專利名稱：一種含有微量三七總皂苷的樣品的檢測方法
技術領域：
本發明提供一種含有微量三七總皂苷的樣品的檢測方法，能測定含有微量的以人參二醇和/或人參三醇為次生苷元的三七總皂苷的樣品。
背景技術：
達瑪甾烷型四環三萜皂苷是中藥三七(Panax notoginseng F.H.Chen以及himalaicus)中的主要活性成分。其苷元主要有20(S)-原人參二醇和20(S)-原人參三醇兩種，在C3、C12和C20位有β-OH存在。原人參二醇和原人參三醇的區別僅在于后者還具有C6位的α-OH。成苷的位置通常在C3、C20和C6位，其相應的各種苷的結構如附圖11所示。
原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷在生物體內進行一系列復雜的轉化，雖然對于它們的作用機理已有大量研究報道，現有技術都只是測定了糞便、尿液、腸容物、注射后血漿中的皂苷及其代謝物的濃度，但是由于口服這兩類皂苷后，它們及其代謝物在血漿中的濃度太低，無法檢測，對于對其生物利用度，體內作用機制無法深入研究(何希輝、炎彬、潘衛松，等，三七皂苷中R1、Rg1在正常和腦缺血再灌大鼠中的動力學變化，[J]中藥藥理和臨床，2001，17(6)12-14)、(王毅，劉鐵漢，王巍，等人參皂苷Rg1的腸內菌代謝及其代謝產物吸入血的研究[J]藥學學報，2000，35(4)284.)(王毅，劉鐵漢，王巍，等腸內菌群對人參皂苷Rg1的代謝轉化作用的研究[J]中國中藥雜志，2001，26(3)188)、(Akao T，Kida H，KanaokaM，Hattori M，et，Intestinal bacterial hydrolysis is required for the apperance ofcompound K in rat plasma after oral administration of ginsenoside Rb1from Panaxginseng.J Pharm Pharmacol 1998 Oct，50(10)1155.)。由于沒有發現在體內代謝的過程中，上述兩種類型皂苷的體內代謝物的母核結構發生了改變，因此，如果建立苷元或次生苷元與苷及其代謝物之間的關系，建立一種方法，通過測定苷元或次生苷元的含量，反映相應的苷或苷的代謝物的量，將有利于上述研究的發展。
人參二醇、人參三醇及其相應皂苷的分析方法有大量的研究，有光譜法和色譜法，其中HPLC由于對相似結構的化合物分離度高，定量分析精度高，結果準確，常用于分析含有人參二醇、人參三醇及其相應皂苷的藥材和制劑，具體有HPLC-UV，HPLC-IR，HPLC-ELSD，HPLC-MS，HPLC等方法(三七及其制劑中化學成分分析方法概述，黃永焯，王寧生，[J]中藥新藥與臨床藥理，2002年月13卷第3期194-197)。人參皂苷Rg1的化學結構式見附圖12人參二醇和人參三醇成苷的位置通常在C3、C20和C6位。由于苷鍵屬縮醛結構，極易被催化降解。酸水解依條件不同，酸水解產物分為完全水解和部分水解。C20位的構型極易受酸的影響轉位，發生互變異構現象，形成處于平衡狀態的二種異構體的混合物。當酸性比較強時，如由于水解條件比較劇烈，可斷裂所有的糖苷鍵，生成人參二醇和人參三醇(李云華等.超臨界流體色譜法測定三七及云南白藥中人參二醇和人參三醇的含量.藥學學報，1991，26(10)764。楊崇仁等.三七中達瑪甾烷型皂甙的熱不穩定性及酸水解產物。云南植物研究，1986，8(1)87)。人參皂苷的全水解產物較復雜。酸解引起苷元結構發生變化，得不到原苷元。(張樹臣主編.中國人參[M].上海上海科技教育出版社，1992.93-149.)在溫和酸條件下水解，可保留一部分糖苷鍵，得到次生皂苷，如用0.7％H2SO4或0.1NHCl等進行水解。如人參皂苷Rg1在0.1NHCl水解下生成次生苷人參皂苷-Rh1及其C20差向異構體20(R)-人參皂苷-Rh1和它們的C24-C25水合產物.(HanBH，Park M H，Han Y Netal.Degradatio，of ginseng saponins under mild acidicconditions[J]，Planta Med，1982，44146-149).(Tsutomu O，Hisayuki T，Yoshio T.Studieson the Absorption，Distribution，Excretion and Metabolism of Ginseng SaponinsIV，Decomposition of Ginsenoside Rg1and Rb1the Digestive Tract of Rats.Chem PharmBull，1983，31(10)3691.)。但是，溫和酸水解生成人參三醇或人參二醇的水解率不夠高，因此，人參三醇或人參二醇分析測定條件的確定依賴于三七總皂苷水解條件的優化。

