一種磷光能量轉移體系，其合成方法，用途以及凝血酶的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種磷光能量轉移體系，其合成方法，用途以及凝血酶的檢測方法，將一條5’端帶有氨基修飾核酸適配體通過脫水縮合反應固定在巰基丙酸（MPA）包裹的Mn摻雜的ZnS磷光量子點表面，使得標記的磷光量子點靠近碳納米點表面，磷光被猝滅。利用核酸適配體與凝血酶的強結合作用，磷光基團遠離碳納米點表面，使得磷光強度恢復，用于測定凝血酶的量。本實驗首次采用磷光量子點和碳納米點之間的磷光能量轉移原理來檢測生物體內凝血酶的含量，提高了測定的選擇性和專一性，并且降低了熒光背景，猝滅時間大大縮短，提高了測定的靈敏度，檢測限也較低，采集到的磷光信號穩定，滿足了微量分析的要求。
【專利說明】一種磷光能量轉移體系，其合成方法，用途以及凝血酶的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種磷光能量轉移體系，其合成方法，用途以及凝血酶的檢測方法。
【背景技術】
[0002]腫瘤組織對周圍組織的侵襲，轉移的形成以及腫瘤組織和腫瘤患者血液本身的變化均可導致病人凝血機制的改變，產生不同程度的出血傾向。凝血酶是一種重要的生理蛋白酶，在血液凝固，炎癥和創傷愈合等生理及病理過程中發揮重要作用，因此檢測凝血酶在醫學上具有重要意義。凝血酶(Thrombin)的濃度及活性是衡量凝血機制的重要指標，對揭示腫瘤的發生機制，或作為早期診斷，分子分型，療效和預后判斷具有重大意義。
[0003]核酸適配體(Aptamer)是通過指數富集的配體系統進化技術(SELEX)經體外篩選得到的，能與響應的靶分子專一性緊密結合的一類單鏈DNA或RNA。與抗體相比，適配體靶分子范圍廣，親和力高，特異性強，篩選制備方便且純度高，批間重現性好，性質穩定，容易修飾功能團，因此在藥物篩選，臨床診斷和分析化學等領域得到了廣泛應用。目前建立的基于適配體檢測蛋白質的方法有比色法，熒光法，電化學法，壓電生物傳感法等。其中，熒光法具有靈敏度高，動態范圍寬，特性參數多等優點，具有很大的發展潛力。
[0004]量子點是粒徑小于或接近于激子波爾半徑的半導體納米晶粒。它們處于分子與塊狀固體之間的中間狀態，通常由I1-VI族或II1-V族元素組成。量子點的比表面積，表面原子數，表面能和表面張力都隨粒徑的下降而急劇增加。由于尺寸效應，表面效應以及宏觀量子隧道效應等，導致量子點的熱，磁，光，敏等特性和表面穩定性均優于相應的體材料。量子點的光學性質是目前科研工作者研究的一個熱點。
[0005]量子點作為熒光探針廣泛地應用于生物醫學，分析科學，環境科學，食品科學等研究領域。其光學特性比傳統有機染料相比具有明顯的優越性:①量子點的熒光激發光譜寬，且連續分布。因此可以采用單一波長光源同時激發不同顏色的量子點；②可以通過改變量子點粒徑大小和組成材料來“調諧”其發射波長，將不同光譜區的量子點混合使用，可以使研究者通過多種顏色同時追蹤數種生物分子；③量子點的熒光光譜有較大的斯托克斯位移，熒光光譜窄而對稱，因此用不同光譜特征的量子點標記生物分子時，熒光光譜易于識別分析；④比有機染料具有更高的光穩定性。在深入開發和研究量子點的熒光性質的同時，量子點的磷光性質也開始引起了科學家們的注意。
