專利名稱：用于分析試劑的載體顆粒膠乳和分析試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于分析試劑的載體顆粒膠乳以及使用它的分析試劑，所述分析試劑能夠在免疫血清學檢驗中測定廣泛濃度范圍的生物樣品并可以穩定保存一段延長期。
背景技術：
在臨床實驗室檢驗領域，使用生物樣品(血，尿等)診斷各種疾病，作為用于診斷它們的方法，已經開發和使用了各種測定法。該測定法的代表是利用酶促反應的生物化學測定法和利用抗原-抗體反應的免疫測定法。作為在該診斷中使用的試劑，已經開發了有關妊娠試驗，檢測類風濕因子的RA檢驗，檢測C-反應蛋白的CRP檢驗以及針對乙型肝炎表面抗原(HBs抗原)，抗HBs抗體，β2微球蛋白抗體，支原體抗原，核酸，核蛋白，雌激素，抗雌激素抗體等的檢驗的試劑。
作為該測定法，可以舉例說明免疫濁度測定法(TIA法)，膠乳濁度測定法(LIA法)，酶免疫測定(EIA法)和放射免疫測定(RIA法)，并且取決于目的適當地選擇。
在上面列出的那些中，應用LIA法來檢測各種抗原和抗體，因為它是方便的并能夠被迅速實施，其中使用抗原或抗體將通過將載體顆粒分散至水性介質中形成的膠乳載體顆粒敏化，然后將其用來檢測作為載體顆粒聚集反應的與血清中相應抗體或抗原的反應。
醫療實踐最近的趨勢是從疾病的常規診斷向疾病預防轉變。因此，通過在疾病發作前檢驗血液等，預先鑒定疾病的誘因，由此實現預防。為了應用該預防醫療，在實行LIA法等過程中要求更高的靈敏度。盡管免疫血清學檢驗如抗原抗體反應最初測定少量物質，在預防醫療中使用的分析試劑應該能夠檢測更低濃度的疾病相關痕量蛋白(抗原和/或抗體)。因此，比當前使用的那些更靈敏的分析試劑變得必需。
鑒于上面討論的問題，已經目益改進用于測定少量樣品和少量試劑的免疫檢驗的自動免疫分析儀的儀器，并相應提出在該儀器中使用試劑更高靈敏度的要求。
作為提高該試劑靈敏度的方法，舉例說明一種方法，其中通過提高使用的載體顆粒的粒度由此提高光密度變化的數值來試圖以更高的靈敏度測定分析物。日本Kokoku出版物Sho-58-50645公開了用于生產膠乳的方法，其包含在沒有乳化劑的情況下在水中使用過硫酸鹽作為引發劑將苯乙烯與基于所述苯乙烯10％重量或更少的苯乙烯磺酸鹽共聚合，接著在堿性條件下加熱，表明通過增大基于苯乙烯單體的催化劑的量可以獲得由粒度為0.3-0.8μm的載體顆粒組成的膠乳。在另一方面，日本Kokoku出版物Hei-1-36484公開了通過在含有二價金屬氧化物或氫氧化物的水溶液中合成膠乳來生產診斷試劑的方法。
然而，使用包含大粒度載體顆粒的膠乳的方法涉及問題，即當分析物以高濃度存在時，由載體顆粒聚集導致的光密度變化超出可檢測范圍而不能獲得對應于分析物的量的光密度改變，它可能反映非特異性聚集反應并且此外，由于缺乏穩定性不能延長期保存。
在另一方面，日本Kokai出版物Sho-63-65369公開了使用膠乳試劑的方法，所述膠乳試劑是通過使用抗體或抗原敏化包含兩種或多種具有不同平均粒度的載體顆粒的膠乳并以一定比率混合而獲得的。該方法試圖取得具有兩種分布圖(profile)的性能，即基于包含小粒度載體顆粒的膠乳的廣泛范圍測定和基于由大粒度載體顆粒組成的膠乳的在低濃度范圍下的高靈敏度。
日本Kokoku出版物Sho-63-14783公開了由兩種具有不同粒度范圍的載體顆粒組成的膠乳，所述載體顆粒裝載至少兩種不同的量的相同抗原或抗體。
日本專利號2588174公開了測定抗原抗體反應的方法，其包含將膠乳與針對致敏性抗體的抗原或針對致敏性抗原的抗體在水中反應并測量在照射時吸光度的變化，所述膠乳是通過使用抗原或抗體敏化兩種或多種具有不同平均粒度的顆粒接著混合而獲得的膠乳或者是通過混合兩種或多種具有不同平均粒度的顆粒接著用抗原或抗體敏化而獲得的膠乳，其中混合平均粒度為0.05-0.3μm的載體顆粒和平均粒度為0.3-1.0μm的載體顆粒，并且其中所照射的光其波長至少是混合顆粒平均粒度的2.5倍，也就是0.6-2.4μm。
日本Kokai出版物Hei-5-18973公開了一種免疫測定法，其包含，取決于通過免疫反應待測的組分的量，將其中與待測組分反應的組分是不溶解的粒度為0.1μm或更小的載體顆粒與至少一種與待測組分反應的組分和其中活性組分是不溶解的粒度大于0.1μm的載體顆粒結合，并進行與含有待測組分的樣品的反應，以及在其中使用的試劑。
然而，使用由數種具有不同平均粒度的載體顆粒組成膠乳的該方法難以制備膠乳試劑，并且存在問題，即，即使相同操作者按照確定方案使用具有相同平均粒度和相同CV值的顆粒制備試劑，獲得的試劑在制劑性能方面一次一次不同。
發明概述本發明的目的是提供用于分析試劑的載體顆粒膠乳以及使用它的分析試劑，所述分析試劑在免疫血清學檢測中能夠測定廣泛濃度范圍的生物樣品并可以穩定保存一段延長期。
本發明的第一方面是用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒表面磺酸基的量為0.005-0.7μmol/m2，平均粒度為0.01-1.5μm。
本發明的第二方面是用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒包含兩種或多種具有不同表面磺酸基量的顆粒。在按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中，優選所述載體顆粒表面磺酸基的量為0.005-0.7μmol/m2。在按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中，優先所述載體顆粒包含表面磺酸基的量為0.005μmol/m2或更高并且小于0.12μmol/m2的載體顆粒(A)和表面磺酸基的量為0.12μmol/m2或更高和0.7μmol/m2或更小的載體顆粒(B)。在按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中，優選包含的載體顆粒(A)和載體顆粒(B)的重量比是由(A)/(B)＝1/10-10/1表示。
