專利名稱：通過單分子熒光分析檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過單分子熒光分析檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法。尤其是本發明可通過研究基因與結合此基因的轉錄因子之間的相互作用而用于分析蛋白質功能及檢測應用此蛋白質的藥物。
背景技術：
生命現象通過由基因表達所合成的蛋白質的正常表達并發揮功能來實現，并且異常基因表達是癌癥發生和細胞凋亡的一個原因。大多數基因表達由一種被稱為轉錄因子的DNA結合蛋白控制。轉錄研究的發展正在揭示轉錄系統的一幅整體圖像，基礎轉錄機制的相似性已經在從酵母到人類的真核細胞中得到了顯示。例如整合于啟動子上的TBP(TATA框結合蛋白)/TFIIA/TFIIB復合物的空間結構已經被闡明，關于一條DNA鏈上的基礎轉錄因子和基礎轉錄因子參與的DNA高級結構形成之間的蛋白一蛋白相互作用的最新信息也正在被收集。鑒于此，對轉錄調節因子使轉錄激活或失活的分子機制的分析已經在進行中，并集中于一種作為轉錄平臺的轉錄系統。最后，人們需要通過一個轉錄控制的網絡(network)和級聯(cascade)了解生命現象，如發育、分化、增殖、癌變。在這樣的情況下，開發一種用于迅速并特異地檢測轉錄因子與DNA結合反應的檢測系統是人們所期望的。
迄今為止，作為一種檢測轉錄因子與一段獨特DNA序列特異結合的系統，使用電泳和一種同位素(放射性物質)的分析方法如凝膠移位測定(gel shift assay)、體外轉錄測定(in vitro transcription assay)及足印法(footprinting method)是眾所周知的。
凝膠移位測定利用了轉錄因子和一段獨特DNA序列的結合使DNA結合蛋白的電泳遷移率下降的原理。在此方法中，由于需要大量的幾個毫克的蛋白質，電泳需要較長時間，并且進一步地，與DNA結合的蛋白質復合物的分子量需要通過放射自顯影分析，因而需要大量的時間和成本。另外，即使找到了特異的樣品，回收該樣品也是困難的，并且其很難擴展到蛋白質組分析。另外，由于很多蛋白質需要篩選，所以很多時間、成本及勞動都是必需的。
體外轉錄測定基于轉錄因子與DNA序列的特異結合而測定轉錄因子活性，此測定通過將作為模板的指定DNA序列、RNA聚合酶、轉錄因子、及底物NTP(堿基成分為G、A、C、和U)加入試管并在其中進行RNA合成反應而完成。在此方法中，由于需要用電泳和接下來的放射自顯影分析來檢測合成的RNA，所以很多時間、成本及勞動都是必需的。
足印法可以確定DNA鏈上的可以結合到DNA特異位點的蛋白質的核苷酸序列識別位點。詳細而言，首先，本方法中一個含有蛋白質結合位點的DNA片段的5’或3’端用32P標記，標記的DNA片段用DNA酶處理以進行非特異性堿基切割，在凝膠電泳之后進行放射自顯影，從而獲得彼此相差一個堿基長度而分離的DNA片段條帶。另一方面，當用DNA酶處理結合了蛋白質的上述DNA片段時，結合位點的堿基不能被切割，相應的條帶在放射自顯影圖中消失而在有色背景中顯示白色。通過對比兩者的放射性自顯影圖，可以確定蛋白質的結合位點和相應于此結合位點的核苷酸序列。在此方法中，由于同樣必須進行電泳和放射性自顯影分析，所以很多時間、成本及勞動都是必需的。
另外，還有一種利用與足印法相同的原理分析蛋白質和配體相互作用的方法。這是用于檢測蛋白質構象改變的方法。通過應用于轉錄復合物，可以檢測由于瀕死狀態復合物(moribund complex)和死端復合物(dead-end complex)而導致的構象改變(參見Nagai & Shimamoto(1997)Most conserved regions of the E.coli primary sigma factor areinvolved in interaction with RNA polymerase core enzyme.Genes Cells 2，725-734)。然而，還是在此方法中，由于用同位素、電泳和放射性自顯影分析，所以需要設備投資和專業人員，進行一次實驗是非常困難的。

