專利名稱：鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條的制作方法
技術領域：
技術領域：
本實新型涉及一種檢測受體興奮劑的器具，特別是涉及一種鹽酸克倫特羅(clenbuterol CL)快速檢測試紙條。
背景技術：
現代畜牧業為人類提供了極其豐富的肉、禽、奶、蛋等營養價值高、品質優良的各種食品，為人類的物質生活，提高人們健康水平，延長人類壽命做出了很大貢獻。與此同時，現代科學研究證明，由于畜牧業現代化，大量使用飼料添加劑以及防病、治病需要，大量使用抗生素、激素以及其它合成藥物，造成畜禽食品中藥物殘留，激素殘留等。通過食物鏈的傳遞，藥物殘留和激素殘留物質對人體健康和生命構成威脅和危害，如癌癥人發病率增加，人類生育畸形比例增大，人體抗藥性增強，青少年性早熟，中老年心血管疾病漫延以及某些食物中毒等問題。往往與畜禽食品種的藥物殘留、激素殘留密切相關。如鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)縮寫為CL，俗稱瘦肉精，是一種人工合成的腎上腺素神經興奮劑，屬β—興奮劑類激素。低劑量時主要用于防治人、畜的支氣管哮喘和支氣管痙攣，肺氣腫等疾病，但應有嚴格的劑量限制。用量超標人體會產生心悸、嘔吐、肌肉不自主震顫等癥狀，甚至有生命危險，長期過量攝入會積蓄中毒，還有導致染色體畸變的可能。因其具有提高肌肉力量作用，很早就有一些運動員非法使用該藥，國際上早就禁止在飼料和畜牧生產中使用。若劑量增加到治療量的5～10倍，則有使胴體的脂肪重新分布，促進蛋白質合成和促進生長作用。所以增被用作畜禽飼料添加劑，添加到豬、牛、羊、兔、鴨、鵝等畜禽飼料中，以降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率，促進生長，人在食用含有CL殘留的畜禽肉、蛋、奶食品時，容易發生食物中毒事件。因此，歐美各國均禁止CL作為生長促進劑和飼料添加劑使用。我國農業部也正式下文嚴禁CL作為飼料添加劑使用。但是某些畜禽飼養戶及養殖場在經濟利益的驅動下，暗地里非法使用CL做為飼料添加劑，如用含有CL飼料飼養的豬，由于瘦肉率高，對顧客具有強大的吸引力，使其欺騙性和危害性更大，嚴重威脅人類健康。同時CL等β—興奮劑類藥物也被國際奧委會公布為違禁藥物。
當前對CL常用的檢測方法主要有色譜技術和酶聯免疫吸附試驗等。色譜技術是國際上用于CI檢測的常用經典技術，包括高效液相色譜(HPLC)，液相色譜/質譜連用(LC/MS)，氣相色譜/質譜連用(GC/MS)，氣相色譜/傅立葉紅外聯用(GC/FTIR)等。目前香港及內地研究單位多采用GC/MS和HPLC技術進行動物組織和毛發中CL的殘留檢測，應該說色譜技術對CL檢測是非常有效、準確、敏感的。但待檢樣品需經一系列的予處理，繁瑣費時，從樣品予處理到得出檢測結果至少需要2天時間；另外這種檢測方法還需要價格昂貴的儀器設備，且需專業人員操作，每次只能檢測一個樣品，嚴重阻礙了這種檢測方法的普及推廣，更無法實現現場檢測。ELISA，也是一種常用檢測技術，已有商品化的試劑盒出售。是以競爭性酶聯反應為檢測原理，以β—興奮劑抗體包被酶標板，檢測時將被檢樣品和酶標結合物同時加入酶標板，反應后顯色測OD值，OD值愈低表示被檢樣品中含CL含量愈高。檢測全過程約需2-4小時。ELISA一次可檢測多個樣品，即可定性檢測，也可定量檢測。但存在著假陽性或假陰性問題。由于ELISA是一種敏感性很強的技術，不同人操作往往會出現不同結果，對結果的判定需要有一定操作經驗的專業人員，所以該檢測方法也常常造成人為的誤檢和漏檢。同時，β—興奮劑的種類較多，各藥物之間也存在一定的抗原性差異，這也是造成漏檢原因之一，加之檢測時間較長，很難實施現場檢測。
當人們食用了殘留較高濃度的CL動物組織后，會出現心動過速，肌肉震顫，心悸和神經過敏等癥狀。例如1997年上半年，在我國香港17人食用含有CL的豬肺湯，出現手指震顫、頭暈、心悸、口干、失眠、癱瘓等癥狀，引起香港特別行政區和我國政府高度重視。浙江、北京、廣東、河南等地也發現多人由于吃殘留克倫特羅(CL瘦肉精)的豬肉造成食物中毒，引起農業部和當地政府的高度重視。各級食品檢驗部門和外貿出口單位，都加強對GL檢測力度，以確保人民吃上放心肉。因此科技人員研制靈敏、快速，準確的CL檢測方法，檢測家畜組織及飼料中是否含CL的殘留有著十分重要的意義。
(三)實用新型內容本發明的目的是研制出特異、敏感、快速、簡便的鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條。
