照品溶液(濃度為25.2ug/ml)，連續進樣6次，每次10ul，測定峰面積，結果見表21，結果表明精密度較好。表21精密度試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>③穩定性試驗取本品，研細，取約0.3g，精密稱定，以0.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，攪拌使溶解，分別在配置后0、l、2、4、8、12小時測定峰面積，結果見表22，結果表明供試品在12小時內穩定。表22穩定性考察數據<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>重復性試驗取本品，研細，取6份，每份約0.3g，精密稱定，按穩定性試驗項下的方法制備供試液，每次進樣10yl，測定峰面積，結果見表23，結果表明方法重復性較好。表23重復性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>⑤加樣回收試驗精密稱取同一批號已知含量的龍血通藥物制劑(龍血素B含量為6.25mg/g)6份，每份約0.15g，分別加入濃度為0.906mg/ml的龍血素B對照品溶液lml，按穩定性試驗項下的方法制備供試液，每次進樣10iU，測定峰面積，計算回收率，結果見表24，平均回收率為97.133%。表24加樣回收試驗結果序號取樣量(g)樣品含量(mg)加對照品量(mg)實測量(mg)加樣回收率(%)平均加樣回收率(%)RSD(%)10.151350.9461.80795.2420.151120.9451.83398.130.149620.9350》061.81196.7997.1331.5440.145580.911.7997.1450.150760.9421.81196.0760.146850.9181.81999.46⑥溶出度均一性試驗采用含0.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液為溶出介質，對同一批號本品進行溶出度均一性考察。測定方法取6—粒樣品，照溶出度測定法(中國藥典2005版二部附錄XC第三法)以0.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液為溶出介質，轉速為75r/min，依法操作，考察在不同取樣時間4、6、8、10、15、20、30、45min的溶出度，每次取樣1.0ml，及時補充等量溶出介質，溶液經離心處理，注入高效液相色譜儀，測定龍血素B含量，計算出累計溶出百分率；結果見表25，并繪制溶出曲線，見附圖5。表25累積溶出量(050521)溶\取樣、出\時^-^^4min6min8min10min15mhi20min30min45min145.389969.136584.836186.571195.956996.637399.6427100.886242.448174.072879.706585.415195.014598.186598,6727100.573343.849872.183387.730887.973694.976298.7403100.697101.933447.224263.088980,517885.352690.850890.979393.098994.1062547.501169.788579.717181.892289.483691.49394.764991.4446644.041668.039576.938579.772987.875890.575494.208997.2161均值(％)45.075869.384981.574584.496392.359694.435396.847597.6933RSD(0/o)4.454.974.423.313.353.693.023.93⑦溶出度測定重現性試驗采用含0.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液為溶出介質，分別對本品進行溶出度重復性考察；測定方法同上，結果見表26、27，并繪制溶出曲線，見附圖6、7。表26累積溶出量(050522)溶\取樣■出\時4min6min8min10miri15min20min30min45min140.574261.275169.786876.039286.08788.976592.228892.3764242.725168.718974.371979.976685.825688.107994.478395.8689342.33467.802576.428282.265587.338991.705494.705896細1441.674161.773374.658677.936890.104991.697796.654398.083143.352462.010173.76581.865687.000992.14793.286892.9871645.185664.783978.593587.255190.056292.713896.725591.8876均值(％)42.640964.394074.600780.889887.735690.891494.68094.5339RSD(%)3.67664.60473.59734.41271.97761.88571.72872.388123<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>結論由試驗結果可知，龍血通藥物制劑在O.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液中釋藥迅速，拐點均在15分鐘左右，45分鐘時已達平臺，表現出較為一致的溶出曲線；故可確定龍血通藥物制劑溶出度限度為本品在O.1%十二烷基硫酸鈉的0.025mol/L氫氧化鈉溶液中，45min時溶出不少于75%。本發明的有益效果1、本發明提供了對龍血通藥物制劑中總酚和龍血素B兩種成分含量測定的方法，這些方法在原有的質量標準中都沒有，對這兩種成分的含量進行檢測，可以更加真實地反應龍血通藥物制劑的質量；2、本發明還提供了一種龍血通藥物制劑的標準指紋圖譜及其應用，這種指紋圖譜的檢測方法可以全面地反應龍血通藥物制劑的質量，對控制龍血通藥物制劑的質量大有幫助；3、本發明還提供一種龍血通藥物制劑溶出度的測定方法，測定藥物的溶出度，可以更加嚴格地控制藥物的質量；4、本發明的提供的方法具有良好準確性、穩定性和重復性，可以應用于大工業生產中，是非常好的質量控制方法。附圖1:7，4'-二羥基黃酮標準曲線附圖2:龍血素B標準曲線附圖3:龍血通藥物制劑的標準指紋圖譜附圖4:龍血素B標準曲線附圖5:龍血通藥物制劑(050521)累積溶出曲線附圖6:龍血通藥物制劑累積溶出曲線附圖7:龍血通藥物制劑累積溶出曲線具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明，下述實施例僅用于說明本發明而并非對本發明的限制。實施例1:總酚的含量測定方法a.對照品溶液的制備取7，4'_二羥基黃酮適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加無水乙醇制成每1ml中含28g的溶液，即得；b.標準曲線的制備精密量取對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液1ml，0.9%三氯化鐵溶液1ml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，以第一份為空白；照中國藥典2005年版一部附錄VB的紫外-可見分光光度法，在760nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.測定法取批號為050524的本品8mg，精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取80100目的聚酰胺lg，置蒸發皿中，精密加入上述溶液10ml，拌勻，置7(TC水浴上揮干乙醇，裝入內徑為1.5cm層析柱，用15X的乙醇40ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇85ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，精密量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，即得供試品溶液；照紫外-可見分光光度法，在760nm處，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得；d.