發明內容
發明目的本發明提供了含有微量三七總皂苷的樣品的檢測方法，并研究口服含有次生苷元為人參二醇和/或人參三醇的三七總皂苷的藥物動力學機制。
技術方案本發明所述的一種三七總皂苷中人參二醇和/或人參三醇的微量檢測方法，其步驟如下a水解含有微量三七總皂苷的樣品，b萃取水解產物，用HPLC、ESI和MS聯用測定水解產物中的人參二醇和/或人參三醇，c以人參三醇的含量高低來代表樣品中人參三醇為次生苷元的三七總皂苷的含量。
本發明所述的樣品是含有以人參三醇為次生苷元的三七總皂苷中和/或其代謝物的血漿、尿液、糞便、唾液、膽汁、腸液、胃液和其他體液。
本發明所述的以人參二醇和人參三醇為次生苷元的三七總皂苷包括三七皂苷-A、三七皂苷-B、三七皂苷-C、三七皂苷-D、三七皂苷-K、人參皂苷-Ra3、人參皂苷-Rb1、人參皂苷-Rb2、人參皂苷-Rd、三七皂苷-Fa、三七皂苷-R4、Gypenoside-XVII，Quinquenoside-R1，三七皂苷-RE、三七皂苷-RG、人參皂苷-F1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Rg2、人參皂苷-Rh1、三七皂苷-R1、三七皂苷-R2、三七皂苷-R3、三七皂苷-R6、20-O-glucoginsenoside-Rf、三七皂苷-RH、三七皂苷-RI、三七皂苷-RJ。
本發明所述的皂苷來自三七總皂苷、及其提取物和以三七為活性成分的片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、以及其他制劑形式。
本發明所述的人參皂苷是人參皂苷Rg1。
本發明所述的反應介質是30％-70％乙醇水溶液。
本發明所述的酸是無機酸、有機酸。
本發明所述的酸是硫酸。
本發明所述的硫酸的濃度是3％-12％。
本發明所述的硫酸的濃度是5％-9％。
本發明所述的酸水解的反應溫度是60℃-90℃。
本發明所述的酸水解的反應溫度是65℃-85℃。
本發明所述的酸水解的反應時間是8小時-12小時。
本發明所述的酸水解的反應時間是10小時。
本發明所述的測定酸水解產物的HPLC和MS的檢測條件是色譜條件色譜柱C18，5μm，2.1mm×5.0cm；流動相是
乙腈 20-40體積份甲醇 35-55體積份1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液20-30體積份上述流動相中較為優秀的是乙腈 30體積份甲醇 50體積份2％的醋酸水溶液或2％磷酸水溶液20體積份流速0.2ml/min；定量進樣體積20μl。
質譜條件離子源為Turbo Ionspray；噴射電壓為4000V，掃描方式為多反應檢測MRM，正離子檢測，用于檢測的離子為人參三醇和或人參二醇的二級離子上述技術方案中流動相還可以是甲醇 60-80體積份1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液20-30體積份上述技術方案中流動相還可以是乙腈 60-80體積份1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液20-30體積份有益效果本發明采用將含有微量三七總皂苷的樣品進行酸水解，使樣品中的人參皂苷Rg1轉化為人參三醇，經HPLC/ESI/MS/MS系統進行分析證明能準確地測定人參三醇的濃度，從而準確地反映人參皂苷Rg1的血藥濃度。該方法適合于含有人參皂苷Rg1的藥物的動物和臨床試驗中人參皂苷Rg1的血藥濃度的檢測，對評價生物體對人參皂苷Rg 1生物吸收和作用機理有著重要的作用。
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細說明。