本實用新型內容的技術方案是一種鹽酸克倫特羅(CL，瘦肉精)快速檢測試紙條，含有支撐層，反應試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，吸附層固定在支撐層上，從樣品端依次為纖維層，吸附CL金標抗體W1纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層，在纖維素膜層上有含藕聯CL載體蛋白Xi的檢測印跡“|”和有含羊或兔抗小鼠IgG Y抗體對照印跡“|”。
吸水的支撐層薄片條可用硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層可用玻璃棉，吸水材料層可用吸水紙，纖維素膜層可用硝酸纖維素膜，金標抗體W1纖維層可用吸附CL金標抗體玻璃棉，CL金標抗體W1為膠金標記CL的單克隆抗體M1或多克隆抗體，藕聯CL的載體蛋白Xi的溶液為CL與載體蛋白Xi藕聯結合的復合溶液，在玻璃與CL金標抗體W1玻璃棉及吸水紙層上覆蓋有保護膜，在玻璃棉與金標抗體W1玻璃棉交界處對應的保護膜偏向玻璃棉一側約0.5cm處印制樣品標記線。
藕聯CL的載體蛋白Xi可為牛血清白蛋白(BSA)，或為雞卵清白蛋白(OVA)，或為鐵蛋白，或為血藍蛋白等，在纖維素膜層上的檢測印跡和對照印跡組合排列可為“‖”。
本發明具有有益的積極效果，CL快速檢測試紙條具有下列各項優點(1)特異性強，敏感性高。CL快速檢測試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體(M1)為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標對單克隆抗體(M1)特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性。可檢測到0.1納克。
(2)操作簡便快速。使用快速檢測試紙條時無需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品10秒左右，在2分鐘內即可判定檢測結果。
(3)顯示檢測結果形象、直觀準確。快速檢測試紙條以顯示紅棕色“|”及“‖”印跡作為檢測的陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“|”印跡表示在被檢測樣品液中含有CL，兩條棕紅色“‖”印跡表示在被檢樣品中不含CL，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性誤判。
(4)成本低，投資少。使用快速檢測試紙條，不需另配儀器設備及其它試劑，使現場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。
(5)易于大范圍推廣應用。快速檢測試紙操作簡單，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖到個體養殖等，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。


圖1為鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條結構示意圖。
圖2為鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條俯視結構示意圖。
(五)具體實施例要制成鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條首先需制備藕聯CL的載體蛋白Xi，用于印制檢測印跡，進而制備CL的金標抗體，用于制備金標抗體纖維，其次需制備羊或兔抗小鼠IgG抗體，用于印制對照印跡。
(1)CL與載體蛋白(Xi)的藕聯采用碳化二亞胺法、重氮化法或戊二醛法，將CL與載體蛋白進行藕聯制備免疫抗原。將5mg鹽酸克倫特羅溶解于預冷(2-8℃)的稀鹽酸(pH3.0)中，加入10mg亞硝酸鈉(重量比為2∶1)，室溫避光攪拌6小時，溶液顏色變為黃色。將載體牛血清白蛋，或雞卵清白蛋白或為鐵蛋白，或血藍蛋白溶于PBS緩沖液中，按摩爾比25∶1加入上反應中，溫室攪拌過夜。將反應液用PBS緩沖液透析即可。