發明內容
由于上述情況，本發明的目的之一就是提供一種檢測核酸和核酸結合蛋白結合的新方法，其可以解決所有由于使用同位素(放射性物質)和電泳的分析方法如凝膠移位測定、體外轉錄測定及足印法而產生的問題。
本發明人發現了一種新方法，其可以簡便而迅速地檢測能與核酸結合的蛋白質。本發明使用一種非放射性物質作為檢測標記，由此可完成本發明。本發明的方法可以立刻解決由于前述檢測方法如凝膠移位測定、體外轉錄測定及足印法而產生的問題。
本發明提供了下述方法(1)一種通過單分子熒光分析(monomolecular fluorescentanalysis)檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法。
(2)一種通過單分子熒光分析檢測核酸與兩種核酸結合蛋白結合的方法，其包括檢測核酸與第一種核酸結合蛋白結合的步驟；及當在上一步中已經檢測到核酸與第一種核酸結合蛋白結合后，檢測所得到的核酸—蛋白質復合物與第二種核酸結合蛋白的結合。
(3)一種通過單分子熒光分析檢測核酸與n種核酸結合蛋白結合的方法(n表示2或大于2的整數)，其包括檢測核酸與第一種核酸結合蛋白的結合的步驟；及當在上一步中已經檢測到核酸與從第一個到第X-1個共X-1個核酸結合蛋白結合時，重復檢測所得到的核酸—蛋白質復合物與第X個核酸結合蛋白結合的步驟n-1次，從X＝2到X＝n順序進行。
(4)(1)-(3)項中任一項的方法，其進一步包含通過使用針對任何一個核酸結合蛋白的抗體確定核酸與一或多種核酸結合蛋白結合的步驟。
(5)(1)-(4)項中任一項的方法，其中所述核酸具有蛋白結合位點的序列。
(6)(1)-(5)項中任一項的方法，其中所述核酸結合蛋白是TATA框結合蛋白。
(7)(1)-(6)項中任一項的方法，其中所述核酸與所述核酸結合蛋白的結合通過光信號檢測，所述光信號通過將所述核酸與熒光物質、發光物質、酶發光物質、或放射性物質結合而產生。
(8)(1)-(7)項中任一項的方法，其中所述核酸結合蛋白是基礎轉錄因子、轉錄促進因子、或轉錄抑制因子。
附圖簡述

圖1.蛋白質分子量和平移擴散時間的關系圖2.DNA大小和平移擴散時間的關系圖3.用于本發明檢測方法的熒光相關分析裝置的一個實例。
在圖3中，指代數字1-15表示如下1-激光源2-光度調節裝置(ND濾鏡)3-光衰減率選擇裝置(ND濾鏡轉換器)4-雙色相面鏡5-物鏡6-鏡臺7-濾鏡8-管狀透鏡(tube lens)9-反射鏡10-針孔11-透鏡12-光探測器(雪崩光電二極管)
13-熒光強度記錄裝置(計算機)14-樣品15-光束圖4.DNA與DNA結合蛋白之間相互作用的檢測實現本發明的最佳方式單分子熒光分析技術首先解釋一下單分子熒光分析(一種用于本發明方法的分析技術)。
單分子熒光分析是一種測量從進入并位于微小共聚焦區域的熒光分子產生的熒光信號，并根據函數關系分析所獲得數據的技術。本技術包括(1)用熒光相關光譜學(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)分析；(2)熒光強度分布分析(Fluorescence IntensityDistribution Analysis)；及(3)熒光強度多分布分析(FluorescenceIntensity Multiple Distribution Analysis)。同時進行這些分析，下面具體解釋每一項(1)熒光相關光譜學(以后簡稱為FCS)是一種測量介質中熒光標記的靶分子漲落運動的技術，并可以通過使用自相關函數(Autocorrelation function)正確地測量單個靶分子的微運動(參見D.Magde和E.Elson，“Fluorescence correlation spectroscopy.II.Anexperimental realization”，Biopolymers 1974 13(1)29-61)。