測定結果本品每粒含總酚以7，4'-二羥基黃酮(C15H1Q04)計，為170.0mg;實施例2:總酚的含量測定方法a.對照品溶液的制備取7，4'_二羥基黃酮適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加無水乙醇制成每lml中含32iig的溶液，即得；b.標準曲線的制備精密量取對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，0.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，以第一份為空白；照中國藥典2005年版一部附錄VB的紫外-可見分光光度法，在780nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.測定法取批號為050528的本品12mg，精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取80100目的聚酰胺2g，置蒸發皿中，精密加入上述溶液10ml，拌勻，置7(TC水浴上揮干乙醇，裝入內徑為1.5cm層析柱，用20X的乙醇50ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇100ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，精密量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液1ml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，即得供試品溶液；照紫外_可見分光光度法，在780nm處，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得；d.測定結果本品每粒含總酚以7，4'-二羥基黃酮(C15H1Q04)計為168.0mg;實施例3:總酚的含量測定方法a.對照品溶液的制備取7，4'_二羥基黃酮適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加無水乙醇制成每1ml中含36g的溶液，即得；b.標準曲線的制備精密量取對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液1ml，0.9%三氯化鐵溶液1ml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，以第一份為空白；照中國藥典2005年版一部附錄VB的紫外-可見分光光度法，在800nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.測定法取批號為050530的本品15mg，精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取80100目的聚酰胺3g，置蒸發皿中，精密加入上述溶液10ml，拌勻，置7(TC水浴上揮干乙醇，裝入內徑為1.5cm層析柱，用25X的乙醇60ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇110ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，精密量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，即得供試品溶液；照紫外_可見分光光度法，在800nm處，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得；d.測定結果本品每粒含總酚以7，4'-二羥基黃酮(C15H1Q04)計為169.5mg;實施例4:龍血素B的的含量測定方法照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例為30:55為流動相，流速0.8ml/min，檢測波長為270nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.對照品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B對照品適量，加甲醇制成每lml含40iig的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制備取批號為050524的本品O.lg，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴鍋表面，加熱回流30分鐘，濾過，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10ii1，注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果本品每粒含龍血素B(C18H2。05)為1.55mg。實施例5:龍血素B的的含量測定方法照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例為40:60為流動相，流速1.0ml/min，檢測波長為278nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.對照品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B對照品適量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制各取批號為050528的本品0.2g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴鍋表面，加熱回流30分鐘，濾過，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各101，注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果本品每粒含龍血素B(C18H2。05)為1.60mg。實施例6:龍血素B的的含量測定方法照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈_1%冰醋酸水溶液比例為50:65為流動相，流速1.2ml/min，檢測波長為285nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.對照品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B對照品適量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制備取批號為050530的本品0.3g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴鍋表面，加熱回流30分鐘，濾過，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各201，注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果本品每粒含龍血素B(C18H2。05)為1.62mg。實施例7:指紋圖譜的測定參照中國藥典2005版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合指紋圖譜的要求進行a.