(2)抗CL單克隆抗體(M1)的制備以50μg-100μg/只的藕聯CL的載體蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次間隔15-30天；第三次加強免疫后3-4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，于75％酒精浸泡5-10min，無菌取其脾細胞；剪碎并經100目尼龍網過濾，1000r/min離心10min，收集脾細胞；將1×108的脾細胞與2-5×107的NSO漿細胞瘤細胞混合，1000r/min離心10min棄上清，細胞沉淀于37℃的水溶中緩緩加入0.7-1ml的40％-50％ PEG4000(PH8.5-9.0)作用1min，然后緩慢加入無血清1640培養基15ml，以終止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min離心10min棄上清，將細胞沉淀重懸于HAT選擇培養基中，并加入96孔培養板(100μl-200μl)孔，置37℃ 5％CO2培養箱中培養。培養7-10天后，以5μg-10μg/ml的藕聯CL的載體蛋白包被酶標板(40孔/塊)，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養上清，挑取強性細胞克隆(OD492＝0.8以上)，進行連續三次的有限稀釋法克隆化，所生產的雜交瘤細胞染色體數為92-98，其分泌的單克隆抗體(M1)特異地與CL反應，而不與其它蛋白發生交叉反應，親和力常數達109-10，輕鏈亞型為κC或λ，重鏈亞型為IgG1IgG2aIgG2bIgG3，針對CL特異抗原決定簇的單克隆抗體(M1)，用于制備金標抗體棉。CL的多克隆抗體可用的常規方法制備，不再重述。
(3)CL金標抗體(W1)和金標抗體(W1)棉的制備以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在沸騰的50-100ml 0.01-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-2％檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體金。以0.1mol/L K2CO3調膠體金PH至8.5-9.5，以1∶1000～1∶1300的標記比將待標記的CL單克隆抗體(M1)加入pH8.5-9.5，金溶膠中，標記10min后，加20％ PEG10000至終濃度0.05％，4℃ 1500-3000g離心20min，除去未結合的金顆粒，4℃ 15000g離心1h，棄上清，獲初步純化金蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標蛋白，獲得CL膠體金標記抗體。將1∶100～1∶1500稀釋的膠金標記抗體吸附于精制玻璃棉中，4℃低溫真空干燥，制備CL金標抗體棉。
(4)羊或兔抗小鼠IgG抗體的制備以飽和硫酸銨提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨混勻，置4℃冰箱2h，4℃ 1200r/min離心15min，棄上清；以適量PBS(7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨至終濃度33％，置4℃冰箱2h，4℃ 1200r/min離心15min，棄上清，以少量PBS(7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱內用PBS(7.2)過夜透析，換液2-3次，4℃12000r/min離心15min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度，以50μg-100μg/kg體重的小鼠血清IgG經皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3-4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1∶2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨提取羊或兔抗小鼠IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于CL快速檢測試紙條對照顯示印跡的制備。
(5)CL快速檢測試紙條實施檢測反應原理當CL快速檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸帶動待檢CL及金標抗體棉中的金標抗體(W1)一起向硝酸纖維素膜擴散，并最終滲入濾紙中，擴散過程中待檢CL可與的金標抗體(W1)相結合，進而封閉金標抗體(W1)上CL的抗原結合點，阻止金標抗體(W1)與纖維素膜上藕聯CL的載體蛋白(Xi)的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而羊或兔抗小鼠IgG抗體(Y)則可與金標抗體(W1)結合，形成紅棕色對照印跡“|”，即一條紅棕色“|”印跡為陽性標記，反之樣品溶液中無CL則不能阻止金標抗體(W1)與纖維素膜上藕聯CL的載體蛋白(Xi)檢測印跡結合，顯示紅棕色檢測印跡“|”，同樣羊或兔抗小鼠IgG抗體(Y)也與金標抗體(W1)結合，顯示紅棕色對照印跡“|”，形成兩條紅棕色“‖”陰性標記，如果纖維素膜上沒有紅棕色標記顯示，則表明試紙條已失效。