[0006]磷光是一種長壽命的光,平均壽命達10 4秒到數秒。磷光與突光的發光機理不同，是分子中電子激發三線態T1回到基態Stl而產生的輻射。由于T1-Stl是禁阻的，其可能性僅為S1-Stl過程可能性的百 萬分之一。由于磷光壽命長,在發射光子以前,分子的碰撞運動會使1\電子經無輻射弛豫返回基態，也就是所謂的磷光猝滅。為克服猝滅現象，最常見的方法就是使用深冷設備把分子固定為剛性體，這就是最初的低溫磷光。但是低溫磷光的限制條件是必須具有深冷設備，裝置價格昂貴且操作復雜。因此室溫磷光的研究引起了分析工作者的普遍重視。[0007]室溫磷光的檢測有很多的優點:①靈敏度高:磷光的靈敏度通常比一般的吸光光度法高三個數量級無需價格昂貴且使用麻煩的低溫冷卻裝置，免除了溶劑或溶液的除氧過程，相對低溫磷光法，大大降低了成本和簡化了操作步驟分析曲線線性范圍寬:通常達2-4個數量級；④選擇性好:這是因為磷光光譜的位置通常位于更長的波長，具有更大的斯托克斯位移，不會和激發光譜發生重疊，可以避免激發光的干擾，自吸收現象也有所減輕；⑤檢出限低:發光分析的檢出限一般決定于空白值的大小，因為磷光較少受雜散光及背景發光的干擾，即空白值較低；⑥易于實現連續操作和自動化。
[0008]磷光能量共振轉移(PRET)是一種非輻射能量躍遷。當兩個熒光發色基團距離足夠靠近時，供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，從該電子能態回到基態前，通過偶極子的相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移。供體發射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，供體與受體的躍遷偶極的相對取向，以及供體和受體之間的距離等因素都會影響能量轉移的效率。傳統有機熒光染料吸收光譜窄，發射光譜常常伴有拖尾，這樣會影響供體發射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，并且供，受體發射光譜相互干擾。而量子點用于磷光能量轉移的研究，克服了有機熒光染料的不足。相對于傳統有機熒光染料分子，量子點的發射光譜很窄且不拖尾，減少了供體與受體發射光譜的重疊，避免了相互干擾。由于量子點具有較寬的激發光譜，當它作為能量供體時，可以更自由地選擇激發波長，最大限度地避免對能量受體的直接激發。通過改變量子點的組成或尺寸，可以獲得發射波長在可見光區的量子點，為吸收光譜在可見光區的生色團作能量供體，并且保證了供體發射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加了共振能量轉移效率。
[0009]Pang 課題組在 2011 年的一篇文獻(Anal.Chem.2011, 83，8130-8137)中報道過有關檢測凝血酶的方法，該實驗使用上轉換熒光材料和碳納米顆粒之間有效的熒光能量轉移原理(FRET)來檢測人體血漿中的凝血酶含量，此方法的檢測范圍在0.5-20nM，最低檢出限為0.18nM。但此方法并沒有考慮到核酸適配體自身的熒光干擾和樣品散射光的影響，降低了實驗結果的可靠性及實驗的可重復性。
[0010]由于不是所有的蛋白都能找到與之一一對應的抗原或抗體，而標記蛋白往往會造成蛋白的活性降低甚至失活，傳統的免疫蛋白分析不能適應發展需要。而由人工合成的核酸適配體不依賴于動物或細胞，容易獲得，可方便地在適配體的特定位置用熒光，酶或生物素分子等功能團加以標記，相對抗原或抗體來說，適配體的穩定性和耐受變性好，且其變性是可逆的，并可長期貯存和在常溫下運輸。
