專利名稱：HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用的制作方法
技術領域：
本發明關于HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其通過將HIF-1α作為藥物靶標，在低氧環境下來篩選可對白血病細胞產生分化作用的藥物。
背景技術：
白血病是嚴重危害人類生命健康的造血系統惡性腫瘤。其中，急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)由于起病急，病死率高等特點而受到更為廣泛的重視。另一方面，由于白血病取材方便，并且易于觀察療效，有關AML發病學和治療學的研究在過去十多年中所取得的進展令人矚目。人們相信，未來腫瘤治療學上的突破很有可能首先源自于對白血病的研究。已知大多數白血病細胞存在特異的細胞遺傳學改變，尤其是染色體易位。這些易位常常形成異常融合基因和產生相應的融合蛋白，干擾造血干細胞的正常分化過程并使該過程受阻于某一分化階段。例如，約占成人AML10-15％的急性早幼粒細胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)以骨髓粒系細胞發育停滯在早幼粒細胞階段為特征。它的發生與位于人類17號染色體長臂上的維甲酸受體α(retinoic acid receptorα，RARα)基因的異常重排密切相關。現已發現，95％以上的APL患者的白血病細胞存在非隨機染色體易位t(15；17)(q22；q21)，該染色體易位使17號染色體上的RARα基因與15號染色體上的PML(promyelocyticleukemia)基因融合，形成PML-RARα融合基因。一些變異型染色體易位也存在少數APL病人中，并且幾乎毫無例外地累及RARα。這些易位包括t(11；17)(q23；q21)、t(11；17)(q13；q21)、t(5；17)(q35；q21)和dup(17)(q21.3；q23)，它們分別產生PLZF-RARα、NuMA-RARα、NPM-RARα和STAT5b-RARα融合基因。這些融合基因蛋白產物均對野生型RARα具有顯性負調節作用，被認為是APL發病的直接原因。
上世紀八十年代中期，我國學者率先運用全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)治療APL，并在臨床實踐中取得良好療效。緩解率達到了90％以上，為腫瘤的治療提供了全新的模式——“誘導分化治療”(differentiation therapy)，即運用誘導分化劑誘導白血病細胞向成熟階段分化，恢復其正常的表型及功能，同時抑制惡性腫瘤細胞的增殖。誘導分化療法正日益受到眾多學者的關注，但迄今為止，誘導分化治療的成功模式仍限于ATRA治療APL。因此，該治療模式在其它類型的白血病以及實體瘤中取得突破是各國學者共同追求的目標，也是當今醫學研究的重要熱點之一。
上世紀末，我國學者成功地應用三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)治療ATRA治療后復發以及對ATRA和化療藥物不敏感的難治性APL病人，并在短期內得到世界大多數國家和地區的廣泛證實。于是，許多醫學實驗室致力于對ATO治療APL的藥理機制的研究。體外實驗證實，ATO具有雙重性的藥理效應，即高濃度(1-2μM)的ATO能有效地誘導APL細胞凋亡，而低濃度(0.1-0.5μM)ATO經過長時間的處理，則可誘導APL細胞發生部分分化。但是，APL動物模型以及臨床實驗觀察提示，ATO的治療效果在很大程度上取決于其對細胞的誘導分化效應。另一方面，越來越多的體外研究顯示，ATO的凋亡誘導效應并不局限于APL，它也可以誘導許多其它白血病和實體瘤細胞凋亡。但是，迄今為止尚未見到ATO對APL以外的惡性腫瘤治療效果的報道。
基于ATO的體外誘導分化效應遠不如其在白血病病人體內的作用效應明顯，我們推測存在體內骨髓微環境中的某些因素可能影響ATO的誘導分化作用，而氧濃度可能屬于這些影響因素之一，因為體外細胞培養通常在氧濃度為21％左右的大氣環境中；而人體內環境的氧分壓卻要低得多，如肺泡的氧濃度僅為16％，而人體其它臟器的氧濃度均低于6％。雖然在骨髓中惡性增殖的白血病細胞，并未形成如同于實體瘤的局部病灶所形成的低氧環境，然而AML病人中普遍存在貧血等癥狀，并且隨著白血病細胞的迅速增生，可能進一步加重骨髓中的低氧狀況。事實上，Jensen等科學家最近的發現也證實了這種推測。他們發現移植到Brown Norwegan小鼠的白血病細胞在骨髓中呈現明顯的低氧狀態。