圖1是空白硅烷化溶劑的GC色譜圖。
圖2是人參二醇對照品硅烷化后的GC色譜圖。
圖3是人參三醇對照品硅烷化后的GC色譜圖。
圖4是水解樣品硅烷化后的GC色譜圖。
圖5是空白血漿樣品的HPLC色譜圖。
圖6是對照品人參三醇的HPLC色譜圖。
圖7是血漿樣品的HPLC色譜圖。
圖8是人參三醇濃度的標準曲線。
圖9是犬口服三七總皂苷普通片后平均血藥濃度-時間曲線。
圖10是犬口服三七總皂苷普通片后的折算的血漿三七總皂苷濃度-時間曲線具體實施方式
實施例1三七總皂苷酸水解方法的建立(李云華等.超臨界流體色譜法測定三七及云南白藥中人參二醇和人參三醇的含量.藥學學報，1991，26(10)764。楊崇仁等.三七中達瑪甾烷型皂甙的熱不穩定性及酸水解產物.云南植物研究，1986，8(1)87)HPLC/ESI/MS/MS測定血漿樣品的第一步是三七總皂苷的酸水解，水解產率直接影響測定結果，因此我們對酸水解條件進行了優化。將水解產物中的人參三醇和人參二醇硅烷化后用氣相色譜儀測定含量，以水解產率為評價指標優化了三七總皂苷酸水解條件。
1 儀器、試藥1.1 儀器恒溫水浴GSY-II型，北京醫療設備廠氣相色譜儀(配有氫火焰離子檢測器)HP3398A，Beckman公司。
1.2 試藥衍生化試劑雙-(三甲基硅烷基)乙酰胺BSA，迪馬公司三甲基一氯硅烷TMCS，迪馬公司三甲基硅烷咪唑TMSI均為分析純，迪馬公司人參二醇購自中國藥品生物制品檢定所，批號0701-9908人參三醇購自中國藥品生物制品檢定所，批號0702-9908其它試劑均為國產分析純。
2 方法、結果
2.1.1 樣品衍生化條件在含有水解產物人參三醇和人參二醇的干燥試管中加入混合衍生化試劑200μl，密塞，混勻，置70℃恒溫水浴中反應20分鐘，取出，放至室溫，即得人參三醇(pt)和人參二醇(pd)的硅烷化衍生物。混合衍生化試劑為BSA∶TMCS∶TMSI＝3∶2∶1。
2.1.2 氣相色譜條件填充石英毛細管柱Bp5型，320μm×15m，膜厚0.25μm。
柱溫初始溫度150℃；程序升溫，最終溫度300℃。
載氣高純N2或氦氣或氬氣，流速2.0ml/min；進樣條件進樣室溫度200-300℃，進樣體積1μl；檢測器條件氫火焰離子檢測器(FID)或熱導檢測器，溫度150-300℃，2.1.3 樣品測定定量吸取衍生化后的樣品1μl，注入進樣室，測定峰面積，同時以衍生化后的對照品溶液作對照，計算含量。
根據上面色譜條件測定的色譜圖見圖1、2、3、4。
2.2 酸水解條件的探討根據文獻，確定酸水解的基本條件，在此基礎上，我們對水解的具體條件進行了優化。
2.2.1 溫度對水解反應產率的影響固定反應液為5％硫酸(50％)乙醇溶液，反應時間為10小時，以100μg三七總苷為樣品，調整反應溫度分別為70℃、80℃、90℃、98℃(近沸騰)。通過測定反應后產物中人參三醇(pt)和人參二醇(pd)的量，來比較反應溫度對產率的影響。結果見表1。
表1 溫度對水解反應產率的影響(n＝3)