本發明的第三方面是用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒的平均粒度為0.04-0.1μm，粒度的CV值為8-20％。在按照本發明第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中，優先所述載體顆粒表面磺酸基的量為0.005-0.7μmol/m2。
優選按照本發明第一，第二或第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳基本上不含乳化劑。此外，在按照本發明第一，第二或第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中，優選具有苯基的可聚合單體是苯乙烯，具有苯基和磺酸基的可聚合單體是苯乙烯磺酸鹽。
本發明的第四方面是分析試劑，其中在按照本發明第一，第二或第三方面的分析試劑的載體顆粒膠乳的載體顆粒上承載與分析物特異性結合的物質。
附圖簡述

圖1顯示在制備實施例1至3和比較例1至4中制備的分析試劑后立即進行的樣品測定結果。
圖2顯示在實施例1至3和比較例1至4中制備的分析試劑的穩定性檢驗后進行的樣品測定結果。
圖3顯示在制備實施例4和比較例5中制備的分析試劑后立即進行的樣品測定結果。
圖4顯示在實施例4和比較例5中制備的分析試劑的穩定性檢驗后進行的樣品測定結果。
圖5顯示使用在實施例5至7中制備的試劑的樣品測定結果。
圖6顯示使用在比較例6至8中制備的試劑的樣品測定結果。
圖7顯示使用在實施例8至11中制備的試劑的樣品測定結果。
圖8顯示使用在比較例9至12中制備的試劑的樣品測定結果。
圖9顯示使用在實施例12(i)，比較例13和實施例13中制備的試劑的樣品測定結果。
圖10顯示使用在實施例12(j)，比較例13和實施例14中制備的試劑的樣品測定結果。
圖11顯示使用在實施例15至18中制備的試劑的樣品測定結果。
圖12顯示使用在實施例14至18中制備的試劑的樣品測定結果。
發明詳述下面詳述本發明。
本發明第一個方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳包含載體顆粒，其包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物。
不具體限制上述具有苯基的可聚合單體，其可包括例如苯乙烯，二乙烯基苯，乙基苯乙烯，α-甲基苯乙烯，對甲基苯乙烯，對氯苯乙烯，氯甲基苯乙烯等。它們可以單獨使用或它們中的兩種或多種結合使用。在以上所列中，優選使用苯乙烯。
不具體限制上述含有苯基和磺酸基的可聚合單體，只要它允許聚合后的載體顆粒表面含有磺酸基，并可包括例如苯乙烯磺酸鹽，二乙烯基苯磺酸鹽，乙基苯乙烯磺酸鹽，α-甲基苯乙烯磺酸鹽等。不具體限制在此提及的鹽，其可包括例如鈉鹽，鉀鹽，鋰鹽，銨鹽等。它們可以單獨使用或它們中的兩種或多種結合使用。在上面列出的那些中，優選苯乙烯磺酸鹽，更優選苯乙烯磺酸鈉。
通過將上述含有苯基的可聚合單體與上述含有苯基和磺酸基的可聚合單體共聚獲得上述載體顆粒。上述共聚方法可使用任何已知方法，如一種方法，其中將含有水作為溶劑的反應容器充滿上述含有苯基的可聚合單體，上述含有苯基和磺酸基的可聚合單體和聚合引發劑如果需要以及乳化劑，并在氮氣氛下攪拌反應物。在該情形中聚合溫度優選為50-100℃，更優選60-85℃。聚合時限通常是5-50小時，盡管它可能依賴于可聚合單體的組成和濃度條件以及聚合引發劑而變化。
不具體限制上述聚合引發劑，其可包括例如過硫酸鹽等。該過硫酸鹽可包括例如過硫酸鉀，過硫酸鈉，過硫酸銨等。不具體限制聚合引發劑的量，它通常是基于可聚合單體的0.01-1％重量。
通常優選不使用上述的乳化劑因為當在本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中含有乳化劑時測定的準確度受不利影響，這在例如在其中需要調整上述載體顆粒表面上磺酸基的量的情形中是允許的。然而，考慮到在聚合后的后處理步驟中去除，可以優選使用基于含有苯基的可聚合單體的1％重量或更少的量的乳化劑，更優選0.5％重量或更少，更加優選0.01-0.02％重量。
為了將顆粒表面磺酸基的量調整為0.005-0.7μmol/m2，基于上述含有苯基的可聚合單體，上述含有苯基和磺酸基的可聚合單體的量優選為2％重量或更少，更優選0.0001-1.5％重量，更加優選0.001-1.2％重量。通過以該比率將兩種組分共聚，可以將上述載體顆粒表面磺酸基的量調整在0.005-0.7μmol/m2。
取決于按照本發明用于分析試劑的載體顆粒膠乳的使用目的，在共聚時可加入另外的可聚合不飽和單體。不具體限制該可聚合不飽和單體，只要它可以用于普通的自由基聚合，其可以包括例如(甲基)丙烯酸，(甲基)丙烯酸酯(鹽)，苯乙烯衍生物，(甲基)丙烯腈，(甲基)丙烯酰胺，乙烯基鹵化物，乙烯基酯，(甲基)丙烯醛，馬來酸衍生物，富馬酸衍生物等。在本發明中，(甲基)丙烯酸指丙烯酸或甲基丙烯酸。
上述載體顆粒表面磺酸基的量為0.005-0.7μmol/m2。本發明人發現在上面指定范圍內的載體顆粒表面磺酸基的量導致分析靈敏度的顯著改善，允許從低濃度到高濃度廣泛范圍內測定作為分析物的痕量濃度蛋白，由此建立本發明。小于0.005μmol/m2的載體顆粒表面磺酸基量導致易發生非特異性聚集，而大于0.7μmol/m2的載體顆粒表面磺酸基量導致降低的聚集反應性，其導致低靈敏度。優選該量為0.02-0.5μmol/m2。通過電導率滴定法(Journal of Colloid and Interface Sciences，49(3)，425，1974)可以測定上述載體顆粒表面磺酸基的量。
