專利名稱：熒光標記的高分子微球及其制備方法
技術領域：
本發明是一種吸附或者鍵合有熒光分子或熒光探針的熒光標記高分子微球及其制備方法。
高分子微球具有許多獨特的優點比表面積大；微球粒徑大小均一且可控制；聚合物來源廣泛，包括天然及合成高分子；可選擇各種共聚功能單體和聚合工藝，進行高分子微球設計等。因此，功能化的高分子微球(Functionalized PolymericMicrospheres)可廣泛應用于許多領域，如生物化學和生物醫學方面的藥物定向輸送，醫用膠乳試劑，生物分子標記與示蹤等，高性能聚合物涂料與油墨，有機／無機復合材料(Polymer Composites)，微膠囊化，聚合物微孔材料，催化、吸附及分離載體(如色譜柱填料)，以及作為信息工業和微電子工業等用途的尖端材料，此方向的研究已成為近年來的在材料學，高分子化學與物理學，生物學及生命學科等交叉學科領域的前沿命題，在生物、醫學、藥學、食品、化工等方面具有廣泛的應用前景。
高分子微球的尺度可分為納米級，亞微米級和微米級等。不同粒徑的微球對應于不同的用途。多年來的研究表明，高分子微球可在膠體分散體系中進行聚合制備(其產物亦稱聚合物膠粒，Latex particles)如較為成熟的乳液聚合(EmulsionPolymerization)方法可制備亞微米級微球；分散聚合(Dispersion Polymerization)可合成微米級單分散高分子微球；興起于八十年代初的微乳液聚合則是一種直接制備5-80nm聚合物納米粒子的簡單易行的新型聚合方法。微球的尺寸和結構(如核殼結構等)可通過不同的聚合方法及反應條件加以控制。熒光納米微球的研究報導也僅局限于無機或金屬納米粒子，見J．Phys．Chem．B，1999，103，9080)，但存在著濃度稀，合成效率低，成本高的不足，而且由于微球制備的效率低，使熒光標記的效果也大大下降。一般來說，目前探針的標記方法主要有兩種放射性同位素標記及非放射性標記。其中放射性同位素的缺點是易造成放射性污染，非放射性標記則面臨著重復性差，成本高，或靈敏度較低等問題。
本發明的目的是發明一種熒光標記的高分子微球。
本發明的目的是發明一種方法簡便、效率高的熒光標記的高分子微球的制備方法，包括微球制備和微球的熒光標記。
本發明的熒光標記的高分子微球有三種尺寸大小納米級高分子微球是5-60nm，亞微米級高分子微球尺寸是60nm-1μm，微米級高分子微球尺寸是1μm-20μm，在上述高分子微球上吸附或者化學鍵合有熒光染料分子或熒光探針分子，該類微球可用于生物分子研究中的熒光探針，實現熒光信號的可控放大。
本發明用微乳液聚合方法制備高分子納米微球，包括正相(水包油，O／W)體系制備疏水聚合物納米微球，如聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯等；反相(油包水，W／O)體系可制備親水性聚合物納米微球如聚丙烯酰胺，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸羥乙酯等。正相體系制備納米微球采用一種改進的高固含量微乳液聚合方法先將少量約1／3的單體、乳化劑、連續相配成均相微乳液，將該微乳液攪拌并升溫至25-80℃，然后體系通N2氣5-10分鐘后加入引發劑，同時將剩余單體、功能單體逐滴加入反應體系中，維持1-6小時內滴完，以400-650轉／分速度攪拌，滴加完畢繼續反應0．5-3．5小時即可。反應體系中正相反應各反應物濃度是乳化劑濃度0．1-30wt％，單體濃度1-50wt％，功能單體濃度0．2-20wt％，引發劑濃度0．5-10mM(以體系為100ml計算)，其余為連續相去離子水。反相反應體系將全部單體、乳化劑、水和連續相配成均相微乳液，然后攪拌升溫至25-80℃，體系通N2氣后加入引發劑引發聚合，其余條件與步驟同正相體系。反相反應各反應物濃度是乳化劑濃度2-40wt％，單體濃度1-15wt％，功能單體濃度0．2-8wt％，水的濃度2-15wt％，引發劑濃度0．