專利名稱：蟾酥類高效液相色譜指紋圖譜鑒定方法
技術領域：
本發明涉及中藥指紋圖譜技術，確切地說它是蟾酥類高效液相色譜指紋圖譜鑒定方法。
背景技術：
中藥蟾酥《中國藥典》鑒別項下試管反應檢蟾毒色胺類和蟾毒配基類，這一方法不能有效地鑒別蟾酥的真偽；又用TLC法以對照藥材及脂蟾毒配基和華蟾酥毒基對照品進行鑒別，這一方法缺乏專屬性和先進性。對蟾酥類尚沒有科學、有效、先進的鑒別方法。而科學、有效、先進的鑒別方法對蟾酥的應用極為重要。

發明內容
本發明的目的是提供一種用高效液相色譜指紋圖譜鑒別蟾酥類的方法，并可將蟾酥高效液相色譜指紋圖譜作為蟾酥質量控制及真偽鑒別的指標。
本發明是這樣實現的在大量采集不同來源、不同產地蟾酥樣品的基礎上，采用高效液相色譜法，得出了蟾酥類特有的蟾毒色胺類及蟾毒配基類化學指紋圖譜；方法為利用高效液相色譜儀，UV檢測器，色譜工作站，取待測蟾酥樣品25mg，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.2μm濾膜即得蟾酥類供試品溶液。將待測蟾酥供試品溶液，在分析柱Phenyl-Hexyl(4.6×250mm，5μm)，流動相甲醇(A)-緩沖液(B，一定配比的庚烷磺酸鈉或辛烷磺酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉溶液組成)，進行梯度洗脫，流速為1.0ml/min，檢測波長296nm，進樣量20μl，保留時間90min，即得到蟾酥類各自特有的化學指紋圖譜(包括蟾毒色胺類和蟾毒配基類特征峰)，并對所有特征峰全部或大部分進行化學歸屬。
本方法能準確地測出蟾酥類的高效液相色譜指紋圖譜，從而為鑒別蟾酥的真偽和制定蟾酥藥材和蟾酥注射液質量標準提供可靠的科學依據。


圖1為中華蟾酥(中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans耳后腺的干燥分泌物)對照用HPLC指紋圖譜。
A.中華蟾酥北方品；B.中華蟾酥中原品；C.中華蟾酥南方品5-羥色胺(1)，N‘-甲基5-羥色胺(2)，蟾毒色胺(3)，蟾毒色胺內鹽(4)，日蟾毒它靈(5)，沙蟾毒精(6)，嚏根苷配基(7)，蟾毒它靈(8)，遠華蟾毒精(9)，華蟾毒它靈(10)，蟾毒靈(11)，脂蟾毒配基(12)，華蟾毒精(13)圖2黑眶蟾酥(黑眶蟾蜍Bufo melanostictus耳后腺的干燥分泌物)對照用HPLC指紋圖譜。
5-羥色胺(1)，N‘-甲基5-羥色胺(2)，蟾毒色胺內鹽(4)，沙蟾毒精(6)，嚏根苷配基(7)，19-羥基蟾毒靈(7’)，蟾毒它靈(8)，蟾毒靈(11)，脂蟾毒配基(12)圖3華西蟾酥(華西大蟾蜍Bufo bufo andrewsi耳后腺的干燥分泌物)對照用HPLC指紋圖譜。
5-羥色胺(1)，N‘-甲基5-羥色胺(2)，蟾毒色胺內鹽(4)，日蟾毒它靈(5)，沙蟾毒精(6)，嚏根苷配基(7)，蟾毒它靈(8)，遠華蟾毒精(9)，華蟾毒它靈(10)，蟾毒靈(11)圖4花背蟾酥(花背蟾蜍Bufo raddei耳后腺的干燥分泌物)對照用HPLC指紋圖譜。
蟾毒色胺(3)，蟾毒色胺內鹽(4)，日蟾毒它靈(5)，沙蟾毒精(6)，嚏根苷配基(7)，遠華蟾毒精(9)，南美蟾毒精(9’)，蟾毒靈(11)
具體實施例方式利用高效液相色譜儀，UV檢測器，色譜工作站，取待測蟾酥樣品25mg，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20ml，稱定重量，加熱回流1hr，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.2μm濾膜即得蟾酥類供試品溶液。將待測供試品溶液，在分析柱Phenyl-Hexyl(4.6×250mm，5μm)，流動相甲醇(A)-緩沖液(B，一定配比的庚烷磺酸鈉或辛烷磺酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉溶液組成)，按下表條件梯度洗脫，流速為1.0ml/min，檢測波長296nm，進樣量20μl，保留時間90min，即得到蟾酥類各自特有的化學指紋圖譜(包括蟾毒色胺類和蟾毒配基類特征峰)，并對所有特征峰全部或大部分進行化學歸屬。
梯度洗脫程序

權利要求
1.蟾酥類高效液相色譜指紋圖譜鑒定方法，使用高效液相色譜儀、UV檢測器以及相應的色譜工作站，其特征在于采用4.6×250mm，5μmPhenyl-Hexy分析柱，流動相甲醇做為A-一定配比的庚烷磺酸鈉或辛烷磺酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉溶液組成的緩沖液做為B，按以下程序梯度洗脫，梯度洗脫程序
流速為1.0ml/min，檢測波長296nm，蟾酥類供試品溶液，精密稱定蟾酥細粉25mg，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得，進樣量20μl，保留時間90min，即得到蟾酥類各自特有的化學指紋圖譜，包括蟾毒色胺類和蟾毒配基類特征峰，并對所有特征峰全部或大部分進行化學歸屬，通過該方法能快速準確地鑒別不同來源的蟾酥類，可作為蟾酥及蟾酥注射液質量控制的標準。
全文摘要
本發明公開了一種蟾酥類高效液相色譜指紋圖譜鑒定方法，采用高效液相色譜法，得出了蟾酥類特有的蟾毒色胺類及蟾毒配基類化學指紋圖譜；利用高效液相色譜儀，UV檢測器，色譜工作站，取待測蟾酥樣品25mg，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過0.2μm濾膜即得蟾酥類供試品溶液。將待測蟾酥供試品溶液，在分析柱，流動相甲醇(A)－緩沖液，進行梯度洗脫，進樣量20μl，保留時間90min，即得到蟾酥類各自特有的化學指紋圖譜，并對所有特征峰全部或大部分進行化學歸屬。本方法能準確地測出蟾酥類的高效液相色譜指紋圖譜，從而為鑒別蟾酥的真偽和制定蟾酥藥材和蟾酥注射液質量標準提供可靠的科學依據。
文檔編號G01N30/02GK1776419SQ20051011955
公開日2006年5月24日 申請日期2005年11月18日 優先權日2005年11月18日
發明者崔征, 張屏, 王東 申請人:沈陽藥科大學