專利名稱：單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法
技術領域：
本發明涉及單個分子、單個原子進行探測，是一種單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法，更詳細地說，是用近場激發全場探測的顯微方法，實現單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法。
背景技術：
對單個分子、單個原子進行探測和操縱是人類長久以來的夢想。進入上世紀90年代，隨著超靈敏的探測設備的飛速發展，單分子探測已經成為可能。它為科學家提供了一種全新的手段來研究諸如分子生物學、化學、醫學以及納米科學等領域的前沿課題。在單分子探測技術發展以前，所有的分子實驗都是探測分子集團平均的結果，雖然這類研究給我們帶來了豐富的資料，但是這種綜合平均效應的研究有其不可逾越的缺陷，即整體對象的平均效應掩蓋了來自單個分子的特殊反應，而對這些特殊反應的了解正是在我們了解生命本質、物理本源的根本基礎。
當然，要實現單分子探測還面臨著重重困難，尤其是對單分子三維探測。為了實現這一目的，國內外提出了很多新的方法。例如共焦掃描熒光顯微技術[1]、近場掃描顯微技術[2]、原子力顯微技術[3]、全內反射顯微技術[4]等。技術[1]在橫向分辨率上可比傳統的光學衍射極限分辨率提高1.2～1.5倍，并且在縱向上具有層析能力。差分共焦術、干涉共焦術等縱向分辨率甚至可以達到1nm，但是它的分辨樣品主要是針對固體材料，分辨原理是利用共焦掃描的縱向響應曲線的線性段對材料的面形進行重構。在單分子探測領域，它們的縱向層析能力大大下降或根本無法分辨。技術[2]和技術[3]在橫向分辨率上可以達到1nm或更高，在縱向上可達0.1nm，但是同樣它們的縱向分辨也只是針對固態樣品，當單分子樣品是在液態環境下時則很難工作；同時在儀器上，這兩種技術要求的控制精度非常高，價格昂貴，對環境及樣品的要求苛刻。最重要的是，以上的技術均為掃描類顯微技術、它們是以點掃描、點探測為基礎來實現成像的，從而很難實現快速的實時成像和分辨。
技術[4]是一種近場激發的寬場熒光探測技術，不需要對樣品進行掃描，所以可以進行實時成像和分辨。同時全內反射成像無需對樣品進行準接觸，對樣品無嚴格要求，在固體狀態和液體環境下均可以。將全內反射熒光顯微術用于縱向分辨成像，國外也曾有文獻報道[5][6]。應用較多的是多角度入射全內反射熒光成像(VATIRFM)，它需要從臨界角開始連續改變入射角的大小，然后在數學上用反拉普拉斯變換實現縱向重構。這種重構的數學模型是使用高帽型數學函數或矩形函數來模擬熒光分子的縱向分布，但這些模型實際上是描述熒光分子數目較多，聚集形成薄層結構的情況，并不適用于單分子探測的情形。

發明內容
本發明要解決的技術問題是針對上述在先技術運用于單分子探測的不足，提出一種單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法，以快速實現單分子的縱向超分辨探測。
本發明的單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法是基于全內反射熒光顯微術，采用全內反射熒光探測系統對被測單分子熒光樣品進行探測，兩次改變入射角，使得在這兩種情況下隱失場的滲透深度之比為2∶1，記錄下相應滲透深度時的單分子熒光成像的強度圖，對強度分布圖進行對比分析，從而精確重構出被測樣品單個熒光分子之間的縱向間隔、熒光分子的絕對縱向位置和熒光分子半徑的信息，其具體步驟是①制備單分子熒光待測樣品；②在一臺全內反射熒光探測系統的載物臺上放置該熒光樣品，調節該系統使之正常工作，激光器發出的激光束由光纖導引，經過該系統同光軸地垂直照射熒光樣品，并使樣品在CCD成清晰的圖像；③調節光纖精密平移架，使激光束通過光纖離軸地入射，經該系統的成像物鏡在全內反射熒光成像方式下對被測單分子熒光樣品進行照明、探測成像，并記入射角為θ1，相應的滲透深度為d1，入射角與滲透深度之間的關系式為d1=λ0/(4πn12sin2θi-n22)]]>即滲透深度d1與離軸量χ1之間的關系為d1=λ04πχ2/f2-n22]]>式中n1為物鏡浸沒油折射率，n2為樣品折射率，χ為離軸量，f為所用物鏡的焦距，λ0為入射光的波長；④用CCD記錄熒光強度圖1，其中包括各個單分子的強度信息；