上述載體顆粒的平均粒度是0.01-1.5μm。小于0.01μm的大小導致在聚集時光密度的太小變化，其導致難以獲得測定所需的靈敏度和此外在制備試劑時離心所需時間太多，其導致試劑成本增加。大于1.5μm的大小使得對高濃度分析物，載體顆粒聚集誘導的光密度變化超出可測量范圍，導致難以獲得相應于分析物的量的光密度的變化。盡管取決于使用用于分析試劑的載體顆粒膠乳的測定方法和裝置，載體顆粒的大小可以變化，它優選為0.03-0.8μm，更優選0.05-0.5μm。
上述載體顆粒粒度的變異系數(CV值)優選為10％或更小。大于10％的值可導致在制備試劑時差的lots重復性，其導致分析試劑重復性的降低。更優選它是5％或更小，特別是3％或更小。按照下列等式可以計算上述粒度的變異系數。
粒度變異系數(CV值)＝粒度的標準偏差/平均粒度通過將上述載體顆粒懸浮在水或水性溶劑中可以獲得按照本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳。盡管不具體限制按照本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中載體顆粒的濃度，它通常優選為1-20％重量。小于1％重量的濃度導致在制備試劑時需要濃縮步驟，而大于20％重量的濃度可導致聚集。
按照本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳優選基本上不含乳化劑，因為它可導致不利情況如對測定準確度的不良影響。在此使用的術語“基本上”意指當在生產載體顆粒中使用乳化劑時，在去除乳化劑的步驟后存在僅僅痕量的乳化劑是可接受的。
按照本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的載體顆粒表面磺酸基的量在上面指定的范圍內，其導致分析靈敏度的顯著改善，允許在從低濃度到高濃度的廣泛范圍內測定作為分析物的痕量濃度蛋白。此外由于它在延長期穩定性方面極好，它特別最適合于光學測量裝置。此外，不需要加糖類等來增大流體的比重，其在常規上為了避免任何沉降而被實施。
本發明的第二方面是用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒包含兩種或多種具有不同表面磺酸基的量的顆粒并基本上不含乳化劑。
上述含有苯基的可聚合單體與含有苯基和磺酸基的可聚合單體與本發明第一方面的那些類似。
在按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中，使用包含兩種或多種具有不同表面磺酸基的量的顆粒的載體顆粒。通過使用包含兩種或多種具有不同表面磺酸基的量的顆粒的載體顆粒，得到的分析試劑的載體顆粒膠乳能夠在從低濃度到高濃度的廣泛范圍內高敏感度和高準確度測定抗原抗體反應，因此適合于獲得同樣在延長期穩定性方面極好的試劑，特別是適合于光學測量裝置如分光光度計，濁度計，光散射光度計等的試劑。
按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的載體顆粒表面磺酸基的量優選為0.005-0.7μmol/m2。小于0.005μmol/m2的量導致易發生非特異性聚集，而大于0.7μmol/m2的量導致降低的聚集，并且導致低的靈敏度。優選該量為0.02-0.5μmol/m2。
優選按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的載體顆粒包含表面磺酸基的量為0.005μmol/m2或更高并且小于0.12μmol/m2的載體顆粒(A)和表面磺酸基的量為0.12μmol/m2或更高和0.7μmol/m2或更小的表面載體顆粒(B)。通過使用這種載體顆粒(A)和載體顆粒(B)的混合物，得到的分析試劑的載體顆粒膠乳能夠在從低濃度到高濃度的廣泛范圍內高靈敏度和高敏感度測定抗原抗體反應，提供延長期穩定性的進一步改善。
上述載體顆粒(A)的表面磺酸基的量小于0.005μmol/m2可導致作為最終產品的用于分析試劑的載體顆粒膠乳或分析試劑具有降低的延長期穩定性，并使得分析試劑容易進行非特異性聚集，而0.12μmol/m2或更高的量可導致在低濃度時難以測定。上述載體顆粒(B)的表面磺酸基的量小于0.12μmol/m2可導致在高濃度時難以測定，而大于0.7μmol/m2的量可導致作為最終產品的試劑免疫血清學的聚集減少，其導致測定不充分的靈敏度或準確度。
上述載體顆粒(A)和載體顆粒(B)的重量比優選為1/10-10/1重量。背離該范圍，不能獲得用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其適合于獲得被賦予上述優異性能組合的分析試劑。
優選按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中使用的載體顆粒的粒度為0.01-1.5μm。小于0.01μm的大小可導致在聚集時光密度變化太小和導致難以獲得測定所需的靈敏度和，此外在制備試劑時離心所需時間太多而導致試劑成本增加。大于1.5μm的大小使得在高濃度分析物存在條件下，聚集誘導的光密度變化超出可測量的范圍，導致難以獲得對應于高濃度分析物的量的光密度變化。大小優選為0.03-0.8μm，特別是0.05-0.5μm。在按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中使用的載體顆粒粒度的變異系數(CV值)優選為10％或更小。大于10％的值可導致在制備試劑時lots差的重復性，導致試劑重復性的降低。更優選它是5％或更小，特別是3％或更小。載體顆粒(A)的平均粒度可以是或不是類似于載體顆粒(B)的平均粒度。
生產按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中使用的載體顆粒的方法和生產按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的方法類似于在按照本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的情形中的方法。