5-10mM(以體系為100ml計算)，其余為油性連續相。加入功能單體的目的是使高分子微球上帶反應性的官能團，這些官能團可與熒光分子化學鍵合，然后剩余的官能團繼續與生物分子鍵合；或微球吸附熒光分子后，其表面官能團能與生物分子鍵合。不同性質和聚合活性的單體如帶羧基(-COOH)的甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸(AA)或衣康酸(IA)等，帶羥基(-OH)的甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)以及含雙鍵的聚氧乙烯大單體等，含環氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)，有胺基的甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)，甲基丙烯酸二乙胺基乙酯(DEAEM)與甲基丙烯酸叔丁基胺乙酯(TBAEM)，含醛基(-CHO)的丙烯醛(acrolein，AL)，含氰基的氰基丙烯酸酯(alkylcyanoacrylate，AN)，含異氰酸酯基(-NCO)的TMI(dimethyl meta-isopropenyl benzyl isocyanate，美國Cytec公司)，乙烯基吡啶(vinylpyridine，VP)等等。
正相體系采用的乳化劑有陰離子型的十二烷基硫酸鈉(SDS)，非離子型的壬基酚聚氧乙烯醚(NP系列)，辛基酚聚氧乙烯醚(OP系列)，吐溫(Tween)，斯盤(Span)等，陽離子型的十六烷基溴化銨(CTAB)以及兩親性的卵磷脂(lecithin)，以及它們的復配體系等，另外還可加入助乳化劑如正戊醇等。單體可為St，MMA等，功能性共聚單體可為含羧基的MAA，AA或IA等，含羥基的HEMA或HPMA，以及含雙鍵的聚氧乙烯大單體等，含環氧基的GMA，含胺基的AEM或TBAEM等，含醛基的丙烯醛，含氰基的AN，含異氰酸酯基的TMI，乙烯基吡啶(VP)等等。采用的引發體系有水溶性的過硫酸銨(APS)，過硫酸鉀(KPS)，V-50(WakoChemicals)，油溶性的過氧化二苯甲酰(BPO)，偶氮二異丁腈(AIBN)，芳基偶氮氨基化合物，芳基偶氮硫醚等，以及氧化還原引發體系如過硫酸銨(APS)／四甲基乙二胺(TMEDA)，Vitamin C／雙氧水，亞鐵鹽／雙氧水，二甲基苯胺／BPO等。
反相體系采用的乳化劑有磺基琥珀酸鹽(AOT)，吐溫(Tween)，斯盤(Span)，以及它們的復配體系等，還可加入一些醇類助乳化劑如丙醇(Propanol)，環己醇(Cyclohexanol)，辛醇(Octanol)等。單體可為AM，AA，MAA，NaAA，HEMA等。油性連續相采用苯類試劑如甲苯(Toluene)，二甲苯(Zylene)等，烷烴類的癸烷(decane)，庚烷(Heptane)等，以及煤油，石蠟油等等。使用的引發體系有AIBN，BPO，KPS，UV光引發劑如二苯酮(BPH)等。合成方法為常規的反相微乳液聚合，即一次性將單體、乳化劑、水和連續相配成均相微乳液，然后引發進行聚合反應，乳化劑濃度為2-40wt％，油性連續相濃度為20-70wt％，單體濃度為1-15wt％，水的濃度為2-15wt％。由于反相體系使用的多數親水性單體自身就含有羧基、羥基等官能團，因此制備的微膠乳粒子可直接成為功能化的親水性高分子納米微球加以使用，其粒徑在5-60nm之間。將反應獲得的納米微球按通常的吸附或者化學鍵合方法，結合熒光染料分子或者熒光探針分子即可。
采用常規乳液聚合制備功能化高分子亞微米級微球正如微乳液體系一樣，乳液聚合也可分為正相(水包油，O／W)和反相(油包水，W／O)乳液聚合，其體系構成如單體、乳化劑(助乳化劑)、引發劑等基本與微乳液體系相同。兩者的不同之處在于乳液體系的乳化劑含量一般遠低于微乳液體系，為0．1-3wt％，單體濃度一般在10-50wt％，制備的膠乳粒徑在亞微米級60nm-1μm。具體的乳液聚合體系組成可參考上面的微乳液體系。