色譜條件與系統適應性AgilentllOO液相色譜儀，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流動相為A:0.1%的磷酸與流動相B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70%線性下降至20%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.5ml/min，檢測波長為270nm，理論板數按參照物龍血素B峰計算，不低于6000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取批號為050524的本品內容物，研細，取約0.4g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超聲處理30min，濾過，取續濾液用0.45ym的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10iU，分別注入液相色譜儀，測27定，即得；e.測定結果供試品指紋圖譜有8個共有峰，各共有峰的相對保留時間分別為1號峰O.45，2號峰0.50，3號峰0.60，4號峰0.70，5號峰0.80，6號峰O.91，S號峰1.00，7號峰1.12，其中S號峰為龍血素B的色譜峰；供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜經計算軟件計算，相似度為0.85。實施例8:指紋圖譜的測定參照中國藥典2005版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合指紋圖譜的要求進行a.色譜條件與系統適應性Agilent1100液相色譜儀，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流動相為A:0.1%的磷酸與流動相B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70%線性下降至20%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.7ml/min，檢測波長為280nm，理論板數按參照物龍血素B峰計算，不低于6000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取批號為050528的本品內容物，研細，取約0.5g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超聲處理30min，濾過，取續濾液用0.45ym的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10iU，分別注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果供試品指紋圖譜有8個共有峰，各共有峰的相對保留時間分別為1號峰O.50，2號峰0.55，3號峰0.66，4號峰0.73，5號峰0.80，6號峰0.98，S號峰1.00，7號峰1.15，其中S號峰為龍血素B的色譜峰；供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜經計算軟件計算，相似度為0.88。實施例9:指紋圖譜的測定參照中國藥典2005版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合指紋圖譜的要求進行a.色譜條件與系統適應性Agilent1100液相色譜儀，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為WatersXterraC184.6X250mm，5ym，流動相為A:0.1%的磷酸與流動相B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70%線性下降至20%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.8ml/min，檢測波長為290nm，理論板數按參照物龍血素B峰計算，不低于6000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每lml含50iig的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取批號為050530的本品內容物，研細，取約0.7g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超聲處理30min，濾過，取續濾液用0.45ym的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各20iU，分別注入液相色譜儀，測定，即得；28e.測定結果供試品指紋圖譜有8個共有峰，各共有峰的相對保留時間分別為1號峰O.52，2號峰0.58，3號峰0.68，4號峰0.72，5號峰0.82，6號峰O.98，S號峰1.00，7號峰1.16，其中S號峰為龍血素B的色譜峰；供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜經計算軟件計算，相似度為0.90。實施例10:溶出度測定參照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例為55:45為流動相；檢測波長為275nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含10iig的溶液，c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取批號為050524的本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘70轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液10ii1，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；e.測定結果按外標法以峰面積計算每粒的溶出量，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B(C^H2。05)計為80%。實施例ll:溶出度測定參照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例為53:47為流動相；檢測波長為278nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含15iig的溶液，c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取批號為050524的本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘75轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液10ii1，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；e.測定結果按外標法以峰面積計算每粒的溶出量，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B(C^H2。05)計為83%。實施例12:溶出度測定參照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇_0.1%磷酸水溶液比例為50:45為流動相；檢測波長為280nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不29低于10000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含20iig的溶液，c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取批號為050524的本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘85轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液20ii1，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；e.