FCS可以通過分析來自熒光強度漲落的擴散時間和通過確定物理數量(分子數目及大小)進行，所述分析通過記錄溶液中微區域中的熒光分子的布朗運動而完成。FCS分析記錄分子漲落從而所述微區域可有效地以高靈敏性和高特異性檢測分子間相互作用。
下面更詳細地解釋FCS檢測的原理。在FCS中，由樣品中微區域產生的熒光信號被檢測到并用顯微鏡量化。接下來介質中的熒光標記的靶分子通常會移動(布朗運動)，從而檢測到的熒光強度會根據靶分子進入微視野區域的頻率和在此區域中的停留時間而變化。
例如，當表觀分子量由于發生分子二聚化而增加時，靶分子的運動會減慢，表觀分子數目會降低，導致靶分子進入一個微視野區域的頻率下降，觀察到的熒光強度會改變。通過監控這樣的熒光強度變化可以追蹤靶分子的表觀分子量變化。
(2)熒光強度分布分析(以后簡稱為FIDA)由以下參考文獻公開P Kask，et al.，PNAS 23，96，13756-13761，1999和WO 98/16814。FIDA是一種用激光照射樣品、用APD(高靈敏度光探測器)測量發射自樣品的熒光分子的激發光、并用關于在每40微秒的極短時間內光子計數的雙泊松分布函數分析測量到的熒光信號及接下來進行統計分析的技術。通過FIDA，可以計算每分子熒光強度(亮度，qn)和熒光分子的數目(cn)。即使存在多種類型的分子，它們也可以通過分布分析區分，并且通過將亮度與每一種類型分子的數目相乘可以計算一個數值，作為總熒光量。
(3)熒光強度多分布分析(以后簡稱為FIMDA)將FCS和FIDA同時進行。詳細內容由參考文獻K Palo，Biophysical Journal，79，2858-2866，2000)公開。根據FIMDA，熒光分子平移擴散時間的數據、分子數目、每分子熒光強度(亮度)可以同時得到。由此不僅可以確定分子大小，還可以根據亮度差異區分分子大小上大約2倍的變化，這是用FCS所不能得到的。在FCS中，只能區分分子大小上大約5倍的變化。
本發明的檢測方法用上述的單分子熒光分析技術可以進行本發明的檢測。具體地，利用單分子熒光分析技術，可以通過平移擴散時間增加(即分子量增加)來檢測“游離的核酸結合蛋白”與核酸結合而形成復合物(見圖4)。另外，利用單分子熒光分析技術，可以通過每種分子的分子數目的變化或每分子熒光強度的變化得到“游離的核酸結合蛋白”和通過與核酸結合而得到的“核酸—蛋白復合物”的存在比例。因此，利用本發明的單分子熒光分析技術的檢測方法不僅可以檢測到是否存在核酸結合蛋白與核酸的結合，還可以檢測一種核酸結合蛋白結合核酸的能力(結合力強度)。
下面詳細解釋本發明的方法。
本發明的檢測方法是一種通過單分子熒光分析技術檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法。在本發明的檢測方法中，核酸結合蛋白可以是一種或多種。
也就是說，在兩種核酸結合蛋白的情況下，利用本發明的單分子熒光分析技術的檢測方法包括檢測核酸與第一種核酸結合蛋白結合的步驟，及當在上一步中檢測到核酸與第一種核酸結合蛋白的結合后，檢測得到的核酸—蛋白復合物與第二種核酸結合蛋白結合的步驟。
進一步地，在n種核酸結合蛋白的情況下(n表示2或大于2的整數)，利用本發明的單分子熒光分析技術的檢測方法包括檢測核酸與第一種核酸結合蛋白結合的步驟；及當在上一步中已經檢測到核酸與從第一個到第X-1個共X-1個核酸結合蛋白結合時，重復檢測所得到的核酸—蛋白質復合物與第X個核酸結合蛋白結合的步驟n-1次，從X＝2到X＝n順序進行。通常預期n種為2至9種。
根據本發明的檢測方法，通過預先選擇一種“核酸”可以研究“結合所述核酸的核酸結合蛋白”。另外，根據本發明的檢測方法，通過預先選擇一種“核酸結合蛋白”可以研究“結合所述核酸結合蛋白的核酸”。
(關于核酸和核酸結合蛋白)在本發明中，“核酸”可以是DNA或RNA，并且可以包含修飾的堿基。另外，所述核酸可以是單鏈或雙鏈的，但是不被此特定限制。當一種“核酸”被預先選定并且一種“結合所述核酸的核酸結合蛋白”被研究后，所述“核酸”優選地是具有蛋白結合位點的核酸。更特別地，所述核酸可以是包含可以通過特異地結合一種蛋白質以起始基因轉錄或者促進或抑制轉錄的蛋白質結合位點的核酸。如同所描述的，當一種“核酸”被預先選定并且一種“結合所述核酸的核酸結合蛋白”被研究后，所述“核酸結合蛋白”可以是任意一種蛋白，其被預期與所述核酸特異地或非特異地結合。