此外，我們還可利用種子乳液聚合和無皂乳液聚合制備單分散的亞微米級功能化膠乳。無皂乳液聚合制備的的功能化膠粒由于表面基本無乳化劑覆蓋，十分有利于下一步的功能化。種子乳液聚合分兩步進行第一步先合成單分散的小粒徑的種子乳液，第二步加入適量的單體、乳化劑充分溶脹后，加入引發劑反應。種子乳液聚合采用的體系與常規的乳液聚合配方基本一致，第二步反應只是在第一步得到的乳膠粒子上繼續生長，這樣便可制備尺寸較大(D＞140nm)的單分散聚合物膠乳。無皂乳液聚合即不加乳化劑直接將單體在水分散體中聚合，高分子鏈端的帶電荷引發劑碎片等可穩定產物膠乳粒子。無皂乳液聚合體系也與常規乳液聚合相似，只是不加乳化劑，一般單體的濃度為1-15wt％，引發劑濃度為1-8mM，還經常加入一些pH調節劑如0．1-1mM的碳酸氫鈉，其余為去離子水。反應得到的膠粒尺寸在數百納米左右。然后用吸附法或者化學鍵合法結合熒光染料分子或熒光探針分子即可。
制備功能化的微米級微球在分散共聚合體系中進行，體系中主單體為1-40wt％，功能性單體為0．5-20wt％，分散穩定劑為0．001-3wt％，引發劑濃度范圍是0．01-5wt％，此法可簡便制得0．8-20μm的窄分布聚合物微球。
若在極性介質中進行的分散聚合，可制備窄分布的微米級高分子微球，極性介質如甲醇，乙醇，乙醇／水，乙醇／乙氧基乙醇等。
采用分散聚合技術制備功能化高分子微米級微球應用的分散介質醇類如乙醇，甲醇，丙醇等，醇／水介質體系，脂肪烴類等。單體是苯乙烯類單體，甲基丙烯酸酯類單體，丙烯酸類單體以及其它類單體，如乙烯基吡啶(VP)等。功能性共聚單體可為含羧基的甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸(AA)或衣康酸(IA)等，含羥基的甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)，以及含雙鍵的聚氧乙烯大單體等，含環氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)，有胺基的甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)，甲基丙烯酸二乙胺基乙酯(DEAEM)與甲基丙烯酸叔丁基胺乙酯(TBAEM)，含醛基(-CHO)的丙烯醛(acrolein，AL)，含氰基的氰基丙烯酸酯(alkylcyanoacrylate，AN)，含異氰酸酯基(-NCO)的TMI(dimethyl meta-isopropenyl benzyl isocyanate，美國Cytec公司)等等。引發劑是油溶性的過氧化二苯甲酰(BPO)，偶氮二異丁腈(AIBN)，芳基偶氮氨基化合物，芳基偶氮硫醚等，以及氧化還原引發體系如過硫酸銨(APS)／四甲基乙二胺(TMEDA)，Vitamin C／雙氧水，亞鐵鹽／雙氧水，二甲基苯胺／BPO等。分散穩定劑有聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，羥基纖維素類(如HPC)和聚丙烯酸(PAA)等，以及AB型和ABA型嵌段共聚物(如PSt-b-PHEMA)。制得的微米級微球用吸附法或者化學鍵合法結合熒光染料分子或熒光探針分子即可。
本發明合成過程采用的常規主單體如苯乙烯(St)，甲基丙烯酸酯類單體如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等，及親水性單體丙烯酰胺類單體如丙烯酰胺(AM)，N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)，丙烯酸(AA)，丙烯酸鈉(NaAA)，甲基丙烯酸(MAA)等；交聯劑為二甲基丙烯酸酯類(如EGDMA)，三甲基丙烯酸酯類，二乙烯基苯(DVB)等；另外還使用一些不同性質官能團和聚合活性的功能單體。