通過使用兩種或多種表面磺酸基的量不同的顆粒，按照本發明第二方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳能夠在從低濃度到高濃度的廣泛范圍內高靈敏度和高準確度測定抗原抗體反應，因此適合于獲得同樣延長期穩定性方面優異的試劑，特別是適合于光學測量裝置如分光光度計，濁度計，光散射光度計等的試劑。
本發明的第三個方面是用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒的平均粒度為0.04-0.1μm，粒度的CV值為8-20％，并且其中基本上不含乳化劑。
上述含有苯基的可聚合單體與含有苯基和磺酸基的可聚合單體與本發明第一方面的那些類似。
在按照本發明第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中使用的載體顆粒的平均粒度為0.04-0.1μm，粒度的CV值為8-20％。通過使用這種具有控制在某一范圍內的平均粒度和粒度CV值的載體顆粒，得到的產物能夠在廣泛濃度范圍內測定抗原-抗體反應，同樣在延長期穩定性方面優異，此外適合于獲得能夠特別應用于光學測量裝置的免疫血清學檢驗的試劑。平均粒度小于0.4μm導致制備試劑所需周期延長，而大于0.1μm的尺寸導致增強的本底，其導致在低濃度下測定準確度降低。優選該尺寸為0.05-0.095μm。在另一方面，粒度的CV值小于8％使從低濃度到高濃度的廣泛范圍內不能測定，而值大于20％的值導致在離心后和在制備試劑時難以回收顆粒。優選該值為10-16％。
在按照本發明第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中使用的載體顆粒的表面磺酸基的量優選為0.005-0.7μmol/m2。小于0.005μmol/m2的量導致易發生非特異性聚集，而大于0.7μmol/m2的量導致降低的聚集，其導致低的靈敏度。優選該量為0.02-0.5μmol/m2。
生產在按照本發明第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳中使用的載體顆粒的方法和生產按照本發明第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的方法類似于在按照本發明第一方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳的情形中的方法。
通過使用具有控制在一定范圍內的平均粒度和粒度CV值的載體顆粒，按照本發明第三方面用于分析試劑的載體顆粒膠乳成為一種產品，其能夠在廣泛濃度范圍內測定抗原-抗體反應，此外在延長期穩定性方面是優異的，適合于獲得能特別應用于光學檢測裝置的免疫血清學檢驗的試劑。
本發明的第四方面是分析試劑，其中在按照本發明第一，第二和第三方面的分析試劑的載體顆粒膠乳的載體顆粒上承載與分析物特異性結合的物質。
不具體限制上述與分析物特異性結合的物質，只要它是免疫血清學檢驗試劑(在免疫聚集和聚集抑制反應中使用)或通常在生物化學測定中使用的生物活性物質，并優選是在抗原-抗體反應中可利用的一種。
上述在抗原-抗體反應中可利用的一種可包括例如蛋白質的抗原或抗體，核酸，核蛋白，雌激素脂類等。抗原可包括例如各種抗原，受體，酶等中的任何一種和β2微球蛋白，C-反應蛋白(CRP)，人血纖蛋白原，鐵蛋白，類風濕因子(RA)，α-胎蛋白(AFP)，支原體抗原，HBs抗原等。抗體可包括例如針對各種毒素和病原菌的各種抗體中的任何一種，抗-鏈球菌溶血素O抗體，抗雌激素抗體，β2微球蛋白抗體，梅毒密螺旋體抗體，針對梅毒密螺旋體脂質抗原的抗體，HBs抗體，HBc抗體，Hbe抗體等。除了免疫球蛋白分子它本身之外，抗體還可以是片段如F(ab′)2。
不具體限制使與分析物特異性結合的物質被承載在上述載體顆粒上的方法，在已知方法中可使用物理和/或化學鍵介導的承載方式(supportingmode)。
取決于使用的與分析物特異性結合的物質的類型，與分析物特異性結合并被承載在上述載體顆粒上的物質的量可以變化，并且不具體限制。
按照本發明第四方面的分析試劑可包含用于改善分析靈敏度和促進抗原-抗體反應的各種敏化劑。該敏化劑可包括例如烷基化多糖如在日本Kokai出版物Hei-2-173567中描述的甲基纖維素和乙基纖維素以及在日本Kokai出版物Hei-5-180838中描述的支鏈淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。
為了抑制由樣品中其它物質導致的非特異性聚集或為了提高試劑的穩定性，按照本發明第四方面的分析試劑可包含蛋白質或其降解產物如清蛋白(牛血清清蛋白，卵清蛋白)，酪蛋白，明膠等，氨基酸或表面活性劑。
按照本發明第四方面的分析試劑可以在使用適當稀釋劑稀釋后使用。該稀釋劑可以使用任何pH5.0-9.0的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，甘氨酸緩沖液，tris緩沖液，硼酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液等。
使用按照本發明第四方面的分析試劑，通過載體顆粒聚集度的光學測量可以測定樣品中分析物的反應量，所述聚集是由樣品中的分析物和與分析物特異性結合并且被承載在載體顆粒上的物質之間的反應導致。該光學測量可使用能夠檢測散射光密度，透射強度，吸光度等的任何光學裝置，特別是普通的自動生物化學分析儀。光學測量聚集度的方法可以是任何已知方法，如比濁法，其中將聚集的形成作為濁度的增加來監測，其中將聚集的形成作為粒子大小分布或平均粒度的變化來監測的方法，使用積分球(integrating sphere)的比濁法，其中使用積分球將比值(ratio)與透射強度比較來測定由于形成聚集導致的向前散射光的變化。同樣例證的測定方法是速率測定，其中聚集度的測定是基于在不同時間點獲得的至少兩個測量值之間測量值的增量(增加率)；和端點測定，其中聚集度的測定是基于在某一時間點的單個測量值(通常假定時間點為反應的終點)。在上面列出的那些中，優選比濁法因為可以便利地和迅速地進行測定。