低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是受控于氧濃度變化一個至關重要的轉錄因子。HIF-1由α和β亞基組成。這些亞基都屬于具有螺旋一環一螺旋(BHLH)/Per-Arnt-Sim(PAS)結構域的蛋白家族成員。該家族由兩大類蛋白質組成。第一類包括HIF-1α、HIF-2α(EPAS-1/HLF/HRF/MOP2)和HIF-3α。第二類則有Arnt1(HIF-1β)、Arnt2和Arnt3。其中HIF-1α是依賴于低氧情況而存在的轉錄因子，它在維持氧濃度平衡中起著舉足輕重的作用。HIF-2α和HIF-3α的表達同樣也受到氧濃度的調節，但與HIF-1α相比，它們更具有組織特異性功能。HIF-1的活性實際上依賴HIF-1α的穩定表達。在正常氧濃度時，HIF-1α受細胞內泛素的蛋白酶體系統的作用發生降解。而在低氧時，HIF-1α穩定表達并轉移至細胞核與HIF-1β形成異二聚體。此異二聚體作用于靶基因的低氧反應元件(HRE)，啟動一系列基因的轉錄，產生特定的蛋白質調節對低氧的適應性反應而維持機體內氧穩態。HIF-1在心臟缺血、大腦缺氧、慢性阻塞性肺病、腫瘤中都有過度表達。
雖然目前關于低氧和HIF-1α的研究涉及很多領域，但迄今為止，還沒有關于其在白血病分化中的作用以及如何利用低氧和HIF-1α相關的信號傳導途徑誘導分化治療白血病的研究報道。

發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其通過將HIF-1α作為藥物靶標，在低氧環境下來篩選可對白血病細胞產生分化作用的藥物。
本發明的技術要點是提供HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其特征在于通過將HIF-1α作為藥物靶標，來篩選能使HIF-1α的降解被抑制、從而對白血病細胞產生分化作用的藥物。
利用低氧環境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，可將HIF-1α用于篩選適當的低氧模擬物用于使白血病細胞進行分化本發明利用HIF-1α作為藥物靶標，篩選出氯化鈷用于實現對白血病細胞的分化作用。所述白血病細胞是指NB4細胞、U937細胞及Kasumi細胞和各型AML細胞等。
本發明利用低氧環境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，來篩選適當的藥物，尤其是可能的低氧模擬物，用于使白血病細胞進行分化，從而達到治療白血病的目的。


圖1是CoCl2對NB4細胞的生長、活力和細胞周期的影響的示意圖。
圖1A是不同濃度的CoCl2對NB4細胞生長影響的示意圖。
圖1B是不同濃度的CoCl2對NB4細胞活力影響的示意圖。
圖1C是用25μM和50μM CoCl2處理3天后，對NB4細胞細胞周期影響的示意圖。
圖1D是NB4細胞經過50μM CoCl2、0.5μM ATO以及聯合用藥后第3天時Annexin V檢測的示意圖。
圖2是25μM和50μM CoCl2誘導NB4細胞分化的示意圖。
圖2A是用25μM和50μM CoCl2處理NB4細胞6天時的形態學觀察示意圖。
圖2B是經25μM和50μM CoCl2處理2、4、6天時的NB4細胞CD11b的表達增加的示意圖。
圖3是50μM CoCl2和/或0.5μM ATO與0.1μM ATRA處理NB4細胞3天對PML/PML-RARα細胞內定位的影響示意圖。
圖4是經50μM CoCl2和/或0.5μM ATO與0.1μM ATRA處理3天后，NB4細胞的PML-RARα蛋白表達情況的示意圖。
圖5是CoCl2對于ATRA和ATO誘導NB4細胞分化的影響示意圖。
圖5A是NB4經過50μM CoCl2和/或0.1μM ATRA處理4后，對CD11b以及CD14影響的示意圖。
圖5B是NB4經過50μM CoCl2和/或0.5μM ATO處理4天后，對CD11b表達影響的示意圖。
圖6是CoCl2誘導U937和Kasumi-1細胞分化，但不誘導HL60細胞發生分化。
圖6A是U937細胞經過25μM和50μM CoCl2處理后第6天的形態學改變及其細胞表面抗原CD11b的表達情況示意圖。
圖6B是Kasumi-1細胞經過50μM CoCl2處理至第6天的形態學變化示意圖。
圖6C是Kasumi-1細胞經過50μM CoCl2誘導后對細胞表面抗原CD11b影響的示意圖。
圖6D是HL60細胞經50μM CoCl2處理后對其表面抗原CD11b影響的示意圖。
圖7是2％O2誘導U937細胞發生成熟相關的形態學改變示意圖。