2.2.2 反應時間對水解反應產率的影響固定反應液為5％硫酸(50％)乙醇溶液，反應溫度為80℃，以100μg三七總皂苷為樣品，調整反應時間分別為5h、7h、10h、15h。來比較反應時間對產率的影響。結果見表2。將反應介質改為5％硫酸(50％)甲醇溶液，其他條件同上，結果見表3。
表2 5％硫酸(50％)乙醇溶液中反應時間對水解反應產率的影響(n＝3)

表3 5％硫酸(50％)甲醇溶液中反應時間對水解反應產率的影響(n＝3)

2.2.3 硫酸濃度對水解反應產率的影響固定反應時間為10小時，反應溫度為80℃，以100μg三七總苷為樣品，調整反應液中硫酸濃度分別為1％、5％、7％、10％。來比較反應液中硫酸濃度對產率的影響。結果見表4。
表4 反應液中硫酸濃度對水解反應產率的影響(n＝3)

通過以上實驗，確定酸水解條件為三七總皂苷一定量(10mg以下)加入20ml具膠塞試管中，加入3ml 5％硫酸(50％)乙醇溶液，混勻，密塞，置80℃恒溫水浴中反應10小時，60℃水浴中氮氣吹至無醇味，用1ml水稀釋，用水飽和的氯仿萃取三次(1.5ml/次)，合并氯仿層，用氯仿飽和的水洗滌兩次(1.5ml/次)，將氯仿層轉移至5ml具塞試管中，60℃水浴中氮氣吹干，即得人參三醇(pt)和人參二醇(pd)。
實施例2人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的水解產率的測定絕對加樣回收率(萃取率)、Rb1和Rg1的水解產率考察取約20μg人參二醇，加入相應溶劑，經萃取后，吹干溶劑，衍生化后測定峰面積A；取等量人參二醇，不經萃取而直接衍生化后測定峰面積B。人參三醇同樣處理，測得峰面積A′、B′。根據峰面積比求得絕對加樣回收率(萃取率)，結果見表5。
表5 絕對加樣回收率(萃取率)結果(n＝5)

分別取50μg Rb1和Rg1，按照確立的酸水解條件進行水解、萃取，衍生化后測定相應峰面積，并計算產物中人參二醇和人參三醇的量，與理論產量相比較，計算水解產率，結果見表6。
表6 Rb1和Rg1的水解產率(n＝5)