實施本發明的最好模式在下列實施例中進一步詳述本發明，其不是意圖限制本發明。
(實施例1)[載體顆粒的制備]將裝有攪拌器，回流冷凝器，溫度計，氮氣入口管和套管的玻璃反應容器(2L)充滿1500g蒸餾水，280g苯乙烯，0.9g苯乙烯磺酸鈉和溶解在10g蒸餾水中的0.5g過硫酸鉀的水溶液，并用氮氣清洗，然后，攪拌同時在70℃進行聚合24小時。
完成聚合后，將溶液通過紙濾器過濾以獲得載體顆粒。通過下述方法測定得到的載體顆粒的粒度和表面磺酸基的量。在表1中顯示結果。
(測量載體粒度的方法)使用透射電子顯微鏡拍載體顆粒的相片，然后將其進行圖象分析以確定粒度。
(測定載體顆粒表面磺酸基的量的方法)使用玻璃紙管滲析膜將載體顆粒對凈化水滲析48小時，去除任何殘余的單體。稱量10g這些干顆粒放入4-頸玻璃容器中，用蒸餾水稀釋至150ml，使用攪拌器末端攪拌。將得到的溶液稱為溶液A。
然后，將N/100-氫氧化鈉(由WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES，LTD制造)放置于附加于電勢電導率滴定信息處理機(型號AT-310，由KYOTO ELECTRONICS MANUFACTURING CO.，LTD制造)的電子滴定管型號ATB-310之中，將電導率電極(conductivity electrode)浸于溶液A中，并放置氮氣入口管，排氣管和pH電極。然后滴入N/100-氫氧化鈉(滴速0.05ml/150-500秒基于待測的磺酸的量調整)，使用電勢電導率滴定信息處理機(型號AT-310)基于電導率的變化測定當量點，由此計算目的磺酸的量。
將通過使用得到的載體顆粒調整到5％(w/v)的250μl水溶液放置在8ml玻璃管中。向其中立即加入550μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生產，蛋白濃度12mg/mL)，并在37℃溫和攪拌1小時允許其被吸收。然后，立即加入450μl含有1.0％重量牛血清清蛋白(下文有時稱為BSA)的甘氨酸緩沖液(pH8.5)，37℃攪拌1小時進行封閉處理。
將封閉處理后的等分混懸液放置于8ml離心管中，4℃15000rpm離心30分鐘，去除上清液，將殘渣再分散于含有1.0％重量BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)，并進行兩次過量抗體處理。
將已經進行過量抗體處理的顆粒與2.5ml含有1.0％重量BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，在超聲破碎后，再與含有1.0％重量BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，調整終體積為30ml，由此制備分析試劑。
1)分析靈敏度的評估使用得到的分析試劑，測定在測量樣品時吸光度的變化。在測定中，每次樣品測量使用132μl分析試劑，和132μl作為樣品稀釋劑的含有1.0％重量BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以及2μl具有0.08-20mg/dl CRP濃度的樣品，由此測定每個樣品吸光度的變化。作為測量裝置，在檢測波長為800nm和光觀測點為2點-端21-34p(2point-end 21-34p)的條件下使用自動生物化學分析儀(由HITACHI LTD制造，型號7170自動分析儀)。圖1中顯示結果。
從圖1明顯的，這里獲得的分析試劑能夠高敏感測定從低濃度到高濃度范圍內的樣品。
2)試劑穩定性的評估將得到的分析試劑4℃保存6個月，然后使用CRP濃度為0.08-20mg/dl的樣品以與上述方法同樣的方式檢驗分析靈敏度。
在圖2中顯示結果。
從圖2明顯的，與在制備后即刻的分析試劑類似，甚至延長期保存后的分析試劑也能夠高度敏感測定從低濃度到高濃度范圍內的樣品，證明可以延長期穩定保持性能。
(實施例2至3，比較例1至4)除了充滿如在表1中顯示的蒸餾水，苯乙烯和苯乙烯磺酸鈉以外，以與實施例1中相同的方式生產載體顆粒。
以與實施例1中相同的方式測量得到的載體顆粒的粒度和表面磺酸基的量，結果在表1中顯示。
然后，以與實施例1中類似的每表面積敏化量制備含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)，制備用于每個實施例和比較例的分析試劑。
以與實施例1中相同的方式檢驗得到的試劑的分析靈敏度。結果在圖1中顯示。
從圖1明顯的，在實施例2和3中制備的分析試劑顯示與實施例1類似的滿意結果。相反，在比較例1至4中制備的分析試劑顯示低靈敏度。
然后將這里制備的試劑4℃保存6個月，以與實施例1相同的方式檢驗試劑的穩定性。結果在圖2中顯示。
從圖2明顯的，類似于以與實施例1相同的方式制備前所即刻顯示的，即使在延長期保存后，在實施例2和3中制備的試劑的任何一種能夠高靈敏度測定從低濃度到高濃度范圍內的樣品，因此顯示它可延長期穩定保持它的性能。相反，任何在比較例1至4中制備的試劑在延長期保存后，顯示與在制備后立即觀測的靈敏度相比更低的靈敏度，其反映試劑性能變差。
表1

(實施例4，比較例5)制備含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8..5)以使實施例3和比較例3中生產的載體顆粒每表面積的抗體敏化量分別成為基于實施例3和比較例3的那些的80％，并用來制備分析試劑，其分別被稱為實施例4和比較例5。
以與實施例1相同的方式檢驗得到的分析試劑的靈敏度，結果在圖3中顯示。
從圖3明顯的，實施例4中制備的分析試劑顯示與實施例1類似的滿意結果。相反，比較例5中制備的分析試劑顯示低敏感度。