圖8是CoCl2對來源于AML病人的新鮮白血病細胞的誘導分化情況的示意圖。
圖8A是用50μM的CoCl2處理6天后，對新鮮白血病細胞表面抗原CD11b表達的影響的示意圖。
圖8B是來自AML-M2型白血病病人的新鮮細胞，經過50μM的CoCl2處理6天后出現了明顯的形態學改變示意圖。
圖9是NB4細胞經過50μMCoCl2處理48小時以后，對C-myc和P53蛋白水水平的影響的示意圖。
圖10是50μM CoCl2處理后，對白血病細胞中HIF-1α蛋白水平的影響的示意圖。
圖11是用HIF-1α的特異性抑制劑SIN-1處理后，對白血病細胞NB4分化的影響的示意圖。
圖11A是SIN-1能夠明顯地抑制HIF-1α蛋白的穩定性表達示意圖。
圖11B是HIF-1α蛋白的特異性抑制劑SIN-1對NB4細胞生長的影響示意圖。
圖11C是HIF-1α蛋白的特異性抑制劑SIN-1降低CoCl2誘導的NB4細胞分化指標CD11b的表達示意圖。
具體實施例方式
現結合具體實驗及其結果分析和相應的說明書附圖，對本發明CoCl2在制備治療白血病的藥物中的應用作進一步詳細說明。
本發明涉及人轉錄調控因子的分離和功能研究，調控該轉錄因子表達的藥物、抗體等化合物和方法。轉錄調控因子可以廣泛定義為組成性和組織特異性的，其中之一是低氧誘導因子1(HIF-1)，該基因及其產物在表1所述的30多個基因的轉錄中具有重要作用。而且，低氧誘導因子1可能還在尚未發現的諸多基因的轉錄中發揮重要調控作用。
表1是將U937細胞放置于2％的O2中培養時，相應的細胞表面抗原的檢測。表1中所示的這些基因主要涉及血管形成、血管重建、葡萄糖和能量代謝、細胞的增殖及存活，紅細胞生成等。
表1 低氧誘導因子(HIF-1)的靶基因HIF-1參與的生理功能 HIF-1靶基因氧氣的運輸紅細胞生成 促紅細胞生成素運鐵蛋白運鐵蛋白受體氧氣的運輸新生血管的形成 血管內皮生長因子(VEGF)VEGF受體1(F1t-1)纖溶酶原激活物抑制劑內皮素-1一氧化碳合成酶血紅素氧化酶1α1B-腎上腺素能受體無氧酵解相關酶類 磷酸果糖激酶L醛縮酶A3磷酸甘油醛脫氫酶磷酸甘油酸激酶1烯醇化酶1乳糖脫氫酶A果糖轉移子-1HIF-1功能的負反饋調節P35SRJ(CBP/p300拮抗劑)其它 胰島素樣生長因子結合蛋白-1反轉錄轉座子VL30
大量研究認為，在人類生長發育的生理過程中，細胞及組織中的氧濃度的維持主要通過體內短期或長期的適應性反應信號來調節，以維持機體處于適宜的氧環境下。其中，轉錄因子HIF-1發揮了重要作用。HIF-1是由低氧敏感性的α-亞單位(HIF-1α)與基礎表達的β-亞單位(HIF-1β，也稱為ARNT)形成的異二聚體。
人體所有組織中均表達HIF-1α和HIF-1βmRNA。ARNT2主要是在大腦和腎臟中表達，而HIF-2α則主要在胚胎發生過程中的血管內皮細胞表達，同時在產生兒茶酚胺類細胞、腎臟以及肺臟也有表達。在正常鼠的生長發育過程中均有ARNT、HIF-1α和HIF-1β的參與。HIF-1α在機體的發育生長中發揮了重要作用。迄今為止，已經發現30多個基因受到HIF-1調節。
已知HIF-1α存在一個結合抑癌蛋白Von Hippel Lindar(VHL)的結構域。VHL是一個多蛋白復合體，具有E3泛素連接酶活性。它與HIF-1α的結合導致HIF-1α泛素化，并被細胞內的蛋白酶體系統降解。HIF-1α的564位和402位脯氨酸的羥化狀態調節α亞單位與VHL的結合能力，而涉及這個羥化反應的酶已被命名為HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶，其活性需要氧氣、二價鐵離子等的參與。
所以，在正常氧濃度時，HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶因O2的存在而激活，使HIF-1α中的564位脯氨酸殘基羥化。于是，VHL上的E3泛素連接酶結合脯氨酸羥化的HIF-1α，引發HIF-1α的降解。相反，低氧時，HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性因為氧的缺少而受到抑制，因此HIF-1α則不能被羥化，亦不能被VHL識別。于是，HIF-1α聚集，并通過其核定位信號轉移至細胞核與胞核內持續表達的HIF-1β亞單位結合形成異二聚體。形成的異二聚體與靶基因的低氧反應元件(HRE)結合，啟動某些基因如VEGF、EPO等的轉錄活性(參閱表1)，通過增加新生血管形成，調節葡萄糖代謝及轉移，降低氧耗量等，使細胞內、組織內的缺氧狀態得到改善，可知HIF-1α也是低氧反應信號途徑中一個關鍵的轉錄因子。
