專利名稱：田旋花的高分子量提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過收集旋花材料的均相水溶液的高分子量成分獲得純化的旋花提取物。我們意外地發現這些高分子量提取物能抑制小鼠中兩種不同惡性腫瘤的生長。被治療動物腫瘤中白細胞的腫瘤侵潤以及誘導淋巴細胞增生的證據證明了這些提取物具有免疫增強作用。在雛雞絨毛尿囊膜檢測中進一步顯示它們具有抗血管生成性質。提取方法能除去已知具有毒性的植物材料來源的小分子，包括生物堿。旋花提取物可被用作人和動物的低毒性抗癌藥物。
背景技術：
最近應用生物反應變更因子(BRMs)的概念已被考慮用于治療癌癥。一些BRMs不直接對腫瘤細胞產生細胞毒性，但是具有改變生物體環境的性能。免疫刺激和新血管生長的抑制是潛在治療癌癥的兩種生物反應變更策略。已知抗腫瘤活性的免疫刺激物的例子為多糖K，β-1，3-葡聚糖和Mamyame疫苗。所有這些都含有高分子量多糖和/或蛋白質。血管生成抑制分子的例子包括TMP-470，和angiostatin，其已被證明具有抗腫瘤活性。在研究具有抗腫瘤活性的田旋花的提取物的過程中，我們開始試圖分離低分子量生物堿，其已知具有毒性，并且我們猜想其具有常規的化學治療或腫瘤細胞毒性。
我們發現，含有毒性生物堿的低分子量提取物顯示出很小的抗腫瘤活性，而不包括該毒性生物堿的高分子量提取物通過用作生物反應變更因子而具有明顯的抗腫瘤活性。
發明概述本發明的一個目的是提供一種組成為田旋花(Convolvulus arvensis)高分子量提取物的藥物組合物，其對正常細胞具有低的毒性，并能誘導動物中抗腫瘤效應，抑制血管生長，提高哺乳動物的免疫機能。優選該高分子量提取物除去分子量小于大約500道爾頓的成分。更優選該除去的成分分子量小于大約1,000道爾頓，更加優選該除去的成分小于大約3,000道爾頓。更加優選地，該除去的成分分子量小于大約5000道爾頓，更優選小于大約10,000道爾頓。
本發明的一個實施方案是應用分子量過濾器或者用硫酸銨沉淀分離田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物。
本發明進一步的目的是提供一種用于分離田旋花(Convolvulusarvensis)的高分子量提取物的方法，其由于除去了粗提取物中毒性的低分子量成分而具有低的毒性。優選除去分子量小于大約3,000道爾頓的成分。更優選除去分子量小于大約6,500道爾頓的成分。更加優選除去分子量小于大約10,000道爾頓的成分。
本發明的一個實施方案是應用分子量過濾器或用硫酸銨沉淀除去田旋花(Convolvulus arvensis)的低分子量提取物。
本發明進一步的目的是提供一種應用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其對動物的正常細胞具有低的毒性，并能誘導抗腫瘤的效應。
本發明進一步的目的是提供一種應用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其能抑制血管生長。
本發明進一步的目的是提供一種應用田旋花(Convolvulus arvensis)的高分子量提取物的方法，其能使動物產生免疫提高的效應。
通過參照后面提出的材料和方法，本發明的這些和其它的目的是顯而易見的。
優選實施方案的詳細描述我們發現田旋花的高分子量提取物出人意料地對正常細胞具有低的毒性，并能誘導抗腫瘤效應，抑制血管生長，提高哺乳動物的免疫機能。我們還發現田旋花提取物的低分子量成分含有分子量在300-500道爾頓的生物堿，其對腫瘤細胞和正常細胞都有毒性。為了除去毒性的低分子量成分，我們使用分子篩。通常本發明用于獲得田旋花的高分子量提取物的方法在于在水性溶液中煮沸新鮮的或老化的旋花，以獲得棕色茶狀混合物。然后將混合物離心或過濾，除去固體物質，得到一種溶液。為了除去對正常細胞的毒性，只需要除去分子量300-500的成分。然而，我們發現低分子量成分可能非特異性地粘附到膜上，之后又脫落下來。因此，優選使用更大分子量的分子篩-1000道爾頓級別，更優選3000道爾頓級別，更加優選5000道爾頓級別。我們發現即使當分子量達10,000的成分被除去后，該提取物仍保留其在動物中抗腫瘤的效應、其抑制血管生長的能力、以及其提高哺乳動物免疫機能的能力。在下面的實施例中，在水性溶液中煮沸新鮮的或老化的旋花以獲得棕色茶狀混合物后，然后將該溶液通過分子量過濾裝置，以獲得高分子量保留物(BWR)，或者應用硫酸銨沉淀，以分離高分子量沉淀(BWP)。之后凍干高分子量提取物，或濃縮。隨后檢測該提取物的抗腫瘤、免疫提高和抗血管生成活性。
然后應用SDS-Page、IEF和蛋白質檢測以進一步確定提取物的成分。應用已知分子量標準并使用Superose12-HR排阻柱(PharrnaciaBiotech)檢測該提取物的分子量。
當一起考慮后附的附圖
和權利要求書，參照優選實施方案的詳細描述，本發明的進一步特征和優點對于本領域普通技術人員是顯而易見的。
盡管本發明在實踐和測試中可以使用類似于或等價于本文描述的那些材料和方法的其它材料和方法，優選的方法和材料是目前描述的那些。實施例1描述了制備旋花的高分子量提取物所需的步驟。
在實施例2和3中，對該高分子量提取物進行鑒定和毒性測試。
在實施例4-10高分子量提取物的效果實驗中，分析了BWP和BWR的抗血管生成活性、抗腫瘤活性和對免疫機能的影響。
檢測了BWR的抗血管生成活性。通過將2mm含有10mcg肝素的甲基纖維素片放置于11天的雞蛋絨毛尿囊膜上，在雞蛋絨毛尿囊膜上誘導血管生成。BWR的200、100和50mcg三個劑量同時加入到含有肝素的片上，分三組，每組6個雞蛋。4天后，在絨毛尿囊膜上開個大口，計數每個雞蛋上新血管的數量。
按照下列公式得到血管生成的抑制百分比血管生成的抑制百分比(％)＝(1-測試組新血管的平均數/對照組新血管的平均數)×100結果如表1所示，發現血管生成或新血管的誘導通過給藥BWR被明顯抑制，并具有劑量依賴性特征。
表1血管生成的抑制