然后將這里制備的試劑4℃保存6個月，以與實施例1相同的方式檢驗試劑的穩定性。結果在圖4中顯示。
從圖4明顯的，類似于制備前所即刻顯示，在實施例4中制備的試劑能夠高靈敏度測定從低濃度到高濃度范圍內的樣品，因此顯示它可延長期穩定保持它的性能。相反，在比較例5中制備的試劑在延長期保存后，顯示與在制備后立即觀測的靈敏度相比更低的靈敏度，其反映試劑性能變差。
(實施例5-7，比較例6-8)[載體顆粒的制備]將裝有攪拌器，冷卻旋管，溫度計，套管等的玻璃反應容器(2L)充滿原材料，其組成在表2中顯示，用氮氣清洗，在攪拌控制反應溫度為70-71℃的同時進行共聚合48小時。作為聚合的催化劑，使用溶解在10g蒸餾水中的0.5g過硫酸鉀的水溶液。在實施例5和6以及比較例6中使用非離子乳化劑(EMULGEN 804S，由Kao Corporation制造)，在實施例7和比較例7中使用陰離子乳化劑(NEOPELEX F-25，由KaoCorporation制造)。
取出得到的載體顆粒并類似于實施例1檢驗它們的粒度和表面磺酸基的量。
結果在表2中顯示。
表2
將通過使用實施例5中獲得的載體顆粒調整到5％的250μl水溶液放置在8ml玻璃管中，然后向其加入550μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生產，蛋白濃度12mg/mL，也稱為抗體溶液)，并在37℃攪拌1小時允許其被吸收，然后，與450μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，37℃攪拌60分鐘進行封閉處理。
將封閉處理后的等分混懸液放置于8ml離心管中，15000rpm離心50分鐘，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)中，并進行兩次過量抗體處理，與2.5ml含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，在超聲破碎后，然后再與含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合以使終體積為30ml，由此制備分析試劑。
除了制備含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使實施例6和7以及比較例6至8中生產的載體顆粒的每表面積抗體敏化量變得類似以外，以與實施例5相同的方式制備分析試劑。
在實施例5和比較例6中15000rpm進行離心50分鐘，在實施例6和比較例7中15000rpm離心45分鐘，在實施例7和比較例8中15000rpm離心38分鐘。
使用每種得到的分析試劑，在下面指定的條件下測定在測量CRP濃度為0.08-20mg/dl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖5和圖6中顯示。
儀器由HITACHI LTD制造，型號7170自動分析儀體積樣品2μL稀釋劑(R1)132μL(稀釋劑組成1％重量含BSA的甘氨酸緩沖液)分析試劑132μL檢測波長800nm光觀測點2點-端21-24p[載體顆粒的制備]將裝有攪拌器，冷卻旋管，溫度計，套管等的玻璃反應容器(2L)充滿在表3中顯示的一定數量的蒸餾水，苯乙烯和苯乙烯磺酸鈉，另外裝有溶解在10g蒸餾水中的0.5g過硫酸鈉(引發劑)水溶液，用氮氣清洗，在攪拌控制反應溫度為71℃-73℃的同時進行共聚合48小時，由此獲得6種類型的載體顆粒，即(a)至(f)。以與實施例1相同的方式測量每種得到的載體顆粒的粒度和表面磺酸基的量。結果在表3中顯示。
表3

(實施例8)[分析試劑的制備]使用將載體顆粒(a)和載體顆粒(b)的固體重量比調整至(a)/(b)＝1/10的載體顆粒，與蒸餾水結合將％固體調整為10％重量，將250ml等分試樣放置在8ml玻璃管中，然后向其加入170μl抗人CRP山羊血清(蛋白濃度18mg/mL，由DAKO生產，也稱為抗體溶液)，37℃攪拌1小時允許其被吸收，然后與2080μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，37℃攪拌60分鐘進行封閉處理。將封閉處理后的等分試樣放置于8ml離心管中，15000rpm離心50分鐘，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)中，并進行兩次過量抗體處理，然后與2.5ml含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，在超聲破碎后，再與含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，調整終體積為5ml，由此制備分析試劑。
使用每種得到的分析試劑，在下面指定的條件下測定在測量CRP濃度為0.08-20mg/dl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖7中顯示。
儀器由HITACHI LTD制造，型號7150自動分析儀體積樣品3μL稀釋劑(R1)270μL(稀釋劑組成1％重量含BSA的甘氨酸緩沖液)分析試劑90μL檢測波長800nm光觀測點2點-30-50p(實施例9)除了使用將載體顆粒(a)和載體顆粒(b)的固體重量比調整為(a)/(b)＝10/1的載體顆粒以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
(實施例10)除了使用將載體顆粒(c)和載體顆粒(d)的固體重量比調整為(c)/(d)＝1/10的載體顆粒以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
(實施例11)
除了使用將載體顆粒(c)和載體顆粒(d)的固體重量比調整為(c)/(d)＝10/1的載體顆粒以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