實施例3人參皂苷Rg1生物體內樣品“酸水解/HPLC/ESI/MS/MS”測定方法的建立1 儀器、試藥1.1 儀器及HPLC/MS/MS條件恒溫水浴GSY-II型，北京市醫療設備廠。
液相色譜--質譜聯用儀API 3000，美國ABI公司液相色譜條件液相色譜儀Agilent 1100 series；色譜柱C18，5μm，2.1mm×5.0cm；流動相乙腈-甲醇-1％的醋酸水溶液(30∶45∶25)；流速0.2ml/min；定量進樣體積20μl。
質譜條件離子源為Turbo Ionspray；噴射電壓為4000V。掃描方式為多反應檢測(MRM)，正離子檢測，用于檢測的離子為人參三醇的二級離子m/z 477.4→423.4。
1.2 試藥人參三醇購自中國藥品生物制品檢定所，批號0702-9908乙腈、甲醇均為色譜純，其它試劑均為分析純。
2 方法2.1 血漿樣品的處理、測定沉淀蛋白質精密量取血漿樣品1ml，置10ml離心管中，在渦旋狀態下緩慢滴加4ml甲醇，混勻，4000r/min離心10min，將上清液盡可能完全地轉移至20ml具膠塞試管(水解管)中，并用1ml甲醇將沉淀再萃取一次，上清液也并入水解管中將上清液在60℃水浴中氮氣吹干；水解在含有樣品的水解管中，加入3ml 5％硫酸(50％)乙醇溶液，混勻，密塞，置80℃恒溫水浴中反應10小時；萃取將反應液在60℃水浴中氮氣吹至無醇味，用1ml水稀釋，用水飽和的氯仿萃取三次(1.5ml/次)，合并氯仿，用氯仿飽和的水洗滌兩次(1.5ml/次)，將氯仿層轉移至5ml具塞試管中，60℃水浴中氮氣吹干，即得含有人參三醇的水解產物。
測定用100μl流動相溶解萃取后吹干的水解產物，進樣20μl，以人參三醇的二級離子m/z 477.4→423.4為檢測信號，測定峰面積，代入標準曲線計算人參三醇的量。
2.2 標準曲線建立配制系列濃度的人參三醇標準甲醇溶液7.8ng/ml、15.6ng/ml、31.2ng/ml、62.5ng/ml、125.0ng/ml、250.0ng/ml；分別精密量取每個濃度的標準液各100μl分別加入含有1ml空白犬血漿的10ml離心管中，混勻，相當于血漿中人參三醇濃度為0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.12ng/ml、6.25ng/ml、12.50ng/ml、25.00ng/ml；以下處理同“血漿樣品的沉淀蛋白質、水解(僅僅加入相應溶劑，不水浴)、萃取、測定方法”中的步驟。測定峰面積，以峰面積為縱坐標，血漿中人參三醇的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并擬合直線回歸方程。
2.3 測定方法的考察2.3.1 日內和日間精密度考察取標準曲線項下，相當于血漿濃度分別為0.78ng/ml、6.25ng/ml、25.00ng/ml的三個樣品，一日內測定5次，計算日內精密度；連續5日每日測定一次，計算日間精密度。
2.3.2 相對回收率(方法回收率)、絕對回收率(萃取率)考察取空白犬血漿1ml，分別定量加入人參三醇0.78ng、6.25ng、12.50ng，按照“血漿樣品的沉淀蛋白質、水解(僅僅加入相應溶劑，不水浴)、萃取、測定方法”中的步驟，測定峰面積；并將相同量的人參三醇直接測定峰面積。平行測定三份，根據測得結果計算相對回收率和絕對回收率相對回收率＝(萃取后測得量/加入量)×100％絕對回收率＝(萃取后測得峰面積/直接測定的峰面積)×100％2.3.3 Rg1水解產率的考察取空白犬血漿1ml，分別定量加入Rg1 50ng、100ng、150ng，按照“血漿樣品的沉淀蛋白質、水解、萃取、測定”方法中的步驟，測定峰面積，代入標準曲線計算人參三醇的量。平行測定三份，通過與理論產量的比較，計算水解產率。
人參三醇理論得量＝Rg1的量×476/801Rg1水解率(％)＝(人參三醇測得量/理論得量)×100％3 結果3.1 根據確定的質譜條件，測得人參三醇對照品的二級掃描質譜圖。
3.2 按照確定的色譜條件測得的空白血漿、人參三醇對照品、血漿樣品色譜圖見圖5、6、7。
由圖5、6、7、可以看出，人參三醇對照品保留時間為3min，空白樣品在此處無雜峰干擾，血漿樣品峰形良好。
3.3 人參三醇的標準曲線結果見圖9。
對標準曲線進行直線回歸，回歸方程為S＝488+2.41×103C r＝0.9935 n＝6線性范圍0.78ng/ml～25.00ng/ml，最低檢測限0.3ng/ml(S/N＝3)。
3.4 方法考察的日內精密度和日間精密度結果，見表7、8。
表7 日內精密度測定結果(峰面積)

