一種檢測核酸中非雙鏈區域鳥嘌呤的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液來檢測核酸中非雙鏈區域鳥嘌呤的新方法，屬于DNA測序領域。
【背景技術】
[0002]DNA切割和損傷是細胞進程中很重要的因素。除了天然的蛋白核酸酶可以降解DNA之外，還有幾種不同的化學核酸酶被認定可以切割DNA，主要是通過水解和氧化作用。我們知道除了單鏈和雙鏈DNA之外，還存在很多非經典的非雙鏈結構，例如，發卡式結構、突起、環狀結構、結節等，一般認為這些存在于雙鏈DNA中的非雙鏈結構是DNA復制過程中產生的錯誤，而且這些結構對與癌細胞中的染色體突變起著很重要的作用，所以能夠靶標這些非雙鏈結構和切割損傷DNA中的這些結構在生物體內有很重要的應用。
[0003]一般切割損傷DNA，主要是通過對DNA的水解和氧化作用。雖然DNA不容易水解，但是卻極易被氧化。金屬絡合物能夠活化空氣中的氧氣或還原過氧化氫來產生活性氧，從而氧化損傷DNA。核酸氧化的位置主要是在雜環芳氫的位點，針對不同的反應位點，氧化劑的作用效果并不是完全一樣的，而這些效果取決于金屬絡合物和DNA中的氧化位點的距離。我們對金屬過氧化物酶和擬生態模型的研究作了進一步的了解，在氧化劑的存在下，例如過硫酸氫鉀或者雙氧水，我們能夠發現高價態的金屬氧的絡合物，或者是羥基自由基，這些活性物質都很容易釋放出來，從而距離比較近的底物就首當其沖。因而活性金屬絡合物或者羥基自由基和DNA之間有效的作用是氧化損傷DNA的關鍵。
[0004]通過了解DNA的氧化損傷的結果，可以幫助我們更加深入的了解DNA的結構和性質。另外，值得一提的是氧化損傷DNA，是一種非常方便有效的DNA化學測序的方法。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題在于提供了一種快速、有效和靈敏的檢測DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的方法。
[0006]本發明提供的技術方案具體如下:
一種DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，包括以下步驟:先將帶熒光標記的DNA與含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液反應，然后用冰乙醇沉淀出DNA，再將DNA與哌啶水溶液加熱反應，然后旋干溶劑，將得到的樣品上樣至電泳槽，記錄非雙鏈區域鳥嘌呤的位置和個數。
[0007]上述DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，具體包括以下步驟:
(O向帶熒光標記的DNA的水溶液中加入含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液，反應1-10分鐘后加入冰乙醇沉淀1-2小時，然后離心除去上清液，取沉淀旋干；
(2)將步驟(I)旋干得到的樣品加入哌啶水溶液中，加熱反應0.5小時，旋干；
(3)將步驟(2)旋干得到的樣品上樣至電泳槽，記錄非雙鏈區鳥嘌呤的位置和個數。
[0008]優選地: 所述的含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液中，鎢酸鉀的濃度為0.05-5 mM，過氧化氫的濃度為0.05-5 mM。
[0009]選地溶液，劑，上樣至電泳所述的哌啶水溶液中哌啶的體積濃度為10%。
[0010]所述的加熱溫度為90°C。
[0011]用過氧化氫和鎢酸鉀可以選擇性的與DNA中的鳥嘌呤發生氧化反應，再經過哌啶處理，使氧化后的DNA發生斷裂；再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，使不同長度的核酸斷裂帶一一區分開，可以得到所有鳥嘌呤的位置和個數。通過和經典的硫酸二甲酯處理方法對t匕，可以清楚的看到反應的區域正是DNA中非雙鏈區域的鳥嘌呤。
[0012]本發明是通過含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液與DNA中非雙鏈區域的鳥嘌呤特異性的反應，經過哌啶的熱處理會使DNA中非雙鏈區域的鳥嘌呤位置特異性的斷裂，從而會在20%的DNA聚丙烯酰胺變性膠上看到特異性的DNA斷裂帶，這樣來確定DNA中非雙鏈區域的鳥嘌呤在DNA序列中的位置。而傳統的硫酸二甲酯處理DNA的方法對于單雙鏈區域沒有選擇性。通過我們的方法和傳統的硫酸二甲酯的方法對比，可以非常清楚的看到非雙鏈區域的所有鳥嘌呤的位置和個數。本方法可以實現快速、有效和靈敏的檢測非雙鏈區域鳥嘌呤。
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1-5的變性膠圖結果比較，實施例1-5依次對應著圖1中的泳道1-5。
【具體實施方式】
[0014]以下以具體實例對本發明的技術方案做進一步地說明。本發明所采用的帶熒光標記的DNA購于大連寶生物公司，將熒光標記的DNA配制成濃度為10 μ M的水溶液，用于以下實施例中。
[0015]實施例1:DNA與哌啶直接反應