因此，可以利用低氧環境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，來篩選適當的藥物，尤其是可能的低氧模擬物，用于使白血病細胞進行分化，從而可達到治療白血病的目的。
以下為本發明的基本思路1.低氧模擬物的篩選、該低氧模擬物有效劑量的確定、及其是否誘導腫瘤細胞分化的確證。
通過細胞計數、細胞周期及annexin V檢測分析不同濃度的待測化合物對APL細胞系NB4細胞的生長及活力的影響。選擇能夠有效地抑制NB4細胞生長，并呈時間和劑量依賴性的低氧模擬物化合物CoCl2。根據早期細胞凋亡的重要分子標志annexinV陽性細胞有無明顯增加，確定待測化合物CoCl2最佳的作用濃度(見實施例1和實施例2)。在上述研究的基礎上，進一步觀察有效劑量范圍內的化合物是否誘導NB4細胞分化。
根據經待測化合物CoCl2處理一段時間后，腫瘤細胞呈現明顯的成熟、及相關的細胞形態學改變情況，如核染色質濃縮、核/漿比例減少、核變小并伴隨部分細胞核形的改變、能否見到核仁、受誘導的細胞是否表達與粒細胞分化相關的細胞表面抗原CD11b等，確定待測化合物是否促進腫瘤細胞分化。
2.檢測待測化合物CoCl2能否調控HIF-1α蛋白的穩定性。
為了檢測待測化合物誘導腫瘤細胞分化是否與HIF-1α存在著聯系，我們運用半定量RT-PCR技術和Western blot技術檢測待測化合物對細胞內HIF-1α的mRNA和蛋白的表達水平的可能影響(實施例3)。
3.確證待測化合物(CoCl2)的作用靶標是HIF-1α蛋白，以明確HIF-1α蛋白在待測化合物(CoCl2)誘導白血病細胞分化中的作用，即HIF-1α蛋白是否可用于篩選該待測化合物CoCl2。
為了明確HIF-1α蛋白是否參與了待測化合物(CoCl2)誘導的腫瘤(白血病)細胞分化過程，應用該蛋白的抑制劑來觀察其對細胞誘導效應的影響是目前生物學研究的常用方法。某些一氧化氮供體，如3-morpholinosychnonimine(SIN-1)能夠降低HIF-1α表達的穩定性，因此本發明檢測了在HIF-1α蛋白表達降低的前提下，其對待測化合物誘導分化效應的影響(實施例4)。
因此，本發明即欲通過相應的實驗及其結果來推證這樣的結論可將HIF-1α作為藥物靶標，來篩選能使HIF-1α的降解被抑制、從而對白血病細胞產生分化作用的藥物。
本發明采用下列具體實驗來進行證實，但是本發明的范圍并不僅限于下列實驗所公開的范圍。
實驗方法步驟一、預備待測化合物CoCl2制劑。
取購自上海化學試劑公司(上海，中國)的純度為99％的CoCl2，用滅菌后的雙蒸水配制成50mmol/L的儲存液，4℃保存，需每月新鮮配制以保持藥物的藥效。取0.1％的三氧化二砷(ATO)以少量1.0mol/L的NaOH溶解后，用PBS配制成5.0mmol/L的儲存液，4℃保存。取0.1％的一氧化氮供體3-morpholinosydnonimine(SIN-1)和全反式維甲酸(ATRA)分別用PBS和無水乙醇配制成10mmol/L和1mmol/L的儲存液，-20℃保存。
以上0.1％的三氧化二砷、全反式維甲酸和一氧化氮供體試劑均購自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。
步驟二、白血病細胞培養。
本研究采用的白血病細胞系包括存在t(15；17)和對ATRA敏感的APL細胞系NB4、無t(15；17)但對ATRA敏感的AML細胞系HL60、人類單核細胞性白血病細胞系U937以及攜帶t(8；21)融合基因的M2b型白血病細胞系Kasumi-1。原代細胞來源于通過形態學、免疫表型分析和細胞遺傳學檢測診斷后的各型AML病人骨髓，用淋巴細胞分離液從患者的骨髓中分離出單個核細胞后，再裂解紅細胞，洗滌后，以4-5×105/ml的起始濃度培養。
將上述白血病細胞系和處理以后的原代細胞分別接種于含10％胎牛血清(FBS)(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)、100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素和2mmol/ml谷氨酰胺的RPMI1640培養液(Sigma公司，St Louis，Missouri)中進行常規培養(37℃，5％CO2，/95％O2)。同時，每天換液以保持細胞濃度維持在2-5×105/ml的最佳生長狀態，并根據需要分別加入適量的待測化合物CoCl2制劑，準備單獨加入上述預備好的CoCl2、或同時加入CoCl2、三氧化二砷和/或全反式維甲酸的加藥組和不加入任何藥劑的對照組。