測定結果按外標法以峰面積計算每粒的溶出量，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B(C^H2。05)計為82%。權利要求一種含有龍血竭藥材提取物的藥物制劑的質量控制方法，其特征在于采用以下方法中的任意一種或幾種(1)采用紫外-可見分光光度法檢測，藥物制劑每單位劑量含總酚以7，4′-二羥基黃酮計，不得低于165.0mg；(2)采用高效液相色譜法檢測，藥物制劑每單位劑量含龍血素B不得低于1.50mg；(3)采用高效液相色譜指紋圖譜檢測，藥物制劑的標準指紋圖譜有8個共有峰，各共有峰的相對保留時間分別為1號峰0.40～0.60，2號峰0.42～0.65，3號峰0.55～0.78，4號峰0.60～0.85，5號峰0.70～0.95，6號峰0.82～1.15，S號峰1.00，7號峰1.01～1.30，其中S號峰為龍血素B的色譜峰；(4)采用高效液相色譜法，結合溶出度測定法檢測，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B計，不得少于75％。2.如權利要求1所述總酚的含量測定方法，其特征在于a.對照品溶液的制備取7，4'-二羥基黃酮，加無水乙醇制成對照品溶液；b.標準曲線的制備量取不同劑量的對照品溶液，加無水乙醇，加十二烷基磺酸鈉溶液，鐵氰化鉀溶液，三氯化鐵溶液，搖勻，再加鹽酸；照紫外-可見分光光度法，測定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；C.供試品溶液制備與測定法取本品，加無水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液lOml，揮干乙醇，裝入層析柱，用1030%的乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇洗脫，收集洗脫液；量取該溶液置棕色量瓶中，加無水乙醇，量取該溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸鈉溶液，鐵氰化鉀溶液，三氯化鐵溶液，再加鹽酸，搖勻，得供試品溶液；照紫外-可見分光光度法，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得。3.如權利要求2所述總酚的含量測定方法，其特征在于a.對照品溶液的制備取7，4'-二羥基黃酮適量，加無水乙醇制成1!111中含2040iig的溶液，即得;b.標準曲線的制備量取對照品溶液Oml，1.Oml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.Oml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸鈉溶液2ml，鐵氰化鉀溶液lml，三氯化鐵溶液1ml，搖勻，置避光處放置，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置，以第一份為空白；照紫外-可見分光光度法，在750800nm處測定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.供試品溶液制備與測定法取本品，研細，約取515mg，置25ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取聚酰胺13g，置蒸發皿中，加入上述溶液lOml，拌勻，置熱水浴上揮干乙醇，裝入層析柱，用1030%的乙醇4060ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇80120ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，量取該溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸鈉溶液2ml，鐵氰化鉀溶液lml，三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置，得供試品溶液；照紫外_可見分光光度法，在750800nm處測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得。4.如權利要求3所述含量測定方法，其特征在于a.對照品溶液的制備取7，4'-二羥基黃酮適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加無水乙醇制成每1ml中含32g的溶液，即得；b.標準曲線的制備精密量取對照品溶液O，1.0，2.0，3.0，4.0，5.Oml，分別置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液1ml，0.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，以第一份為空白；照中國藥典2005年版一部附錄VB的紫外-可見分光光度法，在780nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線；c.供試品溶液制備與測定法取本品12mg，精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；取80100目的聚酰胺2g，置蒸發皿中，精密加入上述溶液10ml，拌勻，置7(TC水浴上揮干乙醇，裝入內徑為1.5cm層析柱，用20%的乙醇50ml洗脫，棄去洗脫液，再用無水乙醇100ml洗脫，收集洗脫液并定容至100ml，搖勻，精密量取該溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2ml，0.6%的鐵氰化鉀溶液lml，O.9%三氯化鐵溶液lml，搖勻，置避光處放置5min，再加0.1M的鹽酸定容至刻度，搖勻，置避光處放置35分鐘，即得供試品溶液；照紫外_可見分光光度法，測定吸光度，從標準曲線上讀取含量，計算，即得；d.測定結果本品每單位劑量含總酚以7，4'-二羥基黃酮計，不得低于165.Omg。5.如權利要求1所述龍血素B的含量測定方法，其特征在于采用高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-1%冰醋酸水溶液為流動相；b.對照品溶液的制備稱取龍血素B對照品，加甲醇制成對照品溶液；C.供試品溶液的制備取本品，研細，稱定，置燒瓶中，加乙醚，加熱回流，濾過，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解，搖勻，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀釋，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。6.如權利要求5所述龍血素B的含量測定方法，其特征在于采用高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-1%冰醋酸水溶液比例為3050:5070為流動相，流速0.51.5ml/min，檢測波長為250300nm;b.對照品溶液的制備稱取干燥的龍血素B對照品適量，加甲醇制成lml含40iig的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制備取本品，研細，取約O.10.3g，稱定，置燒瓶中，加乙醚，置水浴鍋表面，加熱回流，濾過，用乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各520iU，注入液相色譜儀，測定，即得。7.如權利要求6所述的含量測定方法，其特征在于照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法測定a.