另外，所述“核酸”的長度不被特別限定，只要其包含一段所希望的序列(例如蛋白質結合位點)即可。然而，當基于分子量變化而檢測到一個“核酸”和一個“核酸結合蛋白”的結合，并且所述“核酸結合蛋白”被熒光標記時，設定所述“核酸”的分子量是所希望的，這樣相對于“游離的核酸結合蛋白”，分子量的5倍或更多的增加可由所述“核酸結合蛋白”和所述“核酸”的結合而產生復合物導致。
另一方面，當一種“核酸結合蛋白”被預先選定并且一種“結合所述核酸結合蛋白的核酸”被研究時，所述“核酸結合蛋白”不被特別限定，只要已知其與一種核酸結合即可。其具體實例包括通過結合DNA參與轉錄調節如轉錄起始、延伸、和終止的轉錄因子。更特別地，轉錄因子的實例包括基礎轉錄因子、轉錄促進因子、及轉錄抑制因子。已知轉錄因子超過50種，其實例包括AP-1(激活蛋白1)、c-Myb、和FAST-1。據報道轉錄因子的分子量是12至250kDa，很多因子分子量大約是40kDa。作為轉錄因子結合的序列，一段短DNA長6個堿基，可以通過單分子熒光分析測量的核苷酸序列優選地具有至多5200堿基對的長度，更優選地具有至多1000堿基對的長度。這樣，當一種“核酸結合蛋白”被預先選定并且一種“結合所述蛋白的核酸”被研究時，所述“核酸”可以是任意一個核酸，其被預期與所述“核酸結合蛋白”特異地或非特異地結合。
當多種“核酸結合蛋白”被預期，每一種核酸結合蛋白可以直接結合一種核酸，或可以通過其他核酸結合蛋白間接結合一種核酸。
預先選定的“核酸”的實例包括包含TATA框的核酸。TATA框是一段獨特的DNA序列，其位于基因轉錄起始位置的上游，并且在轉錄起始中具有重要作用。TATA框的一段序列已知是5’-TATAA(或T)AT(或A)-3’。已知一種TATA框結合蛋白(即轉錄因子TFIID)與此TATA框結合，其后轉錄因子TFIIB結合其上。根據本發明的檢測方法，能結合到一個蛋白質結合位點如所述TATA框的蛋白質可以被研究。
另外，當一個TATA框結合蛋白(即TFIID)被用作預先選擇的“核酸結合蛋白”的一個具體實例時，所述TATA框結合蛋白可以結合的核酸可以根據本發明的方法研究。
在本發明中，“核酸”和“核酸結合蛋白”可以是通過任何方法制備的。關于“核酸”，所希望的序列可以通過合成制備。關于所述“核酸結合蛋白”，可以通過由對編碼所述蛋白的基因進行已知的遺傳工程步驟進行體外表達獲取核酸結合蛋白，或者可以從體內或細胞內提取含有此蛋白的組分，或者可以使用從蛋白質或肽文庫獲得的樣品。
本發明的檢測方法不限于前述具體描述，無須贅述，其還可以用于檢測任意核酸與任意核酸結合蛋白的結合。
下面闡述真核細胞的轉錄。
在真核細胞中存在3類RNA聚合酶，每一種轉錄一類不同的基因。RNA聚合酶II和6種基礎轉錄因子(TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH)對于轉錄編碼蛋白的基因是必需的，在這些因子中，TFIID是唯一具有DNA結合能力的因子。TFIID結合于TATA框，接下來不同的因子在啟動子上依次組裝，從而形成轉錄起始復合物(transcrition initiation complex，PIC)。RNA聚合酶從PIC上分離后轉錄即進入轉錄延伸階段。在最近的幾年中，研究了組成轉錄系統的不同因子，PIC的形成機制已經被詳細闡明。進一步地，還揭示了基礎轉錄因子或轉錄延伸因子的突變與人類遺傳病密切相關，并且人們非常需要一種有用的檢測方法。因而，本發明的檢測方法還可用于研究轉錄因子的突變對其結合DNA的能力的影響。
(檢測核酸與核酸結合蛋白結合的步驟)本發明中，單分子熒光分析需要所述“核酸結合蛋白”和所述“核酸”中的至少一種被預先標記。實例(A)到(C)作為標記的代表性模式在下面得到闡述，但是本發明并不限于這些。