在上述高分子微球上結合熒光染料分子(Fluorescent Dyes)或其它熒光探針分子，便可以得到從納米至微米級尺度的熒光高分子微球。熒光分子與微球的結合方式可分為吸附和化學鍵合兩種。可廣泛采用各種熒光分子如熒光素(Fluorescein，如FITC等)，若丹明(Phodamine，如Rhodamine Red-X，Rhodamine 6G)，青色素(Cyaninedyes，如Cy2，Cy3，Cy5)，Texas Red(TR)，Tetramethyl RhodamineIsothiocyanate(TRITC)，YOYO，Nile系列(Blue，red等)(胺基)，蛋白熒光試劑如二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)，熒光胺等，或熒光探針分子芘(Pyrene)，或改性的芘類探針如PyCORf，pyranine等。
本發明吸附法結合熒光分子的條件是將高分子微球加入含熒光染料分子或熒光探針分子的乙醇溶液中，此吸附液中一般熒光分子的濃度是0．1-1wt％，將4．5-8ml濃度是0．5-2wt％高分子微球稀釋液加入0．5ml熒光分子的乙醇溶液中，在20-50℃溫度下攪拌2-5小時，然后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的熒光分子和少量游離的乳化劑分子及引發劑碎片離子。產物用pH=7-7．5的40-50mM磷酸緩沖液稀釋103-104倍即可。
化學鍵合法的條件是將聚合好的高分子膠乳破乳，離心沉淀。分離沉淀物，用水洗滌沉淀物，再在真空烘箱中干燥以除去小分子，提高制備效率，然后在熒光分子的溶液中反應3-5小時，反應溫度40-70℃，反應結束后再將產物反應液分散滴加入水中，待有微球析出時收集微球，再加入少量乳化劑如壬基酚聚氧乙烯醚(NP)或吐溫(Tween)，重新分散至pH=7-7．5的40-50mM磷酸緩沖液中稀釋103-104倍即可。反應液中高分子微球濃度是0．1-1wt％，熒光分子濃度是0．01-0．1wt％，反應溶劑可以是酮類如丁酮。帶羥基的功能化高分子微球與熒光分子FITC的化學鍵合反應可用以下示意圖表示
羥基功能化高分子納米微球與FITC在丁酮中的反應高分子微球化學鍵合熒光染料分子或熒光探針分子也可以在惰性溶劑中進行，如二甲苯、醋酸丁酯等。
熒光高分子微球表面剩余的官能團可與生物分子上的官能團發生化學鍵合反應而產生牢固的偶合。可將熒光高分子微球分散于緩沖液中，通過直接鍵合，偶聯試劑或活化試劑與生物分子結合。例如微球表面的-COOH可在DCCI存在下，用N-羥基琥珀酰亞胺活化，與生物分子如蛋白上的-NH2發生反應而鍵合；微球上的-NH2可用戊二醛偶聯與蛋白上的-NH2鍵合；微球上的-OH也可與生物分子上的-COOH反應鍵合，或與溴化氰生成亞胺再與生物分子上的氨基鍵合，等等。
已接上熒光分子的高分子微球還可與一些非放射性標記物通過化學鍵合或吸附法進一步功能化，成為熒光微球探針，如生物素(biotin)或親和素(avidin)，地高辛(digoxigenin)，光生物素(photobiotin)，補骨脂素，接一些抗體或抗原、受體或配基及蛋白等等。例如親和素可以很強地吸附于PSt或PMMA微球上。需要時也可接一段較長的連接臂(Spacer)，使熒光標記微球與生物分子連接時不會因臂短而產生構象障礙或導致失活，可采用的試劑為EZ-linkTMNHS-LC-Biotin(Pierce，Co．)或兩端基為-NHS的偶聯試劑，對含羥基微球也可先與溴化氰反應，再用ε-氨基葵酸作為“手臂”，產物的端羧基活化后便可與生物分子的氨基反應而鍵合。經親和素修飾的熒光微球可與生物素化的寡核苷酸鏈或DNA鏈產生特異性結合，用于DNA微矩陣(DNAMicroarray)及基因芯片的熒光信號檢測，可通過熒光信號的放大，提高檢測靈敏度。