(6)鹽酸克倫特羅(CL)快速檢測試紙條檢測實例操作方法。
檢測樣品液的制備，若檢測肉或肉制品可將樣品剪碎、研磨，以生理鹽制成1∶2～1∶10待檢測樣品晶液，如果檢測的對象是蛋或奶，可直接將蛋或奶用生理鹽水制成1∶2～1∶10待檢測樣品懸液。
若用動物的血液作為待測樣品，則提取血清，用血清作為待測樣品，或直接取動物的尿液作為檢測樣品。
將CL快速檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品液中，插入深度不超過標記線9，約10秒后取出檢測試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結果。
檢測結果判斷如果在纖維素膜上有一條紅棕色標記“|”顯示，表示測檢結果呈陽性，說明在被檢測的樣品液中含有鹽酸克倫特羅，即該動物飼喂過含有違禁的鹽酸克倫特羅(CL)添加劑飼料，這樣的動物肉料和肉制品是不能在市場上流通的，人吃了上述肉類將發生食品中毒，影響健康。
如果CL快速檢測試紙條上的纖維素膜出現有兩條紅棕色標記“‖”，表示檢測結果呈陰性，即在待檢樣品中不含鹽酸克倫特羅成份，則呈陰性結果的動物肉類和肉制品中不含CL成份，其食用是安全的。
實施例一，參見圖1，圖2，圖中，1為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為樣品端的纖維層，用玻璃棉制成，3為吸附有克倫特羅簡稱CL，俗稱瘦肉精的金抗體(W1)纖維層，根據上述實施例(3)制備方法，制備吸附有克倫特羅金標抗體(W1)玻璃棉，簡稱CL金標抗體W1棉，4為纖維素膜層，本實施例采用硝酸纖維素膜，5為吸水材料層即手柄端用濾紙制成，將編號2，3，4，5各層從左至右粘貼在塑膠薄片條1上，在硝酸纖維素膜層4上，6為用藕聯克倫特羅(瘦肉精)的載體蛋白Xi檢測印跡“|”，7為羊或兔抗小鼠IgG抗體(Y)在硝酸纖維素膜4上對照印跡“|”，兩個印跡并排形成，組合印跡“‖”。8-1為白色保護膜，覆蓋在玻璃棉2和吸附有CL金標抗體W1棉上，在2和3交界處對應保護膜8-1位置上偏向于玻璃棉2一方0.5cm處印有標記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，濾紙層5即吸水層(手柄端)上覆蓋有黃色保護膜8-2。待測樣品溶液的制備及檢測操作步驟，詳見具體實施例中的(6)，這里就不重述了。
權利要求1.一種鹽酸克倫特羅(CL，瘦肉精)快速檢測試紙條，含有支撐層，反應試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片層，吸附層固定在支撐層上，其特征是吸附層從樣品端依次為纖維層，吸附CL金標抗體W1纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層，在纖維素膜層上有含藕聯CL載體蛋白Xi的檢測印跡“|”和有含羊或兔抗小鼠IgG(Y)抗體對照印跡“|”。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是不吸水的支撐層薄片層可用硬質塑膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層可用玻璃棉，吸水材料層可用吸水紙，纖維素膜層可用硝酸纖維素膜，金標抗體W1纖維層可用吸附CL金標抗體W1玻璃棉，CL金標抗體W1為膠金標記CL的單克隆抗體M1或多克隆體，藕聯CL載體蛋白Xi為CL與載體蛋白Xi藕聯結合的復合物。在玻璃棉與CL金標抗體W1玻璃棉及吸水紙層上覆蓋有保護膜，在玻璃棉與金標抗體W1交界處對應的保護膜偏向玻璃棉一側約0.5cm處印制樣品標記線。
3根據要求1或2所述的試紙條，其特征是藕聯CL的載體蛋白Xi可為牛血清白蛋白(BSA)X1，或為雞卵清白蛋白(OVA)X2，或為鐵蛋白X3，或為血藍蛋白X4等，在纖維素膜層上的檢測印跡和對照印跡組合排列可為“‖”。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測受體興奮劑的器具,特別是涉及一種鹽酸克倫特羅快速檢測的試紙條。含有支撐層,反應試劑載體吸附層,支撐層為不吸水薄片條,吸附層固定在支撐層上,吸附層從樣品端依次為纖維層,吸附CL金標抗體W
文檔編號G01N33/558GK2518108SQ0220203
公開日2002年10月23日 申請日期2002年1月14日 優先權日2002年1月14日
發明者張改平, 李學伍, 王選年, 楊艷艷, 鄧瑞廣, 肖治軍, 康曉笛, 郭軍慶, 李青梅, 王愛萍, 楊繼飛, 李靈霞 申請人:河南省農業科學院生物技術研究所