(A)當“核酸結合蛋白”用熒光標記時在本實例中，比較理想的是“核酸”長度比較長，從而在與核酸結合為復合物時一個游離核酸結合蛋白的分子量增加至其5倍或更多。例如，當分子量為38kDa的轉錄因子TFIID被用作“核酸結合蛋白”時，比較理想的是合成的用于結合的“核酸”分子量優選的是152kDa或更高。由于在雙鏈DNA中一個堿基對的分子量是660Da，所以分子量為152kDa的DNA相應于230堿基對。另一方面，若“核酸”長度小于230堿基對，所述蛋白質和核酸的結合可以通過用兩種顏色的熒光標記每一個蛋白質和所述核酸來分析，并進行交叉相關分析。
(B)當“核酸”被標記時若核酸被熒光標記，所述核酸可以很容易地通過在末端合成一段寡核苷酸而摻入熒光物質標記。另外，核酸也可以用如下方法(缺口翻譯方法(nick translation method))標記用脫氧核糖核酸酶I處理任意核酸以產生一個缺口(nick)，加入四種脫氧核苷酸和DNA聚合酶I進行修復合成，其中熒光標記的核苷酸通過第二個反應摻入DNA中。由于所述“核酸結合蛋白”顯著大于合成的寡核苷酸，所以核酸大小根據復合物的形成而顯著地改變，因此此類復合物的形成可以通過單分子熒光分析識別。
(C)當多個分子用熒光標記時通過用熒光標記，“核酸”和“核酸結合蛋白”可以用兩種顏色分類，它們都可以通過檢測交叉相關的分析方法(熒光交叉相關分析)區分。
作為熒光標記法的標記，任何標記都是可用的，只要其是能夠發射可被光追蹤的信號的物質，即可用光檢測到的物質即可。例如可以使用一種熒光物質、一種發光物質、一種酶發光物質、和一種放射性物質。特別地，優選使用熒光色素，因為色素可以使單個測量微小物質的存在成為可能。優選地，可以使用發射可檢測的熒光的任意熒光物質，例如可以使用各種熒光色素如羅丹明、TAMRA、Cy3、Cy5(Amersham)、Alexa系列(分子探針)、綠色熒光蛋白GFP(Clontech)。熒光標記可以通過已知步驟進行。
檢測“核酸”與“核酸結合蛋白”結合的一個步驟是通過將所述“核酸”和所述“核酸結合蛋白”置于一種指定溶液中而進行的。所述指定溶液可以是一種已知在其中一種“核酸”與一個已知與所述核酸結合的蛋白可以結合的溶液。例如可以使用生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液。
通過在所述指定溶液中將所述“核酸”與所述“核酸結合蛋白”維持在所述指定條件下，在眾多“核酸結合蛋白”中只有能與所述“核酸”結合的蛋白質引起結合反應。此處指定條件(溫度、pH、反應時間等等)可以根據“核酸”的類型適當地設定。
若所述“核酸結合蛋白”用熒光標記，應向反應溶液中加入的“核酸結合蛋白”的量應是使終濃度優選地為大約0.01至100nM的量，更優選地使終濃度為大約0.1至50nM。應向反應溶液中加入的“核酸”的量應是使終濃度優選地為大約0.01nM至10μM的量，更優選地使終濃度為大約0.1至50nM。
一個反應的實例是如下面實施例中所描述的，所述反應可以通過將每50μL含有10nmol/L用5-TAMRA標記的所述“核酸”的生理緩沖溶液和含有1-100nmol/L所述“核酸結合蛋白”的生理緩沖溶液混和，并在室溫溫育15-30分鐘進行。
對于溫育，含有一套處于懸浮狀態的反應成分的指定反應溶液可以保持在一種適當的液體容納手段如試管、孔、比色杯、凹槽、管、平板、及多孔介質中。此處所述液體容納手段的形狀、材料、大小被優選地選擇，從而各種檢測步驟的部分或全部如分配、攪拌、溫育、測量、及運送可以迅速進行。例如，由于通過單分子熒光分析的測量在光聚焦水平上使用極端微小的區域作為測量場所，所以所述手段應是一種非常小型的液體容納手段。特別地，通過光測量的檢測，所述液體容納手段優選地具有開口部位以用于測量光束的進和/或出，從而所述用于測量的光束與反應成分盡可能地直接相聯系。
在反應后的溶液中，與所述“核酸”結合的所述“核酸結合蛋白”和在反應溶液中游離的所述“核酸結合蛋白”可以基于各自分子量的差異通過單分子熒光分析測量。從而，所述“核酸結合蛋白”結合到所述“核酸”的容易程度(親和力)可以作為解離常數而得到。