本發明合成的熒光高分子微球的突出特點是高分子微球作為熒光信號放大的載體，即每個微球上連接了大量熒光分子，其用途十分廣泛，至少在以下生命科學的前沿領域有著極有吸引力的產業化實用價值其一為基因芯片(Genomic Chips)或生物芯片(Bio-chips)的熒光信號放大載體，成為結構和功能基因組學研究的有力工具。目前，基因芯片技術中原位雜交熒光檢測采用的是單熒光分子PCR的標記手段，寡聚核苷酸鏈(Oligonucleotide)上只能標記很有限的熒光分子(如Cyanine dyes，Fluorescein等)，因此熒光信號很弱，需要采用激光共聚焦顯微鏡等復雜的熒光檢測技術，設備價格昂貴且檢測過程需很長時間，效率較低。納米級高分子微球的尺寸與生物分子如核苷酸，蛋白質等尺度相當，表面連接或包埋大量熒光分子(10-103個數量級／微球)的此類聚合物微球接于DNA核苷酸鏈上，便可替代以上的傳統芯片雜交熒光標記技術，并實現熒光信號呈數量級的放大，用一般的熒光顯微鏡加CCD圖象分析系統就能快速簡便進行檢測，從而大為降低基因芯片的成本，為其大規模普遍的臨床應用鋪平道路，具有突破性意義。其二為不同粒徑的熒光高分子微球在細胞組織功能，分子生物學，蛋白質功能組學，酶固定和臨床診斷等方面的廣泛應用價值。熒光高分子微球同樣可標記蛋白質及活性的生物分子或組織如細胞等，并實現在活性條件下的示蹤，也可固定蛋白質分子并跟蹤其功能化過程等等。
本發明采用微乳液、乳液和分散聚合方法可制得從納米級到微米級的高分子微球，方法簡便，效率提高，且合成的熒光高分子微球對生物組織細胞無特異親合性，對探針雜交影響甚小或基本無影響，在生命科學領域中有重要的應用價值和發展前景。
實施例一含羧基熒光高分子納米微球的制備熒光高分子納米微球的制備可分為兩個步驟微乳液聚合方法合成功能化納米微球及納米微球接上熒光分子。1．微乳液聚合制備功能化納米級高分子微球采用改進型高固含量微乳液聚合技術合成高濃度的功能化高分子納米膠乳。實施例一具體采用的微乳液聚合體系參見下表表1．微乳液聚合制備含羧基的高分子納米膠乳體系配方(每100份重量)*
*比例為重量百分數，反應溫度60℃。
合成步驟為先將少部分St單體與乳化劑、助乳化劑、去離子水配成均相透明的微乳液(預微乳液)；將預微乳液攪拌并升溫至60℃，體系通氮氣5分鐘，加入引發劑，引發體系開始聚合；引發開始后，即將大部分單體，全部交聯劑和功能單體的混合液以很慢速度逐滴滴入正在聚合的體系中，維持60℃和N2氛，攪拌速度約為600轉／分，1-4小時滴完。然后繼續反應1-3小時，使單體反應完全，結束反應。微膠乳產物為淡藍色半透明狀膠乳，用Malvem 4700光散射儀測得膠乳粒子的粒徑為28nm，微球表面含羧基。2．熒光高分子納米微球的制備實施例一采用的熒光分子為FITC，可通過吸附作用或直接化學鍵合與含羧基納米微球結合。
吸附法將4．5ml濃度為0．5-2wt％微球帶羧基的高分子納米膠乳加入0．5mlFITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持攪拌。體系攪拌2-5小時后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的熒光分子和少量游離的乳化劑分子及引發劑碎片離子。產物用pH=7．5的50mM磷酸緩沖液稀釋104倍，即可用于生物分子的標記。
化學鍵合法功能化高分子納米膠乳用大量甲醇破乳，離心沉淀。沉淀物分離出來后用大量的水和甲醇反復洗滌數次，然后在真空烘箱中干燥以除去小分子。整個分離純化過程溫度控制低于50℃。FITC所含-NCS可與微球上的羧基產生化學反應而鍵合，反應在40-70℃的丁酮溶液中進行，FITC量為2mg，羧基微球的濃度為5mg／ml(丁酮)，反應可在惰性有機溶劑如二甲苯、醋酸丁酯、酮類等中進行，反應3-5小時后停止。將熒光高分子微球的丁酮分散液逐滴加入水中，在界面處有固體微球析出，收集這些微球再加少量NP或Tween乳化劑重新分散至pH=7．