為了觀察低氧條件對白血病細胞的作用，將細胞放置于由90-93％的N2、5％CO2和2-5％O2組成的混合氣體產生的特殊低氧培養箱(Thermo Electron Corporation，Forma，Massachusetts)中，37℃培養。細胞的活力通過苔盼蘭拒染法檢測。
步驟三、流式細胞儀檢測細胞分化抗原表達。
自步驟二準備的各加藥組和對照組中分別取1×106細胞，PBS清洗兩次，加入熒光標記的抗人CD11b/FITC抗體和相應的同型對照抗體(均購自Coulter-Immunotech，Paris，France)10ul，于室溫避光反應30分鐘；PBS清洗一次。置于流式細胞儀檢測(Beckmon-Coulter，Miami，Florida)。
步驟四、細胞周期分析與凋亡指標的檢測。
自步驟二準備的各加藥組和對照組中分別收集約106細胞，PBS清洗兩次，經70％冷乙醇固定24小時以上后，再用PBS清洗兩次，加1％RNA酶37℃消化30分鐘。隨后，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)50ug/ml染色，經流式細胞儀檢測后，所得資料再經LYSIS II軟件(Beckon Dickson產品)收集處理分析。
根據Clontech公司提供的ApoAlert Annexin-V kit(Palo Alto，CA)檢測細胞凋亡，在步驟二準備的各加藥組和對照組中分別收集2×105細胞，用PBS洗一遍，加入200μl結合溶液并懸浮細胞，再加5μl AnnexinV和10μl PI(Propidium Iodine)置于室溫避光10分鐘，流式細胞儀(Beckmon-Coulter，Miami，Florida)檢測熒光強度。
步驟五、免疫熒光分析。
在步驟二準備的各加藥組和對照組中分別收集約106細胞，PBS清洗兩次，細胞涂片儀離心涂片，過夜自然涼干后，先用預冷丙酮4℃固定10分鐘，自然涼干20分鐘；用PBS預先孵育15分鐘，再用1∶400稀釋的抗人PML N端抗體(Santa Cruz，CA，USA)，37℃孵育1小時；PBS清洗3次，加1∶50稀釋的FITC標記的二抗(Santa Cruz，CA，USA)，37℃孵育1小時，PBS清洗3次，加抗淬滅劑，熒光顯微鏡(MRC-600 Confocal Imaging System；Bio-Rad MicroscienceLtd，Hertfordshire，UK)下進行觀察。
步驟六、Western蛋白印跡。
自步驟二準備的各加藥組和對照組中分別取2×106細胞，經PBS清洗、離心(2000rpm/min，5分鐘)沉淀后加入100ul 2×SDS上樣緩沖液(100mMTris堿，4％SDS，0.2％溴酚藍，20％甘油和5％β巰基乙醇)并超聲裂解細胞。細胞裂解產物經煮沸(5分鐘)后離心13000r/min 15分鐘，棄沉淀物，剩余的溶液即為抽取的蛋白質。蛋白質經Bradford法定量后上樣于8％SDS聚丙稀酰胺凝膠，電泳，常規轉膜，0.2％麗春紅染色估計轉移效率，膜經5％脫脂奶粉(0.1％Tween-20)室溫封閉1小時后，與相應一抗(包括HIF-1α、P53、RARα、C-myc)按一定的稀釋度室溫孵育2小時或4℃過夜，經PBS(含0.1％Tween-20)充分洗滌后與相應稀釋度的二抗室溫反應60分鐘，洗滌后經ECL試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，England)顯色。所用抗體均購自Santa Cruz公司。
步驟七、半定量RT-PCR。
在步驟二準備的各加藥組和對照組中分別收集1×107細胞，根據TRIzol kit(Invitrogen，Scotland，UK)抽提總RNA。以管家基因G3PDH為內參，取藥物處理的不同細胞的cDNA作為模板，采用G3PDH引物和基因特異性引物同時進行單管擴增的策略。擴增條件25ul反應體系95℃，5分鐘；94℃，30秒；55℃，40秒；72℃，60秒；72℃，10分鐘；30個循環。
HIF-1α的引物5’-CGTTGTGAGTGGTATTATTCAGC-3’5’-CAGTTTCTGTGTCGTTGCTGC-3’擴增1019bp-1265bp HIF-1αcDNA片段。
運用SmartView version 5.0軟件(Furi Corporation，上海，中國)對擴增的單個HIF-1α片段強度進行檢測，并與內參G3PDH比較分析得到樣本的表達強度。
步驟八、HIF-1αcDNA測序。