另外，在所述“核酸”和“核酸結合蛋白”的結合反應之后將特異針對一種核酸結合蛋白的抗體加入到反應溶液中，從而可以可靠地通過分子量的進一步增加而確定所述核酸結合蛋白與核酸結合(參見下面所描述的實施例)。
另外，核酸和核酸結合蛋白的分子量可以很容易地由通過分析而得到的平移擴散時間計算出來。圖1顯示當蛋白質分子量增加時平移擴散時間也增加。在圖1中，橫坐標軸表示蛋白質的分子量，縱坐標軸表示平移擴散時間(μ秒)。圖1中的指代數字1-9指代下述蛋白質1.α-銀環蛇毒素，分子量80002.鈣調蛋白，分子量167003.胰蛋白酶抑制劑，分子量21000
4.牛血清白蛋白，分子量660005.運鐵蛋白，分子量800006.菜豆(Phaseolus vulgaris)凝集素PHA-L，分子量1200007.IgG，分子量1500008.血纖蛋白原，分子量3400009.α-晶體蛋白，分子量800000另外，圖2顯示當DNA大小(即堿基對)增加時平移擴散時間也增加。在圖2中，橫坐標軸表示DNA核苷酸序列長度，縱坐標軸表示平移擴散時間(μ秒)。
(進行單分子熒光分析的裝置)下面將會通過參考圖3解釋實現單分子熒光分析的裝置(此后也稱為熒光相關分析裝置)的實例。
如圖3所示，熒光相關分析裝置裝備有激光源1、用于減弱從激光源1發出的光束15的強度的光度調節裝置(此處是ND濾鏡)2、用于設定適當的光度調節裝置2的光衰減選擇裝置(此處是ND濾鏡轉換器)3、放置包含熒光分子的樣品14的鏡臺6、用于將從激光源1發射的光束15匯聚于樣品14以形成共聚焦區域的光系統4和5、將從樣品14發射的熒光匯聚的光系統7-11、用于檢測匯聚的熒光的光探測器12、及用于記錄熒光強度變化的熒光強度記錄裝置13。如所描述的，所述熒光相關分析裝置使用共焦激光顯微鏡。
在圖3中，激光源1發出的激光可以是任何氬離子激光、氦—氖激光、氪、及氦—鎘。在圖3中，用于將從激光源1發射的光束15匯聚于樣品以形成共聚焦區域的光系統4和5特別地是指雙色相面鏡4和物鏡5。從激光源1發出的光束15沿著圖3中箭頭所示的路徑行進，即從激光源1發出的光束15的強度首先根據光度調節裝置(此處是ND濾鏡)2的衰減度衰減，接下來光束15通過雙色相面鏡4在相對于入射光線的方向上折射90度，并通過物鏡5照射到位于鏡臺6上的樣品。通過這種方式，所述光束在一個微小的點上匯聚于樣品以形成共聚焦區域。
在圖3中，將從熒光分子發射的熒光匯聚于共聚焦區域的光系統7-11特別地是指濾鏡7、管狀透鏡8、反射鏡9、針孔10、及透鏡11。從熒光分子發出的熒光沿著圖3中箭頭所示的路徑行進，即從熒光分子發出的熒光首先在光線行進方向上穿過雙色相面鏡4，由反射鏡9經過濾鏡7和管狀透鏡8折射，在針孔10形成一幅圖像，再經過透鏡11匯聚于光探測器12。
用于檢測匯聚的熒光的光探測器12(此處是指雪崩光電二極管)將接受到的光信號轉換成電信號，并將其傳送到熒光強度記錄裝置(此處是指計算機)13。
用于記錄熒光強度變化的熒光強度記錄裝置13進行記錄并分析被傳送的熒光強度數據。特別地，通過分析所述熒光強度數據可以設定自相關函數。由于熒光分子結合到受體而產生的分子量增加和游離熒光分子數量減少可以通過自相關函數的改變而檢測到。
用于實現單分子熒光分析的裝置(熒光相關分析裝置)不限于圖3所示的實例。例如，當“核酸”和“核酸結合蛋白”被用兩種具有不同激發波長的熒光物質可區分地標記時，則需要所述熒光相關分析裝置具有兩種激光源，以用于激發各自的熒光物質，并且還需要兩種光探測器以用于檢測從各自熒光物質發出的光。所述光探測器可以是除APD(雪崩光電二極管)之外還含有光電倍增管的設備。
本發明的相關效果常規地，基于轉錄因子結合到核酸的結合力的轉錄因子活性測量通過電泳和同位素(放射性物質)的分析進行，如凝膠移位測定、體外轉錄測定和足印法。
凝膠移位測定利用了轉錄因子和一段獨特DNA序列的結合使DNA結合蛋白的電泳遷移率下降的原理，但是由于需要大量的數毫克的蛋白質，電泳需要較長時間，并且與DNA結合的蛋白質復合物的分子量需要通過放射自顯影分析，因而需要大量的時間和成本。另外，即使找到了特異的樣品，回收該樣品也是困難的，并且本測定很難擴展到蛋白質組分析。另外，由于很多蛋白質需要篩選，所以很多時間、成本及勞動都是必需的。同樣，體外轉錄測定和足印法需要復雜的電泳操作和放射自顯影。