5的50mM磷酸緩沖液，稀釋103倍后即可用于生物分子的標記。另外，還可將將親和素(Avidin)加入納米級熒光微球分散液，通過蛋白的強吸附作用進一步功能化，成為親和素標記的熒光高分子微球，可與生物素(biotin)特異性結合，作為生物分子如核酸雜交的熒光探針。實施例二含羥基與吡啶基的熒光高分子納米微球的制備1．微乳液聚合制備功能化納米級高分子微球如上例仍采用改進型高固含量微乳液聚合技術，具體采用非離子乳化劑壬基酚聚氧乙烯醚(NP系列)，及氧化還原引發的微乳液聚合體系，參見下表表2．微乳液聚合制備含羧基與吡啶基的高分子納米膠乳體系配方(每100份重量)*<
>*比例為重量百分數，反應溫度25℃。
合成步驟為先將少部分St單體與復配乳化劑、去離子水配成均相透明的微乳液(預微乳液)；將預微乳液攪拌并恒溫在25℃，體系通氮氣5分鐘，加入引發劑，引發體系開始聚合；引發開始后，先將大部分單體逐滴緩慢加入正在聚合的體系中，滴至一半時，將功能單體的混合液以很慢速度逐滴滴入，維持25℃和N2氛，攪拌速度約為600轉／分，1-4小時滴完。然后繼續反應1-3小時，使單體反應完全，結束反應。2．熒光高分子納米微球的制備采用離子鍵合法，即利用微球表面的吡啶基與FITC的羧基之間在酸催化條件下可離子鍵合，將熒光染料分子FITC接于高分子納米微球上，微球表面的羥基可經活化后接上生物分子。具體步驟為將微球帶羥基與吡啶基的高分子納米膠乳加入FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持攪拌。體系攪拌2-5小時后移入透析袋中透析4-6天，以除去未反應的熒光分子和少量游離的乳化劑分子及引發劑碎片離子。產物用pH=7．5的50mM磷酸緩沖液稀釋104倍，即可用于生物分子的標記。實施例三含羧基亞微米級熒光高分子微球的制備亞微米級熒光高分子微球的制備同上可分為兩個步驟乳液聚合方法合成功能化亞微米級微球及亞微米級微球接上熒光分子。1．乳液聚合制備功能化亞微米級高分子微球乳液聚合適于制備亞微米級高分子微球，其采用的體系基本與微乳液聚合相同。
表3．乳液聚合制備含羧基的高分子納米膠乳體系配方(每100份重量)*
*比例為重量百分數，反應溫度90℃。
合成步驟為1．5g2-異辛基丁二酸磺酸鈉(Aerosol MA，or AMA)和0．1gNaHCO3溶于55．7g去離子水中，加入30g苯乙烯單體，1g交聯劑DVB，于90℃通N2條件下，攪拌乳化1h，將引發劑KPS溶于10g去離子水中，加熱至90℃后，一次加入反應器，恒溫90℃，引發開始半小時后，逐滴加入功能單體AA，滴完后反應10h，得到含羧基的聚苯乙烯膠乳產物，膠粒尺寸在70nm左右。2．亞微米級熒光高分子微球的制備如前例所示，熒光分子FITC可通過吸附作用或直接化學鍵合與含羧基亞微米級微球結合。
吸附法將4．5ml濃度為0．5-2wt％微球帶羧基的高分子膠乳加入0．5ml FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持攪拌。體系攪拌2-5小時后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的熒光分子和少量游離的乳化劑分子及引發劑碎片離子。產物用pH=7．5的50mM磷酸緩沖液稀釋104倍，即可用于生物分子的標記。
化學鍵合法功能化亞微米級高分子膠乳用大量甲醇破乳，離心沉淀。沉淀物分離出來后用大量的水和甲醇反復洗滌數次，然后在真空烘箱中干燥以除去小分子。FITC所含-NCS可與微球上的羧基產生化學反應而鍵合，反應在40-70℃的丁酮溶液中進行，FITC量為2mg，羧基微球的濃度為5mg／ml(丁酮)，反應也可在惰性有機溶劑如二甲苯、醋酸丁酯、酮類等中進行，反應3-5小時后停止。將熒光高分子微球的丁酮分散液逐滴加入水中，在界面處有固體微球析出，收集這些微球再加少量NP或Tween乳化劑重新分散至pH=7．5的50mM磷酸緩沖液，稀釋103倍后即可用于生物分子的標記。實施例四含醛基亞微米級單分散熒光高分子微球的制備1．采用無皂乳液聚合方法制備無皂單分散或窄分布亞微米級高分子微球。體系配方為表4．無皂乳液聚合制備含醛基的亞微米級單分散高分子膠乳體系配方*