運用如下兩對引物擴增全長的HIF-1αcDNA(GenBank accessionno.NM-001530)①正向引物5’-ATTCACCATGGAGGGCGC-3’和反向引物5’-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3’；②正向引物5’-GATGCTTTAACTTTGCTGGC-3’和反向引物5’-TCAGTTAACTTGATCCAAAGCTC-3’。這兩對引物分別擴增HIF-1α的1-1265和1173-2481cDNA片段。
PCR擴增條件95℃，30秒；55℃，40秒；72℃，1分鐘，35個循環，用GeneAmp PCR System9600(Perkin-Elmer Norwalk，USA)。擴增后的產物構件至pGEM-T載體中(Promega，Madison)，最后在ABI377 DNA測序儀上檢測(Perkin-Elmer，Boston，Massachusetts)步驟九、cDNA-微陣列分析。
采用cDNA-微陣列方法，收集步驟二準備的各加藥組和對照組的NB4細胞，用Trizol抽提總RNA并經過RT-PCR獲取cDNA。步驟二準備的對照組以及加入CoCl2的加藥組分別用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標記，標記后的cDNA與帶有8464基因的基因芯片(BioStar H-80s，United Gene Co，Shanghai，China)進行雜交，并經過ScanArray4000激光掃描儀(Perkin-Elmer，Boston，Massachusetts)掃描。得到的圖象再經過GenePix Pro3.0(Axon，Union City，California)分析處理。首先對芯片上40個管家基因進行標準化參數分析后，通過計算機軟件分析得到相應每一個點的Cy5/Cy3比值，比值大于2者為上調基因，比值小于2者為下調基因。
實驗結果1.CoCl2對NB4細胞生長和活力的影響劑量-效應關系---實施例1。
CoCl2是一種模擬低氧環境的常用試劑，廣泛應用于低氧的研究。本發明首先通過細胞計數、細胞周期及annexinV檢測分析不同濃度(12.5-200μM)的CoCl2對APL細胞系NB4細胞的生長及活力的影響。如圖1A所示是不同濃度的CoCl2對NB4細胞生長影響的示意圖，從圖中可看出，CoCl2能夠有效地抑制NB4細胞生長，并呈時間和劑量依賴性。其中，如圖1B所示，100-200μM CoCl2明顯降低細胞活力，而12.5-50μM CoCl2對細胞活力無明顯影響。從圖1C和圖1D可進一步看出，12.5-50μM CoCl2并不明顯改變NB4細胞的細胞周期分布和誘導細胞凋亡，因為早期細胞凋亡的重要分子標志annexinV陽性細胞無明顯增加。
2.非毒性劑量的CoCl2誘導NB4細胞分化---實施例2。
在上述實驗研究的基礎上，本發明進一步觀察25-50μM CoCl2是否誘導NB4細胞分化。如圖2A所示，經25-50μM CoCl2處理6天后NB4細胞呈現明顯的成熟，且相關的細胞發生形態學改變，如核染色質濃縮、核/漿比例減少、核變小并伴隨部分細胞核形的改變，但是仍可見到核仁。更為重要的是，這些受誘導的細胞也表達與粒細胞分化相關的細胞表面抗原CD11b(圖2B)，提示非毒性作用濃度的CoCl2能夠在一定程度上促進NB4細胞分化。
3.CoCl2并不降解APL細胞特異的融合蛋白PML-RARα。
如前所述，95％以上的APL病人存在染色體易位t(15，17)，并表達PML-RARα融合蛋白。該融合蛋白與APL的發病具有重要關系。另一方面，PML-RARα融合蛋白的降解或剪切在ATRA或ATO誘導APL細胞分化和(或)凋亡中發揮了重要作用。
為此，本發明觀察了CoCl2是否也同樣調變PML-RARα蛋白的表達。以抗PML抗體進行的間接免疫熒光實驗顯示(圖3)，在未經任何藥物處理的NB4細胞中，由于存在特異融合蛋白PML-RARα形成的同二聚體或PML-RARα/PML異二聚體，呈現大量細小的顆粒彌散地分布于整個細胞核中。經過0.1μM ATRA和0.5μM ATO作用后，PML在細胞內的分布呈現明顯的改變。經0.1μM ATRA處理3天后的NB4細胞逐漸恢復PML在細胞內的正常分布，表現為熒光顆粒減少，顆粒直徑增大等；而經0.5μM ATO處理后可見細胞核內的熒光顆粒數量明顯地減少。然而，50μM CoCl2處理3天后的加藥組與對照組比較無明顯的改變，同時也不影響ATRA和ATO對融合蛋白的作用在白血病細胞內的定位。
如圖4所示，由Western blot證實，50μM CoCl2并不調變PML-RARα蛋白表達水平。但值得注意的是，經過ATRA和CoCl2共同處理的NB4細胞在72小時可見到PML-RARα蛋白的剪切片段，提示50μM CoCl2可加速ATRA引起的PML-RARα蛋白的剪切。