然而，通過用本發明的單分子熒光分析技術的檢測方法，上述常規方法的問題已經得到了解決，并且本發明的檢測方法還具有下面所述的優點(1)清除了常規方法中特有的麻煩，并且可以迅速并簡便地檢測核酸與核酸結合蛋白的結合。一般地，單分子熒光分析的測量時間只需幾秒至幾十秒，并且其測量操作非常簡單。另外，測量成本可以被壓縮至較低。
(2)本發明的檢測方法不僅可以檢測是否存在核酸結合蛋白與核酸的結合，還可以檢測核酸結合蛋白與核酸的結合能力(結合力強度)。
(3)由于應用了單分子熒光分析技術，幾十微升的樣品溶液即已足夠用于本發明的檢測方法，甚至即使樣品在樣品溶液中的濃度很低，仍然可以進行高靈敏度檢測。另外，即使樣品溶液是未純化的粗溶液，此溶液仍可用于本發明的檢測方法。
(4)即使粗純化溶液被用作樣品溶液，并且樣品溶液中所含的核酸或核酸結合蛋白的分子量是未知的，其分子量仍可以根據作為測量到的結合反應的結果的平移擴散時間的增加值計算出來。
綜上所述，根據本發明的檢測方法，常規方法如凝膠移位測定、體外轉錄測定和足印法的所有問題都可以得到解決。其中根據本發明的方法，核酸和具有核酸結合能力的蛋白之間的相互作用可以在分子水平以高靈敏度和低成本迅速地測量。另外，分子量可以根據由分析得到的平移擴散時間計算出來。
實施例用TAMRA標記具有TATA框序列的合成寡核苷酸并在溶液中分析所述寡核苷酸與轉錄因子TFIID及TFIIB形成復合物的行為。結果顯示于圖4和表1。
表1

轉錄因子TFIID的基本性質參見參考文獻(Ehrenberg，M.，Rigler，R.，；Chem.Phys.，4，390-410，1974)。轉錄因子TFIIB的基本性質參見參考文獻(Patterson，M.G.，et al.；Science，248，1625-1630，1990)。
從具有TFIID結合位點的用TAMRA標記的25個堿基對的寡核苷酸(Sigma Genosis)獲得一條雙鏈DNA，接下來向其中加入人重組轉錄因子TFIID和TFIIB(Promega)。此標記的雙鏈DNA在表1和下文中稱作“TFIID結合位點的25寡核苷酸”。所述“TFIID結合位點的25寡核苷酸”在溶液中的濃度設為5nM，轉錄因子TFIID和TFIIB在溶液中的濃度分別設為50nM。
所述“TFIID結合位點的25聚寡核苷酸”的序列如下
5’-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3’(SEQ ID NO.1)5’-CGT CTC GTA TAT TCC ACT CCA TCC T-3’(SEQ ID NO.2)在圖4中，指代數字(1)是指當只含有所述“TFIID結合位點的25聚寡核苷酸”的溶液被用作樣品時所述寡核苷酸熒光分子的平移擴散時間。指代數字(2)是指當轉錄因子TFIID加入到(1)中的溶液后溶液中的熒光分子的平移擴散時間。指代數字(3)是指當轉錄因子TFIIB加入到(2)中的溶液后溶液中的熒光分子的平移擴散時間。指代數字(4)是指當抗-TFIIB單克隆抗體(抗-TFIIB)加入到(3)中的溶液后溶液中的熒光分子的平移擴散時間。指代數字(5)是指當只含有用熒光標記的不具有TFIID結合位點的合成寡核苷酸(21聚體)的溶液被用作樣品時所述寡核苷酸熒光分子的平移擴散時間。指代數字(6)是指當轉錄因子TFIID、轉錄因子TFIIB、和抗-TFIIB單克隆抗體加入到(5)中的溶液后溶液中的熒光分子的平移擴散時間。另外，在關于指代數字(1)至(6)的情形中，每個分子的行為被以圖例顯示于圖4中。
所述“TFIID結合位點的25聚寡核苷酸”的分子量是17kDa，平移擴散時間是178微秒(圖4(1))。圖中可見當TFIID加入到所述寡核苷酸中時，平移擴散時間變為237微秒。此處由復合物的55kDa分子量預期平移擴散時間為264微秒，測量值和預期值之間的差異在大約10％之內(圖4(2))。由此可見分子量可由平移擴散時間估計。