*反應溫度60℃。
合成步驟為將St單體，交聯劑DVB，功能單體丙烯醛及引發劑V-50混合加入去離子水中，通氮氣10min后升溫至60℃開始反應，維持攪拌反應8小時，得粒徑為150nm左右的含醛基無皂PS膠乳。
無皂乳液聚合制備的亞微米級聚合物膠乳的特點為膠粒粒徑窄分布且表面不含乳化劑，清潔的表面易于后處理以直接連接生物活性分子。2．亞微米級單分散熒光高分子微球的制備采用吸附法制備含醛基的亞微米級單分散熒光高分子微球將4．5ml濃度為0．5-2wt％帶醛基的亞微米級無皂高分子膠乳加入0．5ml FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持攪拌。體系攪拌2-5小時后移入透析袋中透析4-6天，以除去未吸附的熒光分子及引發劑碎片離子。產物用pH=7．5的50mM磷酸緩沖液稀釋103倍，即可用于生物分子的標記。熒光微球表面的醛基在下一步可在緩沖液中與生物分子如蛋白上的-NH2鍵合，從而實現生物分子的熒光標記。另外，還可將將親和素(Avidin)加入亞微米級熒光微球分散液，通過蛋白的強吸附作用進一步功能化，成為親和素標記的熒光高分子微球，可與生物素(biotin)特異性結合，作為生物分子如核酸雜交的熒光探針。實施例五含胺基微米級單分散熒光高分子微球的制備1．采用分散聚合方法制備功能化的單分散高分子微球。體系組成參見下表5表5．乳液聚合制備含羧基的高分子納米膠乳體系配方(每100份重量)*
*反應溫度70℃．聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)合成步驟為先稱取PVP、AEM溶于乙醇／水介質中，再稱取AIBN、DVB溶于苯乙烯中。然后將乙醇溶液和苯乙烯溶液轉移至250ml裝有溫度計、機械攪拌器和冷凝管的四頸瓶中，通入N2在常溫下攪拌30分鐘，攪拌速度約為600轉／分。然后升溫至70℃，開始反應。控制反應溫度和N2流速，聚合24小時。反應結束后，自然冷卻至室溫，得到的聚合產物粒子的粒徑為1．5μm左右。
取分散聚合制得的膠乳10ml置于40ml離心管中，再加入25ml乙醇／水(重量比為20．1)混合溶劑混合，在高速離心機中離心沉淀15分鐘，轉速為8000轉／分。棄去上層清液，再加入35ml乙醇／水混合溶劑洗滌，再次離心，如此重復三次，然后將固體物配成一定濃度的乙醇分散液待用，或加少量乳化劑重新在水中分散為微米級高分子分散體。2．微米級單分散熒光高分子微球的制備采用吸附法制備含胺基的微米級單分散熒光高分子微球將4．5ml濃度為0．5-2wt％帶胺基的微米級高分子分散體加入0．5ml FITC的乙醇溶液中(2mg的FITC溶于0．5ml乙醇中)，保持攪拌。體系攪拌2-5小時后離心將熒光微球分離，并用乙醇和水交替反復洗滌。產物用pH=7．5的50mM磷酸緩沖液稀釋104倍(還可加少量NP或Tween乳化劑)，即可用于生物分子的標記。熒光微球表面的胺基在下一步可在緩沖液中加活化偶聯試劑如戊二醛與生物分子如蛋白上的-NH2鍵合，從而實現生物分子的熒光標記。
另外，還可將將親和素(Avidin)加入微米級熒光微球分散液，通過蛋白的強吸附作用進一步功能化，成為親和素標記的熒光高分子微球，可與生物素(biotin)特異性結合，作為生物分子如核酸雜交的熒光探針。
化學鍵合法FITC所含-NCS可與洗滌后得到的微米級聚合物微球上的胺基產生化學反應而鍵合，反應在40-70℃的丁酮溶液中進行，FITC量為2mg，胺基微球的濃度為5mg／ml(丁酮)，反應也可在惰性有機溶劑如二甲苯、醋酸丁酯、酮類等中進行，反應3-5小時后停止。將熒光高分子微球的丁酮分散液逐滴加入水中，在界面處有固體微球析出，收集這些微球再加少量NP或Tween乳化劑重新分散至pH=7．5的50mM磷酸緩沖液，稀釋102倍后即可用于生物分子的標記。