取帶熒光標記的DNA的水溶液(10 μΜ)2 μ L加入至體積濃度為10%的哌啶水溶液中，90°C熱處理0.5小時后，旋干溶劑，將旋干得到的樣品上樣至電泳槽中，2 h后觀察照膠結果，沒有DNA發生斷裂。
[0016]實施例2 =DNA先經鎢酸鉀處理，再與哌啶的反應
取帶熒光標記的DNA的水溶液(10 μΜ)2 μ L經0.05-5 mM的鎢酸鉀水溶液處理1-10min，再加入冰乙醇沉淀DNA，然后離心除去含鎢酸鉀的上清液，將沉淀旋干后加入到體積濃度為10%的哌啶水溶液中，90°C熱處理0.5小時后，旋干溶劑；將旋干得到的樣品上樣至電泳槽，2 h后觀察照膠結果，沒有DNA發生斷裂。
[0017]實施例3 =DNA先經過氧化氫處理，再與哌啶的反應
取帶熒光標記的DNA的水溶液(10 μΜ)2 μ L經0.05-5 mM的過氧化氫水溶液處理
1-10 min,再加入冰乙醇沉淀DNA，然后離心除去含過氧化氫的上清液，將沉淀旋干后加入到體積濃度為10%的哌啶水溶液中，90°C熱處理0.5小時后，旋干溶劑；將旋干得到的樣品上樣至電泳槽，2 h后觀察照膠結果，沒有DNA發生斷裂。
[0018]實施例4:DNA先經含鶴酸鉀和過氧化氫的混合水溶液處理,再與哌啶的反應
取帶熒光標記的DNA的水溶液(10 μΜ) 2 μ L，經0.05-5 mM鎢酸鉀和0.05_5 mM過氧化氫的混合水溶液處理1-10 min,再加入冰乙醇沉淀DNA，然后離心除去含氧化劑的上清液，將沉淀旋干后加入到體積濃度為10%的哌啶水溶液中，90°C熱處理0.5小時后，旋干溶齊IJ;將旋干得到的樣品上樣至電泳槽，2 h后觀察照膠結果，DNA在非雙鏈區域的鳥嘌呤處發生斷裂。
[0019]實施例5 =DNA先硫酸二甲酯處理，再與哌啶的反應
作為對照，取帶熒光標記的DNA的水溶液(10 μ M) 2 μ L，加入硫酸二甲酯2 μ L，反應5 min后，加入冰乙醇沉淀DNA，然后離心除去含硫酸二甲酯的上清液，將沉淀旋干后加入到體積濃度為10%的哌啶水溶液中直接90°C熱處理0.5小時，然后旋干溶劑；將旋干得到的樣品上樣至電泳槽，2 h后觀察照膠結果，DNA在所有的鳥嘌呤處發生斷裂。
[0020]比較實施例1~5的照膠結果，可以看出，DNA只有在鎢酸鉀和過氧化氫同時存在的情況下，才能被氧化切割，通過與已經被報道過的硫酸二甲酯的方法比較，我們的方法針對非雙鏈區域的鳥嘌呤有著獨特的選擇性。如圖1所示，說明該方法快速、靈敏且有效。
【主權項】
1.一種DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:先將帶熒光標記的DNA與含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液反應，然后用冰乙醇沉淀出DNA，再將DNA與哌啶水溶液加熱反應，然后旋干溶劑，將得到的樣品上樣至電泳槽，記錄非雙鏈區域鳥嘌呤的位置和個數。
2.根據權利要求1所述的DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟: (O向帶熒光標記的DNA的水溶液中加入含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液，反應1-10分鐘后加入冰乙醇沉淀1-2小時，然后離心除去上清液，取沉淀旋干； (2)將步驟(I)旋干得到的樣品加入哌啶水溶液中，加熱反應0.5小時，旋干； (3)將步驟(2)旋干得到的樣品上樣至電泳槽，記錄非雙鏈區鳥嘌呤的位置和個數。
3.根據權利要求1或2所述的DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，其特征在于:所述的含鎢酸鉀和過氧化氫的混合水溶液中，鎢酸鉀的濃度為0.05-5 mM，過氧化氫的濃度為0.05-5 mM。
4.根據權利要求1或2所述的DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，其特征在于:所述的哌啶水溶液中哌啶的體積濃度為10%。
5.根據權利要求1或2所述的DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的檢測方法，其特征在于:所述的加熱溫度為90°C。
【專利摘要】本發明公開了一種利用含過氧化氫和鎢酸鉀的混合水溶液來檢測DNA中非雙鏈區域鳥嘌呤的新方法。用過氧化氫和鎢酸鉀可以選擇性的與DNA中的鳥嘌呤發生氧化反應，再經過哌啶處理，使氧化后的DNA發生斷裂；再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗，使不同長度的核酸斷裂帶一一區分開，可以得到所有鳥嘌呤的位置和個數。本發明可以快速、有效和靈敏的實現非雙鏈區域中鳥嘌呤的檢測。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104630359
【申請號】CN201510055186
【發明人】周翔, 毛伍祥, 宋鴻瑋, 翁小成
【申請人】武漢大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月3日