實施例5BWR的抗腫瘤活性如上所述進行制備，檢測了BWR的抗腫瘤作用。每組10個6周雌雄混合的昆明小鼠用作測試動物。隨后將S-180纖維肉瘤鐘形物(bells)皮下移植到左腹股溝區。在14天的每天中，將BWR皮下注射到右腹股溝區。在移植后15天，切除腫瘤，稱重。按照下列公式得到腫瘤生長的抑制百分比腫瘤生長的抑制百分比(％)＝(1-測試組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量)×100結果如下表2所示，發現腫瘤生長通過給藥BWR被明顯抑制。
表2

實施例6BWP的抗腫瘤活性另外檢測了BWP的抗腫瘤作用。每組10個6周雌雄混合的昆明小鼠用作測試動物。隨后將S-180纖維肉瘤鐘形物(bells)皮下移植到左腹股溝區。在14天的每天中，將BWP皮下注射到右腹股溝區。在移植后15天，切除腫瘤，稱重。按照下列公式得到腫瘤生長的抑制百分比腫瘤生長的抑制百分比(％)＝(1-測試組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量)×100結果如下表3所示，發現腫瘤生長通過給藥BWP被明顯抑制。
表3

實施例7BWP進一步的抗腫瘤效果另外進一步檢測了BWP的抗腫瘤作用。每組10個6周C57雌雄混合的昆明小鼠用作測試動物。隨后將LLC，Lewis肺癌細胞皮下移植到左腹股溝區。在21天的每天中，將BWR皮下注射到右腹股溝區。在移植后第22天，切除腫瘤，稱重。按照下列公式得到腫瘤生長的抑制百分比腫瘤生長的抑制百分比(％)＝(1-測試組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量)×100結果如下表4所示，發現腫瘤生長通過給藥BWP被明顯抑制。
表4