權利要求
1．一種熒光標記的高分子微球，由高分子微球和熒光分子組成，其特征是納米級高分子微球的尺寸是5-60nm，亞微米級高分子微球尺寸是60nm-1μm，微米級高分子微球尺寸是1-20μm，在上述高分子微球上吸附或者化學鍵合有熒光染料分子或熒光探針分子。
2．一種熒光標記的納米級高分子微球的制備方法，其特征是在微乳液反應體系中進行，對于正相反應體系，先將少量單體、乳化劑、連續相配成均相微乳液，將微乳液攪拌并升溫至25-80℃，體系通N2后加入引發劑，然后將剩余單體、功能單體逐滴加入反應體系中，1-6小時滴完，以400-650轉／分速度攪拌，滴加完畢繼續反應0．5-3．5小時，其中正相反應乳化劑濃度 0．1-30wt％單體濃度1-50wt％功能單體濃度0．2-20wt％引發劑濃度0．5-10mM(以體系為100ml計算)其余為去離子水對于反相反應體系，將單體、乳化劑、水和連續相配成均相微乳液，然后攪拌并升溫至25-80℃，體系通N2后加入引發劑引發聚合，其它條件與步驟同正相體系，其中反相反應乳化劑濃度2-40wt％；單體濃度 1-15wt％功能單體濃度 0．2-8wt％水的濃度 2-15wt％引發劑濃度0．5-10mM(以體系為100ml計算)其余為油性連續相聚合物微球制成后在微球上吸附或鍵合熒光染料分子或熒光探針分子即可。
3．一種熒光標記的亞微米級高分子微球的制備方法，其特征是在乳液聚合體系中進行，其乳化劑濃度是0．1-3wt％，單體濃度是10-50wt％，聚合物微球制成后在微球上吸附或鍵合熒光染料分子或熒光探針分子。
4．根據權利要求3所述的熒光標記的亞微米級高分子微球的制備方法，其特征是用種子乳液聚合或無皂乳液聚合制得單分散亞微米級高分子微膠乳。
5．一種熒光標記的微米級高分子微球的制備方法，其特征是在分散聚合體系中進行，體系中主單體濃度是1-40wt％，功能性單體的濃度是0．5-20wt％，分散劑的濃度是0．001-3wt％，引發劑的濃度是0．01-5wt％，微球制成后吸附或鍵合熒光染料分子或熒光探針分子。
6．根據權利要求4所述的熒光標記的微米級高分子微球的制備方法，其特征是分散共聚合是在極性介質中進行。
7．根據權利要求2，3，5所述的熒光標記的高分子微球的制備方法，其特征是在高分子微球上吸附或者化學鍵合熒光染料分子或熒光探針分子，吸附條件是將高分子微球加入分散有熒光分子的乙醇溶液，吸附液中熒光分子濃度是0．1-1wt％，高分子微球濃度是0．5-2wt％，在20-50℃下，攪拌后透析，產物用磷酸緩沖液稀釋即可，化學鍵合條件是將聚合好的高分子微球乳液破乳，沉淀，分離沉淀后在熒光分子的溶液中反應3-5小時，反應溫度40-70℃，微球濃度是0．1-1wt％，熒光分子濃度是0．01-0．1wt％，將該反應液逐滴加入水中分散，收集析出的固體微球，再加入乳化劑分散至磷酸緩沖液，稀釋即可。
8．根據權利要求7所述的熒光標記的高分子微球的制備方法，其特征是高分子微球上化學鍵合熒光染料分子或熒光探針分子是在惰性溶劑中進行。
9．根據權利要求7所述的熒光標記的高分子微球的制備方法，其特征是熒光高分子微球與生物分子結合。
10．根據權利要求7所述的熒光標記的高分子微球的制備方法，其特征是熒光高分子微球與非放射性標記物結合。
全文摘要
本發明是一種吸附或鍵合有熒光分子或熒光探針的熒光標記高分子微球及其制備方法。現有技術中熒光標記的高分子微球局限于無機或金屬粒子,合成效率低、成本高。本發明用高分子合成方法制得從納米級到微米級高分子微球并吸附或鍵合有熒光分子或熒光探針,本發明方法效率高,成本低,使制得的微球作為熒光信號放大的載體,在生命科學領域有廣泛用途。
文檔編號C08F2/44GK1278534SQ00116548
公開日2001年1月3日 申請日期2000年6月13日 優先權日2000年6月13日
發明者趙藝強, 高海峰, 楊武利, 府壽寬 申請人:復旦大學