表8 日間精密度測定結果(峰面積)

由表6、7可以看出，日內精密度RSD％在3.1％～7.8％之間，日間精密度RSD％在5.2％～13.3％之間。即精密度均小于15％。
3.5 人參三醇的加樣回收率相對回收率和絕對回收率結果，見表9。
表9 人參三醇的加樣回收率(n＝3)

由表10可知，人參三醇的相對回收率(方法回收率)在96.9％～103.2％之間，絕對回收率(萃取率)在75.7％～80.4％之間，回收率比較穩定。
3.6 人參皂苷Rg1水解產率結果，見表10。
表10 Rg1水解產率結果(n＝3)

注最后樣品是用200μl流動相溶解。
由表10可知，Rg1水解產率在52.8％～56.7％之間，水解產率比較穩定。
實施例42.3.4 三七總皂苷水解后人參三醇得率考察取空白犬血漿1ml，分別定量加入三七總苷20.0ng、60.0ng、120.0ng，按照“血漿樣品的沉淀蛋白質、水解、萃取、測定“方法中的步驟，測定峰面積，代入標準曲線計算人參三醇的量。平行測定三份，根據結果計算人參三醇的得率。
人參三醇得率(％)＝(測得的人參三醇量/加入總苷的量)×100％三七總皂苷水解后人參三醇得率結果，見表11。
表11 三七總皂苷水解后人參三醇得率(n＝3)

由表11可知，三七總皂苷水解后人參三醇得率為13.84％，比較穩定，可以用水解后人參三醇的量來推算三七總皂苷的量。
實施例5犬口服三七總苷普通片的體內實驗1 儀器、試藥三七總皂苷普通片，市售糖衣片血塞通片(三七總皂苷片)，云南金泰得制藥總公司，批號010502犬3只，雜種，健康，體重17.2±2.4kg。
其它同前。
2 方法2.1 給藥、采血方法3只犬實驗前禁食24小時，口服三七總皂苷普通片，按體重給藥，劑量90mg/kg。
采血時間為服藥前5min、服藥后0.5、1、2、6、8、12、16、24h，從前肢采靜脈血3ml，肝素抗凝，以4000r/min離心10min，分離血漿，冷凍，備用。
2.2 血漿樣品的測定按照血漿樣品的“沉淀蛋白質、水解、萃取、測定”方法，測定采集的血漿樣品中的人參三醇含量。
2.3 結果處理2.3.1 藥時曲線的繪制和相關參數的計算以血漿中人參三醇濃度為縱坐標，采血時間為橫坐標，以點到點的連接方式，繪制血藥濃度-時間曲線，計算峰濃度Cmax、達峰時Tmax、藥時曲線下面積AUC、平均駐留時間MRT等參數。
Cmax、Tmax用非房室模型法求得，AUC用梯形法求得，MRT＝AUMC/AUC，AUMC是以ct對t作圖，所得的曲線下面積，用梯形法求得。
3 結果3.1 以三只犬的平均血藥濃度對時間作圖，見圖10。
3.2 將每只犬的血藥濃度對時間作圖，采用點到點連接，得到藥時曲線，計算相關藥代動力學參數，3只犬血藥濃度非房室模型法分析結果，見表12。
表12 3只犬血藥濃度非房室模型法分析結果