實施例8BWR進一步的抗腫瘤效果進一步檢測了BWR的抗腫瘤作用。每組10個6周雌雄混合的昆明小鼠用作測試動物。隨后將S-180細胞皮下移植到左腹股溝區。在14天的每天中，將BWP腹膜內注射。在移植后第15天，切除腫瘤，稱重。按照下列公式得到腫瘤生長的抑制百分比腫瘤生長的抑制百分比(％)＝(1-測試組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量)×100結果如下表5所示，發現腫瘤生長通過給藥BWR被明顯抑制。
表5

將該研究的腫瘤放入到石蠟中，染色，顯微鏡下進行檢測。發現從治療組切除的腫瘤含有大量的淋巴細胞和單核細胞，只有10％的腫瘤組織。因此，在治療組腫瘤組織中得到的腫瘤組織重量只是紀錄的10％，即是0.08克，而不是0.8克。因此，實際抑制為96.8％。這些結果還表明BWR具有提高對腫瘤組織免疫反應的性能。
淋巴細胞的增加百分比(％)＝(測試組淋巴細胞的平均數/對照組淋巴細胞的平均數×100)-100得到的結果如下表6所示。發現BWR和BWP誘導淋巴細胞增生，并具有劑量依賴性特征。
表6

實施例10BWR和BWP對人吞噬細胞活性的影響檢測了BWR和BWP對人吞噬細胞活性的影響。通過含有兩個受試者的抗凝結人血液的離心管制備兩個buffy涂層樣品。然后將該樣品分成兩份。向每個受試者的一個buffy涂層樣品中加入2微克BWR和BWP。每個測試者的一個buffy涂層樣品作為對照。將所有樣品培養5小時。然后將30微克新鮮再水合的發面酵母加入到所有樣品中。1小時后，將吖啶橙色著色劑2x儲備液加入到每個樣品中。將每個樣品的一部分置于顯微鏡玻片上。紀錄每個樣品的含有細胞內發面酵母的吞噬細胞百分比。
結果表明與對照相比，治療樣品中含有細胞內發面酵母的吞噬細胞百分比平均增加85％。這證明了通過BWR和BWP刺激免疫系統的另一機理。
權利要求
1.一種用于治療癌癥、抑制新血管生長和/或提高哺乳動物免疫機能的藥物組合物，所述組合物含有有效量的田旋花提取物，其中已除去分子量小于大約500道爾頓的成分，和藥物可接受的載體。
2.按照權利要求1的藥物組合物，其中分子量小于大約1,000道爾頓的成分已被除去。
3.按照權利要求2的藥物組合物，其中分子量小于大約3,000道爾頓的成分已被除去。
4.按照權利要求3的藥物組合物，其中分子量小于大約5,000道爾頓的成分已被除去。
5.按照權利要求4的藥物組合物，其中分子量小于大約10,000道爾頓的成分已被除去。
6.一種用于制備非毒性田旋花提取物的方法，其特征在于除去分子量小于大約500道爾頓的成分。
7.按照權利要求6的方法，其中分子量小于大約1,000道爾頓的成分被除去。
8.按照權利要求7的方法，其中分子量小于大約3,000道爾頓的成分被除去。
9.按照權利要求8的方法，其中分子量小于大約5,000道爾頓的成分被除去。
10.按照權利要求9的方法，其中分子量小于大約10,000道爾頓的成分被除去。
11.按照權利要求6的方法，其中通過應用分子量過濾器除去所述成分。
12.按照權利要求6的方法，其中通過用硫酸銨沉淀除去所述成分。
13.權利要求1的組合物在制備用于治療癌癥的醫藥中的應用。
14.權利要求1的組合物在制備用于延緩或阻止血管生長的醫藥中的應用。
15.權利要求1的組合物在制備用于提高哺乳動物免疫機能的醫藥中的應用。
16.按照權利要求15的應用，其中所述免疫機能選自淋巴細胞生長和吞噬細胞活性。
全文摘要
純化的旋花提取物用于抑制腫瘤細胞生長、抑制血管生長和提高免疫機能。該旋花提取物通過除去田旋花的毒性低分子量成分而制備。
文檔編號A61P37/04GK1338941SQ00803339
公開日2002年3月6日 申請日期2000年1月27日 優先權日1999年2月16日
發明者孟小龍, 休·D·賴爾登, 尼爾·H·賴爾登 申請人:人機能改善中心國際有限公司