以與實施例8相同的方式檢驗實施例9至11中獲得的分析試劑的每一種它的性能(靈敏度)。結果在圖7中顯示。
(比較例9)除了僅使用載體顆粒(a)作為載體顆粒并制備含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使載體顆粒的每表面積抗體敏化量變得與實施例8中類似以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
(比較例10)除了僅使用載體顆粒(d)作為載體顆粒和制備含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使載體顆粒的每表面積抗體敏化量變得與實施例8中類似，并且還在15000rpm進行離心38分鐘以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
(比較例11)除了僅使用載體顆粒(e)作為載體顆粒并制備含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使載體顆粒的每表面積抗體敏化量變得與實施例8中類似以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
(比較例12)除了僅使用載體顆粒(f)作為載體顆粒和制備含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使載體顆粒的每表面積抗體敏化量變得與實施例8中類似，并且還在15000rpm進行離心38分鐘以外，以與實施例8相同的方式制備分析試劑。
以與實施例8相同的方式檢驗比較例9至12中獲得的分析試劑的每一種它的性能(靈敏度)。結果在圖8中顯示。
如從圖7明顯的，在實施例8至11中制備的分析試劑中的任何一種導致在0.08-20mg/dl CRP的廣泛濃度范圍內吸光度的顯著變化，其顯示優異的靈敏度。
相反，如從圖8明顯的，分別使用載體顆粒(a)，(e)和(f)作為唯一載體顆粒的比較例9，11和12的試劑的任何一種在0.08-20mg/dl CRP的廣泛濃度范圍內導致小的吸光度變化，其顯示差靈敏度。使用載體顆粒(d)作為唯一載體顆粒的比較例10的試劑在5-20mg/dl CRP的高濃度處導致小的吸光度變化，其顯示在高濃度處的差靈敏度。
將裝有攪拌器，冷卻旋管，溫度計，套管等的玻璃反應容器(2L)充滿在表4中顯示組成的原材料，用氮氣清洗，在攪拌控制反應溫度為71℃-73℃的同時進行共聚合48小時，由此獲得5種類型的載體顆粒，即(g)至(k)。以與實施例1相同的方式測量每種得到的載體顆粒的粒度和表面磺酸基的量。結果在表4中顯示。作為用于聚合的催化劑，使用溶解在10g蒸餾水中0.5g過硫酸鉀的水溶液。
表4
將250μl被調整為10％(w/v)載體顆粒(g)的水溶液放置在8ml玻璃管中，然后向其加入170μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生產，蛋白濃度18mg/mL，也稱為抗體溶液)，37℃攪拌1小時允許其被吸收，然后與2080μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，37℃攪拌60分鐘進行封閉處理。然后，將封閉處理后的等分試樣放置于8ml離心管中，18000rpm離心60分鐘，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)中，并進行兩次過量抗體處理，與2.5ml含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，在超聲破碎后，然后再與含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合以使終體積為5ml，由此制備分析試劑。
制備含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使載體顆粒(h)，(i)，(j)和(k)的每表面積抗體敏化量變得相似，以與載體顆粒(g)的相似的方式制備分析試劑。對于載體顆粒(h)進行18000rpm離心45分鐘，對于載體顆粒(i)和(j)15000rpm30分鐘和對于載體顆粒(k)18000rpm60分鐘。
(實施例12)使用由得到的載體顆粒(i)和(j)組成的分析試劑，在以下指定的條件下測定在測量CRP濃度為0.5-30mg/dl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖9和圖10中顯示。
儀器由HITACHI LTD制造，型號7150自動分析儀體積樣品3μL稀釋劑(R1)270μL(稀釋劑組成1％重量含BSA的甘氨酸緩沖液)分析試劑90μL檢測波長800nm光觀測點2點-30-50p(比較例13)使用含有得到的載體顆粒(k)的分析試劑，在與實施例12中類似的條件下測定在測量CRP濃度為0.5-30mg/dl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖9和圖10中顯示。
(實施例13)使用通過以1∶10的比率將包含得到的載體顆粒(g)的分析試劑和包含得到的載體顆粒(i)的分析試劑混合而獲得的混合物作為分析試劑，在與實施例12中類似的條件下測定在測量CRP濃度為0.5-30mg/dl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖9中顯示。
(實施例14)使用通過以1∶10的比率將包含得到的載體顆粒(h)的分析試劑和包含得到的載體顆粒(j)的分析試劑混合而獲得的混合物作為分析試劑，在與實施例12中類似的條件下測定在測量CRP濃度為0.5-30mg/dl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖10中顯示。