⑤進一步增大入射角到θ2，相應的滲透深度為d2，使d1和d2之間滿足關系式d1＝2d2，并用CCD記錄此時的熒光強度圖2；⑥從熒光強度圖1和熒光強度圖2中獲得待測樣品中各個熒光分子的最大成像強度，分別記為F1d1、F1d2，F2d2、F2d2，F3d1、F3d2……，將熒光強度圖1或熒光強度圖2中不同分子的熒光強度進行比較，得到熒光分子之間的相對縱向間隔Δc=d1·lnFid1Fjd1,]]>i，j表示第i個分子和第j個分子；⑦將同一分子在熒光強度圖1和圖2中的熒光強度進行比較，以確定單個熒光分子的絕對縱向位置ci=-d2·ln[Fid21-k24k]]]>和熒光分子的半徑R=-d2ln1-k1+k,]]>這里k=[Fid1]2/Fid2·2I0·d1.]]>所述的樣品是用通過旋涂的方法將待測樣品溶液旋涂在玻片的表面上。
本發明方法的理論依據如下全內反射熒光探測系統的激發光場，即隱失場的強度是隨離開界面的垂直距離成指數衰減的，即它對距離的變化非常靈敏。這樣，不同縱向位置處的熒光物體所受到的激發場的強度不同，從而使其熒光發射的強度也不同，表現為被系統探測的熒光強度不同。Reichert W H和Truskey G A等人(J.Cell.Sci.96 219，1990)曾具體分析了全內反射探測系統下的熒光成像，得出公式為F=∫0deffφ(Z)·α(Z)·C(Z)·Q(Z)·It(Z,θi)dZ]]>It(Z，θi)＝It(0，θ2)exp[-Z/deff(θi)]deff(θi)=λ0/(4πn12sin2θi-n22)]]>式中，λ0是入射光波長，θi是光束的入射角；φ(Z)是熒光分子的量子產率；α(Z)是熒光分子的摩爾消光比；C(Z)是熒光分子的濃度；It(0，θi)是界面處的隱失場強度，以下簡寫為I0(θi)；It(Z，θi)是距離分界面Z處的隱失場強度；deff(θi)是隱失場的滲透深度，以下簡寫為d(θi)。一般情況下，熒光分子的量子產率和消光比近似與界面性質無關，并且探測效率在隱失場范圍內可認為與z無關，請參見文獻Loerke D，Preitz B，Stuhmer W et al，J.Biom.Optics 5 23，2000，即
φ(z)·α(z)·Q(z)＝φ·α·Q＝KK為與系統有關的常數。則全內反射的熒光成像強度可簡化為F(x,y,θ)=K·It(0,θi)·∫0∞c(x,y,z)·exp(-z/d(θ))dz--(1)]]>對于單分子熒光樣品，我們采用球形模型，熒光分子的分布可寫為 其中(ai，bi，ci)表示第i個熒光分子的坐標。將(2)式代入(1)式，我們可以得到在入射角θi下每個分子的成像F1=I0(θi)·d(θi){exp[-(c1-R2-(x-a1)2+(y-b1)2)d]-exp[-(c1+R2-(x-a1)2+(y-b1)2)d]}]]>F2=I0(θi)·d(θi){exp[-(c2-R2-(x-a2)2+(y-b2)2)d]-exp[-(c2+R2-(x-a2)2+(y-b2)2)d]}]]>F3=I0(θi)·d(θi){exp[-(c2-R2-(x-a3)2+(y-b3)2)d]-exp[-(c2+R2-(x-a3)2+(y-b3)2)d]}]]>……取出每個單分子成像的中心強度最大值為(F1)max=I0(θi)·d(θi)·{exp[-c1-Rd]-exp[-c1+Rd]}]]>(F2)max=I0(θi)·d(θi)·{exp[-c2-Rd]-exp[-c2+Rd]}]]>(F3)max=I0(θi)·d(θi)·{exp[-c3-Rd]-exp[-c3+Rd]}]]>……分析以上描述單分子成像的超越方程，可以看出具有特殊的數學上的對稱性。當改變一次入射角，使對應的滲透深度d1＝2d2，在兩種滲透深度下分別對單分子熒光樣品進行成像。對于任一熒光分子(記為熒光分子1)有