4.CoCl2加強ATRA和ATO對NB4細胞的誘導分化效應。
為了了解CoCl2對于ATRA和ATO誘導APL細胞分化效應的影響(圖5)，本發明進一步觀察了0.1μM ATRA和0.5μM ATO單獨以及聯合50μMCoCl2作用于NB4細胞的效應。結果顯示，50μM CoCl2聯合0.1μM ATRA處理NB4細胞4天后，CD11b和CD14的陽性細胞數比0.1μM ATRA單獨處理有明顯的增加，分別達到了97.23±0.58％和87.93±7.98％，而單獨用ATRA處理的只達到了81.4±2.17％和45.87±1.62％。因此，提示CoCl2和ATRA誘導NB4細胞分化的作用具有明顯的疊加效應。0.5μM ATO和50μM CoCl2的聯合運用也產生同樣的效果。
5.CoCl2和低氧誘導AML細胞分化的效應譜分析CoCl2誘導的細胞分化并不伴隨PML-RARα蛋白水平的調變，提示CoCl2模擬的低氧環境可能對其它類型的AML細胞系具有同樣的誘導分化效應。為此，我們選用了其它三種白血病細胞系即U937(M5型AML)、Kasumi-1(M2b型AML)和HL60(M3型AML)作為研究對象。結果顯示，25μM和50μM的CoCl2在抑制這三種細胞生長的同時，的確能有效地誘導U937細胞和Kasumi-1細胞分化。如圖6所示，經50μM的CoCl2處理6天的U937和Kasumi-1細胞，呈現明顯的形態學分化，同時伴隨有功能性分化指標CD11b的表達上升。但是CoCl2雖然也能抑制HL60細胞的生長但并不誘導HL60細胞分化。
6.2-3％的低氧環境對AML細胞分化的影響。
為了證實真正的低氧環境是否同樣也具有誘導這些白血病細胞系的分化作用，我們將NB4、U937和HL60分別置于2-5％O2和21％O2環境下培養。結果顯示，在2-3％的低氧環境下，NB4和U937細胞經過2至9天的培養，出現了明顯的形態學分化，同時伴隨有功能性分化指標CD11b的表達增加，而在5％和21％的低氧環境下則無類似的改變。如圖7所示，U937細胞在2％O2的環境下處理第4至第9天時，細胞體積明顯縮小，染色質濃縮，核/漿比例減小，核變小，核仁消失，尤其是某些細胞核的形狀還出現了明顯的馬蹄樣改變以及伴隨有粒系分化指標CD11b的表達上升(參表2)。然而這些分化相關的改變并不存在于在2-3％的低氧環境下培養的HL60細胞。
表2.U937細胞放置于2％O2培養時，相應的細胞表面抗原的檢測6天 9天21％O22％O221％O22％O2CD11b24.6±4.10 38.9±3.39 18.6±1.2250.27±5.90CD11c25.0±2.05 60.5±6.79 26.13±1.55 61.2±3.987.CoCl2誘導部分新鮮AML細胞分化。
由于細胞系經過體外的長時間培養，可能已經不能真正反映急性白血病細胞的特性。于是，本發明也研究了50μM CoCl2對來自3例存在t(15，17)的APL病人，4例存在t(8，21)的M2型病人，2例M4型病人和2例M5型病人的新鮮白血病細胞的體外效應。結果顯示，50μM的CoCl2單獨處理上述3例APL細胞并不能有效誘導其細胞分化，但在其中一例(case3)，CoCl2能加強0.1μM ATRA誘導的分化效應。另外，ATRA和ATO不能誘導其它8例AML病人原代細胞發生分化，但是50μM的CoCl2卻能誘導其中4例病人細胞發生分化，包括2例M2b型以及2例M4型病人。如圖8所示，是具有代表性的存在t(8，21)以及AML1-ETO轉錄本的AML-M2b型白血病病人原代細胞，經50μM CoCl2處理6天后出現了明顯的形態學分化。
8.CoCl2對NB4細胞基因表達譜的影響源于cDNA陣列的結果。
為了進一步探索低氧模擬環境下CoCl2誘導白血病細胞分化的分子機制，本發明運用cDNA micro array技術觀察了NB4細胞經過50μM的CoCl2處理及未處理3天時的基因表達量的變化。在功能已知的8000多個基因中，大多數基因的RNA水平無改變，包括P53以及C-myc等。后兩者經Western blot所證實(圖9)。但是，有68個基因下調2倍以上，這些基因主要涉及細胞代謝、細胞骨架、DNA合成和修復，調節細胞周期的進行以及誘導細胞凋亡等。受50μM CoCl2誘導后上調的基因只有二個，即白介素8(IL-8)和細胞因子C-X-C基元受體4(CXCR4)。基于以上初步發現，可以推測可能在低氧條件下，白血病細胞通過分泌某些因子促使其發生分化。但是，預先用CoCl2處理白血病細胞后的條件培養液并不能誘導這些細胞發生分化，提示低氧誘導的細胞分化可能是通過白血病細胞內的信號途徑而引發。