進一步地，通過加入轉錄因子TFIIB，復合物變得更大，其分子量變為87kDa。圖中可見當每分子分子量增加時，以原始合成寡核苷酸為標準的平移擴散時間也增加，其數值接近計算值(圖4(3))。此時可見平移擴散時間的測量值和預期值之間的差異僅在大約4％之內。
進一步地，通過加入抗-TFIIB或抗-TFIID單克隆抗體證實，溶液中出現一個復合物(圖4(4))。所述抗體分子量為140kDa，包含此抗體的復合物分子量為227kDa。圖中可見平移擴散時間的預期值和相似測量獲得的測量值之間的差異在大約3％之內。此處當向溶液中加入抗體時，可使用任何抗-TFIIB抗體和抗-TFIID抗體，或同時使用二者。
如上所述，圖4中的指代數字(1)至(4)顯示通過使蛋白質與所述“TFIID結合位點的25聚寡核苷酸”結合，所述寡核苷酸熒光分子的大小增加，所述熒光分子的平移擴散時間增加。
另一方面，在不具有TATA框結合序列的合成寡核苷酸(21聚體)中，即使加入轉錄因子和抗—轉錄因子抗體，具有熒光信號的復合物還是不能形成，并且平移擴散時間并沒有明顯增加(表1，圖4(5)和(6))。
工業應用根據本發明，提供了一種通過單分子熒光分析檢測核酸和核酸結合蛋白結合的方法。特別地，本發明可用于研究基因和與此基因結合的轉錄因子之間的相互作用、分析蛋白質功能、及用此方法檢測藥物。
序列表<110>奧林巴斯光學工業株式會社<120>通過單分子熒光分析檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法<130>03S0569P<140>PCT/JP03/05189<141>2003-04-23<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述具有TFIID結合位點的寡核苷酸<400>1gcagagcata taaggtgagg tagga25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述具有TFIID結合位點的寡核苷酸<400>2tcctacctca ccttatatgc tctgc2權利要求
1.一種通過單分子熒光分析檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法。
2.一種通過單分子熒光分析檢測核酸與兩種核酸結合蛋白結合的方法，所述方法的特征包括檢測核酸與第一種核酸結合蛋白結合的步驟；及當在上一步中已經檢測到核酸與第一種核酸結合蛋白結合后，檢測所得到的核酸一蛋白質復合物與第二種核酸結合蛋白的結合。
3.一種通過單分子熒光分析檢測核酸與n種核酸結合蛋白結合的方法(n表示2或大于2的整數)，所述方法的特征包括檢測核酸與第一種核酸結合蛋白結合的步驟；及當在上一步中已經檢測到核酸與從第一個到第X-1個共X-1個核酸結合蛋白結合時，重復檢測所得到的核酸—蛋白質復合物與第X個核酸結合蛋白結合的步驟n-1次，從X＝2到X＝n順序進行。
4.權利要求1至3任一項的方法，其進一步的特征是包含通過使用針對任何一個核酸結合蛋白的抗體確定核酸與一或多種核酸結合蛋白結合的步驟。
5.權利要求1的方法，其特征是所述核酸具有蛋白質結合位點的序列。
6.權利要求1的方法，其特征是所述核酸結合蛋白是TATA框結合蛋白。
7.權利要求1的方法，其特征是所述核酸與核酸結合蛋白的結合用光信號檢測，所述光信號通過將所述核酸與熒光物質、發光物質、酶發光物質、或放射性物質結合而產生。
8.權利要求1的方法，其特征是所述核酸結合蛋白是基礎轉錄因子、轉錄促進因子、或轉錄抑制因子。
全文摘要
本發明涉及一種通過單分子熒光分析檢測核酸與核酸結合蛋白結合的方法。
文檔編號G01N33/50GK1860368SQ0382635
公開日2006年11月8日 申請日期2003年4月23日 優先權日2003年4月23日
發明者加藤則子, 岡本直明 申請人:奧林巴斯株式會社