解上述方程，我們可以得到熒光分子1的絕對位置c1=-d2ln[F1d21-k24k]]]>k=[F1d1]2/[F1d2·2I·d1]]]>同理可得通式為ci=-d2(θ2)·ln[Fid21-k24k]---(3)]]>ki=[Fid1]2/[Fid2·2I·d1]]]>這里i表示第i個分子。同時還可確定熒光分子的半徑大小Ri=-d2ln1-ki1+ki--(4)]]>熒光分子之間的相對縱向間隔為Δc=cj-ci=d1·lnFid1Fjd1---(5)]]>這里i，j表示第i個和第j個分子。
本發明的優點在于1、本發明單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法能夠在全內反射熒光探測系統中實現單分子熒光樣品的縱向超分辨，在整個實驗過程中只需改變一次入射角，兩次成像，實驗操作簡單。
2、由于全內反射熒光成像系統是寬場成像，同時本發明方法中提出的圖像處理僅涉及簡單的除運算等，因而本發明方法可以實時快速縱向分辨。
3、激發和探測均無需對樣品進行接觸，因此對樣品操作空間大。同時對樣品無特殊要求，在固體狀態和液態環境下均可進行探測。
4、一次測量可以得到多個參數，包括熒光分子之間的相對間隔、熒光分子的絕對位置和熒光分子的半徑。


圖1為本發明所采用的全內反射熒光探測系統結構示意2為本發明全內反射熒光探測系統全內反射熒光成像狀態示意3為本發明全內反射熒光探測系統中全內反射隱失場激發待測樣品示意4為本發明隱失場滲透深度與離軸量之間關系5單分子熒光成像圖，箭頭所指為A，B兩分子。
具體實施例方式
請參閱圖1和圖2，圖1為本發明采用的全內反射熒光探測系統結構示意圖，該全內反射熒光探測系統由光源1、光纖2、光纖精密平移架3、準直物鏡4、會聚物鏡5、雙色分束鏡6、成像物鏡7、載物臺和和用來記錄熒光成像的電荷耦合器件(CCD)10構成。光源1為Ar離子激光器，模式為TEM00，波長488nm；光纖2為單模保偏光纖，數值孔徑為0.4；成像物鏡7為100×，數值孔徑為1.65，油浸；浸沒油8折射率1.78；所述的載物臺即玻片上旋涂有待測樣品9，玻片的折射率為1.78。
本發明單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法包括下列步驟①制備單分子熒光待測樣品(9)；本實施例中選用含熒光素的聚甲基丙烯酸甲酯(縮寫為PMMA)高分子膜。它是通過將10ul的濃度為10-6M/L的熒光素染料溶于10ml的PMMA的溶液中(溶劑為甲苯，溶質為PMMA，兩者重量比為7％)，最終熒光素的濃度為10-9M/L。然后通過旋涂的方法將溶液旋涂在玻片的表面。
②在一臺全內反射熒光探測系統的載物臺上放置該熒光樣品9，調節該系統使之正常工作，由Ar離子激光光源1發射輸出波長為488nm的激光束由光纖2導引，使光束中心和系統光軸同軸，再經準直透鏡4、會聚透射5和雙色分束鏡6進入物鏡，正入射到玻片的樣品9上，此時調節物鏡7和樣品9之間的距離，使樣品9在CCD10上成清晰的圖像，如圖1所示。
③調節光纖精密平移架(3)，使激光束通過光纖(2)離軸地入射，經該系統的成像物鏡(7)在全內反射熒光成像方式下對被測單分子熒光樣品(9)進行照明、探測成像，并記入射角為θ1，相應的滲透深度為d1，如圖2所示，入射角與滲透深度之間的關系式為d1=λ0/(4πn12sin2θ1-n22)]]>即滲透深度d1與離軸量χ1之間的關系為d1=λ04πχ2/f2-n22]]>式中n1為物鏡浸沒油折射率，n2為樣品折射率，χ為離軸量，f為所用物鏡的焦距，λ0為入射光的波長；④用CCD記錄熒光強度圖1，其中包括各個單分子的強度信息；⑤進一步增大入射角到θ2，相應的滲透深度為d2，使d1和d2之間滿足關系式d1＝2d2，并用CCD記錄此時的熒光強度圖2；參見圖3、圖4和圖5⑥從熒光強度圖1和熒光強度圖2中獲得待測樣品(9)中各個熒光分子的最大成像強度，分別記為F1d1、F1d2，F2d1、F2d2，F3d1、F3d2……，將熒光強度圖1或熒光強度圖2中不同分子的熒光強度進行比較，得到熒光分子之間的相對縱向間隔Δc=d1·lnFid1Fjd1,]]>i，j表示第i個分子和第j個分子；⑦將同一分子在熒光強度圖1和圖2中的熒光強度進行比較，以確定單個熒光分子的絕對縱向位置ci=-d2·ln[Fid21-k24k]]]>和熒光分子的半徑R=-d2ln1-k1+k,]]>這里k=[Fid1]2/Fid2·2I0·d1.]]