Cmax(ng/ml)為峰濃度，Tmax(h)為達峰時，MRT(h)為平均駐留時間，AUC0～t(h·ng/ml)為0～t時間的藥時曲線下面積。
3.3 三七總皂苷的藥時曲線根據三七總皂苷水解后人參三醇的得率(13.84％)，將3只犬的平均血藥濃度折算成三七總皂苷濃度，繪制藥時曲線，以推算血漿中三七總皂苷的情況，結果見圖11。三七總皂苷濃度＝人參三醇濃度/0.1384。
權利要求
1.一種含有微量三七總皂苷的樣品的檢測方法，其特征在于所述三七總皂苷的次生苷元為人參二醇和/或人參三醇，采用如下步驟進行a水解含有樣品中的微量三七總皂苷，b萃取水解產物，采取HPLC/ESI/MS/MS系統測定水解產物中的人參二醇和/或人參三醇，c以人參二醇和/或人參三醇的含量高低來代表樣品中三七總皂苷的含量。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的樣品是含有微量的三七總皂苷和/或其代謝物的血漿、尿液、糞便、唾液、膽汁、腸液、胃液和其他體液。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的三七總皂苷包括以下三七皂苷-A、三七皂苷-B、三七皂苷-C、三七皂苷-D、三七皂苷-K、人參皂苷-Ra3、人參皂苷-Rb1、人參皂苷-Rb2、人參皂苷-Rd、三七皂苷-Fa、三七皂苷-R4、Gypenoside-XVII，Quinquenoside-R1，三七皂苷-RE、三七皂苷-RG、人參皂苷-F1、人參皂苷-Re、人參皂苷-Rg1、人參皂苷-Rg2、人參皂苷-Rh1、三七皂苷-R1、三七皂苷-R2、三七皂苷-R3、三七皂苷-R6、20-O-glucoginsenoside-Rf、三七皂苷-RH、三七皂苷-RI、三七皂苷-RJ。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的皂苷來自三七總皂苷、及其提取物和以三七為活性成分的片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、以及其他制劑形式。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的反應介質是30％-70％乙醇水溶液。
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述的酸是無機酸、有機酸。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述的酸是硫酸。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述硫酸的濃度是3％-12％。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述硫酸的濃度是5％-9％。
10.根據權利要求8或9所述的檢測方法，其特征在于所述的酸水解的反應溫度是60℃-90℃。
11.根據權利要求10所述的檢測方法，其特征在于所述的酸水解的反應溫度是65℃-
12.根據權利要求11所述的檢測方法，其特征在于所述的酸水解的反應時間是8小時-12小時。
13.根據權利要求12所述的檢測方法，其特征在于所述的酸水解的反應時間是10小時。
14.根據權利要求12或13所述的檢測方法，其特征在于采用HPLC/ESI/MS/MS系統測定酸水解產物，檢測條件是色譜條件流動相是乙腈 20-40體積份甲醇 35-55體積份1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液20-30體積份流速0.2ml/min；定量進樣體積20μl。質譜條件離子源為Turbo Ionspray；噴射電壓為4000V，掃描方式為多反應檢測MRM，正離子檢測，用于檢測的離子為人參三醇和或人參二醇的二級離子。
15.根據權利要求14所述的檢測方法，其特征在于流動相是甲醇 60-80體積份1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液20-30體積份
16.根據權利要求14所述的檢測方法，其特征在于流動相是乙腈 60-80體積份1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液20-30體積份
17.根據權利要求14所述的檢測方法，其特征在于流動相是乙腈 30體積份甲醇 50體積份2％的醋酸水溶液或2％磷酸水溶液20體積份
全文摘要
本發明提供一種含有微量三七總皂苷的樣品的檢測方法，能測定樣品中低濃度的以人參二醇和/或人參三醇為次生苷元的三七總皂苷。本發明采用酸水解樣品中的三七總皂苷，將其轉化成為人參二醇和/或人參三醇，經HPLC/ESI/MS/MS系統進行分析，準確地測定人參二醇和/或人參三醇的濃度，從而準確地反映對應的三七總皂苷的濃度。該方法的效果是特別適合于以人參二醇和/或人參三醇為次生苷元的三七總皂苷的血藥濃度的檢測，以評價生物體對三七總皂苷的生物吸收和作用機理。
文檔編號G01N30/14GK1667410SQ20041000478
公開日2005年9月14日 申請日期2004年3月9日 優先權日2004年3月9日
發明者朱春燕, 高建義, 石峰 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所