色譜條件和系統適用性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-1%冰醋酸水溶液比例為40:60為流動相，流速1.Oml/min，檢測波長為278nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.對照品溶液的制備精密稱取6(TC減壓干燥至恒重的龍血素B對照品適量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作為對照品溶液；c.供試品溶液的制備取本品0.2g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，加30ml乙醚，置6(TC水浴鍋表面，加熱回流30分鐘，濾過，用少量乙醚清洗容器和濾器，濾液和洗液合并，揮干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，濾過，即得供試品溶液；d.測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各lOiU，注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果本品每單位劑量含龍血素B不得低于1.50mg。8.如權利要求1所述指紋圖譜測定方法，其特征在于采用高效液相色譜法測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A:0.1%的磷酸與B:乙腈，梯度洗脫；b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品，加甲醇制成參照物溶液；C.供試品溶液的制備取本品，研細，加入甲醇，超聲處理，濾過，取續濾液，濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測定，即得。9.如權利要求8所述指紋圖譜測定方法，其特征在于采用高效液相色譜法測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為A:0.1%的磷酸與流動相B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70%線性下降至20%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.41.Oml/min，檢測波長為250300nm;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1ml含50g的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取本品內容物，研細，取約0.30.8g，置錐形瓶中，加入甲醇，超聲處理，濾過，取續濾液用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各520iU，分別注入液相色譜儀，測定，即得。10.如權利要求9所述的指紋圖譜的應用，其特征為參照中國藥典2005版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合指紋圖譜的要求進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為A:0.1%的磷酸與B:乙腈，梯度洗脫，洗脫順序為050min時，流動相A從70%線性下降至20%，流動相B從30%線性上升至80%，5060min時，流動相A保持在20%，流動相B保持在80%;流速為0.7ml/min，檢測波長為280nm，理論板數按參照物龍血素B峰計算，不低于6000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得參照物溶液；c.供試品溶液的制備取本品內容物，研細，取約0.5g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，250W、40KHz超聲處理30min，濾過，取續濾液用0.45ym的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液；d.測定法精密吸取參照物溶液與供試品溶液各lOiU，分別注入液相色譜儀，測定，即得；e.測定結果供試品指紋圖譜與標準指紋圖譜經計算軟件計算，相似度應大于0.80。11.如權利要求1所述溶出度測定方法，其特征在于采用高效液相色譜法，結合溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-O.1%磷酸水溶液為流動相；b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成參照物溶液，C.供試品溶液的制備取本品，以十二烷基硫酸鈉與氫氧化鈉溶液為溶劑，旋轉使溶出，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。12.如權利要求11所述指紋圖譜測定方法，其特征在于參照高效液相色譜法，結合溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-O.1%磷酸水溶液比例為5055:4550為流動相；檢測波長為275280nm;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含1020iig的溶液；c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘6585轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液520ia，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。13.如權利要求12所述指紋圖譜測定方法，其特征在于參照中國藥典2005年版一部附錄VID的高效液相色譜法，結合中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法進行測定a.色譜條件與系統適應性用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-O.1%磷酸水溶液比例為53:47為流動相；檢測波長為278nm，理論塔板數按龍血素B峰計，應不低于10000;b.參照物溶液的制備取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中含15iig的溶液，c.供試品溶液的制備按照中國藥典2005年版二部附錄XC第三法中的溶出度測定法，取本品，以0.1%十二烷基硫酸鈉0.025mol/L的氫氧化鈉溶液100ml為溶劑，轉速為每分鐘75轉，經45分鐘時，取溶液適量，濾過，取續濾液，作為供試品溶液；d.測定法精密量取供試品溶液lOia，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；e.測定結果按外標法以峰面積計算每單位劑量的溶出量，本品45分鐘時的溶出量以龍血素B計，不得少于75X。14.如權利要求113所述的龍血竭藥材提取物的藥物制劑，其特征在于該藥物制劑的劑型為包括但不僅限于膠囊劑、片劑、丸劑、軟膠囊的常規藥物制劑。全文摘要本發明提供了一種含龍血竭藥材提取物的藥物制劑的質量控制方法，該方法可以采用以下四種質量控制方法的任意一種或幾種(1)采用紫外-可見分光光度法對7，4′-二羥基黃酮進行含量測定；(2)采用高效液相色譜法對龍血素B進行含量測定；(3)采用高效液相色譜法進行指紋圖譜檢測；(4)采用高效液相色譜法，結合溶出度測定法進行溶出度檢測。本發明提供的質量控制方法，準確，精密，穩定性好，能夠有效地控制含龍血竭藥材提取物的藥物制劑的質量。文檔編號G01N21/33GK101780190SQ20091000964公開日2010年7月21日申請日期2009年1月20日優先權日2009年1月20日發明者劉濤,吳云,孫永城,屠鵬飛,徐玉玲,畢宇安,王振中,章晨峰,蕭偉,鄒艷萍申請人:江蘇康緣藥業股份有限公司