>單分子探測是一種超精密探測，整個實驗過程及樣品的制備均應在標準超凈室中完成，并且要特別注意玻片的清洗和樣品制備時的清潔。單分子熒光會發生淬滅，發生淬滅所需的時間與激光功率密切相關，因此應仔細選擇入射激光的功率，使在CCD10的探測過程中不會發生熒光淬滅。選取熒光成像圖如圖5所示中的兩個分子A和B，此圖對應的離軸距離為133.5um，相應的入射角為60°，滲透深度為151.3nm，根據公式(5)計算出兩個分子之間的縱向間隔為48nm。
權利要求
1.一種單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法，其特征在于該方法是利用全內反射熒光探測系統對被測單分子熒光樣品(9)進行全場成像，重構出單個熒光分子之間的縱向間隔、熒光分子的絕對縱向位置和熒光分子半徑的信息，其具體步驟是①制備單分子熒光待測樣品(9)；②在一臺全內反射熒光探測系統的載物臺上放置該熒光樣品(9)，調節該系統使之正常工作，激光器(1)發出的激光束由光纖(2)導引，經過該系統同光軸地垂直照射熒光樣品(9)，并使樣品(9)在CCD(10)成清晰的圖像；③調節光纖精密平移架(3)，使激光束通過光纖(2)離軸地入射，經該系統的成像物鏡(7)在全內反射熒光成像方式下對被測單分子熒光樣品(9)進行照明、探測成像，并記入射角為θ1，相應的滲透深度為d1，入射角與滲透深度之間的關系式為d1=λ0/(4πn12sin2θi-n22)]]>即滲透深度d1與離軸量x1之間的關系為d1=λ04πx2/f2-n22]]>式中n1為物鏡浸沒油折射率，n2為樣品折射率，x為離軸量，f為所用物鏡的焦距，λ0為入射光的波長；④用CCD記錄熒光強度圖1，其中包括各個單分子的強度信息；⑤進一步增大入射角到θ2，相應的滲透深度為d2，使d1和d2之間滿足關系式d1＝2d2，并用CCD記錄此時的熒光強度圖2；⑥從熒光強度圖1和熒光強度圖2中獲得待測樣品(9)中各個熒光分子的最大成像強度，分別記為F1d1、F1d2，F2d1、F2d2，F3d1、F3d2……，將熒光強度圖1或熒光強度圖2中不同分子的熒光強度進行比較，得到熒光分子之間的相對縱向間隔Δc=d1·lnFid1Fjd1,]]>i，j表示第i個分子和第j個分子；⑦將同一分子在熒光強度圖1和圖2中的熒光強度進行比較，以確定單個熒光分子的絕對縱向位置ci=-d2·ln[Fid21-k24k]]]>和熒光分子的半徑R=-d2ln1-k1+k,]]>這里k=[Fid1]2/Fid2·2I0·d1.]]>
2.根據權利要求1所述的快速實現單分子熒光樣品縱向超分辨的方法，其特征在于所述的樣品(9)是用通過旋涂的方法將待測樣品溶液旋涂在玻片的表面上。
全文摘要
一種單分子熒光樣品快速縱向超分辨的方法，采用全內反射熒光探測系統，通過在探測過程中改變激光光束的入射角從而改變激發場的滲透深度，根據單分子熒光成像強度隨滲透深度的變化函數關系，重構出熒光分子之間的縱向間隔、熒光分子的絕對縱向位置和熒光分子半徑大小的信息。本發明可以實現熒光分子的納米級的縱向超分辨，而且具有實驗操作簡單、快速、激發和探測對樣品無接觸，樣品在固體狀態和液態環境下均可進行探測。一次測量可以得到多個參數。
文檔編號G01N13/00GK1588003SQ20041005407
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月27日 優先權日2004年8月27日
發明者王琛, 劉力, 王桂英, 徐至展 申請人:中國科學院上海光學精密機械研究所