(實施例15至18，比較例14至18)[載體顆粒的制備]將裝有攪拌器，冷卻旋管，溫度計，套管等的玻璃反應容器(2L)裝滿原材料，其組成在表5中顯示，另外裝有溶解在10g蒸餾水中的0.5g過硫酸鉀(引發劑)的水溶液，用氮氣清洗，在攪拌控制反應溫度為71℃-73℃的同時進行共聚合48小時。
將得到的載體顆粒通過紙濾器過濾，檢驗粒度，計算平均粒度和CV值。基于通過透射電子顯微鏡觀察的圖像使用圖像分析儀確定此處的粒度。以與實施例1相同的方式確定表面磺酸基的量。
表5
將使用在實施例15中獲得的載體顆粒調整為10％(w/v)的250μl水溶液放置在8ml玻璃管中，然后向其加入170μl抗人CRP山羊血清(由DAKO生產，蛋白濃度18mg/mL，也稱為抗體溶液)，37℃攪拌1小時允許其被吸收，然后與2080μl含有BSA(牛血清清蛋白)的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，37℃攪拌60分鐘進行封閉處理。然后，將封閉處理后的等分試樣放置于8ml離心管中，18000rpm離心60分鐘，去除上清液，再分散于含有BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)中，并進行兩次過量抗體處理，與2.5ml含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合，在超聲破碎后，然后再與含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)結合以使終體積為5ml，由此制備分析試劑。
制備含BSA的甘氨酸緩沖液(pH8.5)以使在實施例16至18和比較例14至18中生產的載體顆粒的每表面積抗體敏化量變得相似，以與實施例15相同的方式制備分析試劑。
在實施例15和比較例18中進行18000rpm離心60分鐘，在實施例16和17以及比較例16和17中18000rpm70分鐘。
使用每種得到的分析試劑，在下面指定的條件下測定在測量CRP濃度為0.5-30mg/cl的樣品時觀測到的吸光度變化。
結果在圖11和圖12中顯示。
儀器由HITACHI LTD制造，型號7150自動分析儀體積樣品3μL稀釋劑(R1)270μL(稀釋劑組成1％重量含BSA的甘氨酸緩沖液)分析試劑90μL檢測波長800nm光觀測點2點-30-50p
工業適用性按照本發明，提供了用于分析試劑的載體顆粒膠乳和使用它的分析試劑，所述分析試劑能夠在免疫血清學檢驗中在廣泛濃度范圍內測定生物樣品并且可以延長期穩定保存。
權利要求
1.一種用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體和具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒具有0.005-0.7μmol/m2的表面磺酸基量和0.01-1.5μm的平均粒度。
2.一種用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體和含有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒包含兩種或多種具有不同表面磺酸基的量的顆粒。
3.按照權利要求2的用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其中所述載體顆粒具有0.005-0.7μmol/m2的表面磺酸基的量。
4.按照權利要求2或3的用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其中所述載體顆粒包含表面磺酸基的量為0.005μmol/m2或更高并且小于0.12μmol/m2的載體顆粒(A)和表面磺酸基的量為0.12μmol/m2或更高和0.7μmol/m2或更小的載體顆粒(B)。
5.按照權利要求4的用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其中包含的所述載體顆粒(A)與所述載體顆粒(B)的重量比由(A)/(B)＝1/10-10/1表示。
6.一種用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體與具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒具有0.04-0.1μm的平均粒度和8-20％的粒度的CV值。
7.按照權利要求6的用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其中所述載體顆粒表面磺酸基的量為0.005-0.7μmol/m2。
8.按照權利要求1，2，3，4，5，6或7的用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其基本上不含乳化劑。
9.按照權利要求1，2，3，4，5，6，7或8的用于分析試劑的載體顆粒膠乳，其中所述具有苯基的可聚合單體是苯乙烯并且所述具有苯基和磺酸基的可聚合單體是苯乙烯磺酸鹽。
10.一種分析試劑，其中在按照權利要求1，2，3，4，5，6，7，8或9的用于分析試劑的載體顆粒膠乳的載體顆粒上承載與分析物特異性結合的物質。
全文摘要
本發明的目的是提供一種用于分析試劑的載體顆粒膠乳以及使用它的分析試劑，所述分析試劑能夠在免疫血清學檢驗中在廣泛濃度范圍內測定生物樣品并可以延長期穩定保存。本發明是一種用于分析試劑的包含載體顆粒的載體顆粒膠乳，所述載體顆粒包含具有苯基的可聚合單體和具有苯基和磺酸基的可聚合單體的共聚物，其中所述載體顆粒表面磺酸基的量為0.005－0.7μmol/m
文檔編號G01N33/543GK1522370SQ0281335
公開日2004年8月18日 申請日期2002年7月2日 優先權日2001年7月2日
發明者尾花敏 申請人:積水化學工業株式會社