9.CoCl2能有效抑制NB4和U937細胞內HIF-1α蛋白的降解---
為了了解HIF-1α與CoCl2誘導的白血病細胞的分化是否存在著聯系，本發明運用半定量RT-PCR技術和Western blot技術檢測了CoCl2對細胞內HIF-1α的mRNA和蛋白的表達水平的可能影響(圖10)。結果顯示，50μM的CoCl2處理并不改變所有檢測的三種AML細胞系的HIF-1α的mRNA水平，但它能快速增加NB4和U937細胞中HIF-1α蛋白水平。因此，與大多數組織一樣，CoCl2有利于這兩種細胞穩定HIF-1α蛋白水平，值得一提的是，HL60細胞在mRNA水平也有HIF-1α的表達以及正常的HIF-1α cDNA序列，但CoCl2卻不誘導HL60細胞中HIF-1α蛋白的穩定表達。
10.抑制HIF-1α蛋白水平會明顯拮抗CoCl2的誘導分化效應---
為了進一步明確HIF-1α是否參與了CoCl2誘導的白血病細胞分化過程，應用該蛋白的抑制劑來觀察其對細胞誘導效應的影響是目前生物學研究的常用方法。根據文獻報道，某些一氧化氮供體，如3-morpholinosychnonimine(SIN-1)能夠降低HIF-1α表達的穩定性。因此，我們觀察了在HIF-1α蛋白表達降低的前提下，其對CoCl2誘導分化效應的影響(圖11)。結果顯示，500μM的SIN-1幾乎完全抑制HIF-1α在NB4和U937細胞中的聚集。與此同時，SIN-1在抑制NB4和U937細胞生長的同時，能有效地拮抗CoCl2誘導的細胞分化，因而可知HIF-1α介導或參與了低氧誘導的白血病細胞分化過程。
通過前述實驗及其結果分析可知，氯化鈷的使用量范圍為非毒性劑量，最優范圍為12.5-50μM，并可配合三氧化二砷或全反式維甲酸一起使用。三氧化二砷的使用劑量為10mg/日，靜脈活性；全反式維甲酸的使用劑量為25-45mg/日，一日一次。
本發明利用低氧環境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，將HIF-1α用于篩選適當的低氧模擬物，用于使白血病細胞進行分化，從而達到治療白血病的目的。
本發明利用低氧模擬物CoCl2可通過其自身造成一個低氧模擬環境的特性，或者可以直接將白血病細胞在低氧環境下經氯化鈷處理，通過抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得可以有效抑制白血病細胞中的HIF-1α降解，從而誘導白血病細胞分化，達到治療腫瘤、尤其是白血病的目的。
采用HIF-1基因的靶向治療可使缺氧組織中誘導新生血管生成，誘導HIF-1活性的小分子物質可保護因缺氧引起的細胞死亡，抑制HIF-1活性的小分子物質則可能有利于腫瘤和肺部高血壓的治療，因此，利用模擬低氧環境的小分子化合物可能對于AML具有治療潛力，而HIF-1a及其相關分子可能成為治療白血病的候選藥物靶標，可以根據不同的治療目的來選用不同的治療策略。
權利要求
1.HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其特征在于通過將HIF-1α作為藥物靶標，來篩選能使HIF-1α的降解被抑制、從而對白血病細胞產生分化作用的藥物。
2.如權利要求1所述的HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其特征在于利用低氧環境抑制HIF-1α-4-脯氨酰羥化酶的活性，使得HIF-1α的降解被抑制的特性，將HIF-1α用于篩選適當的低氧模擬物用于使白血病細胞進行分化。
3.如權利要求1或2所述的HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其特征在于利用HIF-1α作為藥物靶標，可篩選出氯化鈷用于實現對白血病細胞的分化作用。
4.如權利要求3所述的HIF-1α在治療白血病藥物的篩選中的應用，其特征在于所述白血病細胞是指NB4細胞、或U937細胞和各型AML細胞等。
全文摘要
本發明關于HIF－1α在誘導分化治療白血病藥物的篩選中的應用，其通過將HIF－1α作為藥物靶標，在低氧環境下來篩選可對白血病細胞產生分化作用的藥物。利用HIF－1α作為藥物靶標，可篩選出氯化鈷用于實現對白血病細胞的分化作用。所述白血病細胞是指NB4細胞、U937細胞及Kasumi細胞和各型AML細胞等。
文檔編號G01N33/68GK1523357SQ0315082
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月5日 優先權日2003年9月5日
發明者陳國強, 趙倩, 黃鶯 申請人:上海第二醫科大學附屬瑞金醫院