[0011] 近年來，核酸適配體作為一種分子識別元件，越來越受到關注。目前，應用核酸適配體熒光檢測蛋白質主要是基于適配體與目標蛋白作用后產生的熒光偏振度或熒光強度的改變來檢測蛋白。核酸適配體熒光檢測凝血酶也主要采取這兩種方式。由于適配體與核酸作用結合后其分子量發生變化，從而引起偏振角度變化，用其檢測蛋白，其信號變化范圍較小，線性范圍較窄，并且熒光偏振對非均相溶液的測定存在一定的局限性。也有人設計分子信標或分子開關與核酸適配體作用，其熒光強度在核酸適配體與目標蛋白結合前后產生變化(主要是由于分子間距離變化產生的熒光猝滅或分子開光微環境變化產生的自猝滅作用)，通過熒光強度的改變量來檢測蛋白。這類方法也是通過熒光信號的改變量來測定目標蛋白的，熒光背景較大，線性范圍不寬，對于低濃度的蛋白測定存在一定困難。
【發明內容】

[0012]本發明的目的在于提供一種磷光能量轉移體系，其合成方法，用途以及凝血酶的檢測方法，Mn摻雜的ZnS量子點作為供體,碳納米點作為能量的受體,并論證了其對凝血酶的檢測可以達到0.013nM的最低檢測限。這種傳感器展現了良好的分析性能，有效的避免自體熒光和散射光的干擾。磷光能量轉移體系檢測凝血酶為設計化學生物傳感器提供了一個新的方法。
[0013]具體技術方案如下:
[0014]一種磷光能量轉移體系，能量的供體為Mn摻雜的ZnS量子點，能量的受體為碳納米點。
[0015]上述磷光能量轉移體系的合成方法，作為能量供體的量子點的采用如下步驟合成:
[0016](I)容器內加入巰基丙酸，ZnSO4和MnCl2水溶液；
[0017](2)調節溶液的pH值；
[0018](3)攪拌并飽和；
[0019](4)加入 Na2SA溶液；
[0020](5)反應并陳化；
[0021](6)沉降并高速離心；
[0022](7)傾去上層清液并干燥，即得。
[0023]進一步地，
[0024]步驟(1)中在IOOmL的三口燒瓶內，加入0.17mL巰基丙酸，5mL0.lmol/L ZnSO4和
0.2mL0.01mol/L MnCl2 水溶液，和 / 或，
[0025]步驟(2)中用NaOH調節溶液的pH值至11，和/或，
[0026]步驟(3)中在室溫下磁力攪拌，通氮氣飽和30分鐘，保證穩定劑與Zn2+和Mn2+絡合充分，和/或，
[0027]步驟(4)中注射器在隔絕空氣的條件下加入5mL0.lmol/L的Na2S水溶液，和/或，
[0028]步驟(5)中，在室溫下繼續反應20分鐘，將得到的Mn摻雜ZnS量子點的溶液在空氣氛圍下陳化2小時，溫度控制在50°C，和/或，
[0029]步驟(6)中以相同體積的無水乙醇使量子點沉降，高速離心，和/或，
[0030]步驟(7)中，置于室溫真空干燥24小時，即可得到實驗所需的納米粒子固體粉末。
[0031]進一步地，作為能量受體的碳納米點的采用如下步驟合成:
[0032]I)蠟燭灰溶于V水:Vill=1:1溶液中；
[0033]2)離心并收集上清液；
[0034]3)離心并收集沉淀；
[0035]4)干燥沉淀物；
[0036]5)將步驟4)產物溶于十二烷基苯磺酸鈉中；
[0037]6)超聲，即得。
[0038]進一步地，
[0039]步驟(1)中取811^蠟燭灰，溶解在20mL水:V乙醇=1:1中，超聲幾小時，使蠟燭灰均勻溶解，和/或，[0040]步驟(2)中用離心機3000轉/分鐘，離心2分鐘，移去大型粒子，收集上清液，和/或，
[0041]步驟(3)中用6000轉/分鐘離心6分鐘，將上層液移去，收集沉淀，和/或，
[0042]步驟(5)中產物溶解在20mL0.02%SDBS(十二烷基苯磺酸鈉)中，和/或，
[0043]步驟(6)中獲得產物的濃度為0.lmg/mL。
[0044]上述磷光能量轉移體系的用途，進一步地，用于對凝血酶的檢測。
[0045]一種凝血酶的檢測方法，采用磷光量子點和碳納米點之間的磷光能量轉移來檢測生物體內凝血酶的含量。
[0046]進一步地,包括如下步驟:
[0047]a.將適配體固定在Mn摻雜的ZnS磷光量子點表面；
[0048]b.使得標記的磷光量子點靠近碳納米點表面；
[0049]c.磷光被猝滅；
[0050]d.利用核酸適配體與凝血酶的強結合作用，磷光基團遠離碳納米點表面；
[0051]e.使得磷光強度恢復；
[0052]f.測定凝血酶的量。
[0053]進一步地，所述凝血酶適配體修飾的量子點采用如下步驟制得:取2mg的量子點，超聲分散于0.1M pH=7的磷酸鹽緩沖液PBS中，加入20mg 丁二酸酐，攪拌反應2小時；離心，用pH=7的PBS清洗后，將沉淀溶于0.02M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液中，并加入
1.2mgEDC和1.8mg NHS,反應30分鐘；再加入50 μ L的凝血酶適配體ΤΒΑ，繼續反應12小時；反應結束后，離心分離，將沉淀溶于0.02Μ NaCl的0.05Μ Tris-HCl緩沖液中ρΗ=7.2，即得。
[0054]進一步地，步驟a中具體為將一條5’端帶有氨基修飾核酸適配體通過脫水縮合反應固定在巰基丙酸MPA包裹的Mn摻雜的ZnS磷光量子點表面。
[0055]與目前現有技術相比，本發明即克服了熒光信號背景較大的影響，又能有效的避免來自樣品本底熒光和散射光的干擾。并且此方法靈敏度高，操作簡單，可以快速的檢測生物體液中的凝血酶，避免了化學修飾和固定化過程，并且在檢測過程中不需要加入任何除氧劑和誘導劑，避免了生物體液中的金屬離子，生物分子和其它抗生素的干擾。且本實驗的檢測范圍比已有的文獻報道的都低，最低檢出限為0.013nM，比文獻報道的低兩個數量級。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1a為MPA (巰基丙酸)包裹的Mn摻雜ZnS QDs (MPA-QDs)的TEM (透射電鏡)圖；
[0057]圖1b 為 TBA-QDs (0.03mg/mL)的磷光光譜圖；
[0058]圖1c為碳納米點的SEM (掃描電鏡)圖；
[0059]圖1d為碳納米點(0.045mg/mL)紫外吸收圖；
[0060]圖2a為加入不同濃度的碳納米點時TBA-QDs的磷光猝滅曲線。TBA-QDs的濃度為
0.0Smgmr1;碳納米點的濃度 (從低到高)為:0，0.005，0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.03
5,0.04, 0.045mg mL、；
[0061]圖2b為不同碳納米點濃度下TBA-QDs的磷光強度線性圖和經驗方程。[0062]圖2c為MPA-QDs中沒有加入(曲線a，黑線)和加入(曲線b，紅線)0.045mg/mL碳納米點時的磷光譜圖；
[0063]圖2d為時間猝滅曲線，含有0.03mg/mLTBA-QDs和0.045mg/mL碳納米點，所有的實驗操作都是在0.01M, 0.15M NaCl, pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液下進行(激發波長為316nm)。
[0064]圖3a為加入入碳納米點時TBA-QDs的相對磷光強度；
[0065]圖3b為沒有加入碳納米點時TBA-QDs的相對磷光強度；
[0066]圖4a曲線a為0.03mg/mL TBA-QDs的磷光光譜，曲線b為a+20nM凝血酶，曲線c為 a+0.045mg/mL CNDs，曲線 d 為 a+20nM 凝血酶；
[0067]圖4b為5nM凝血酶加入TBA-QDs-CNDs體系后磷光強度隨時間的變化曲線。TBA-QDs 濃度:0.03mg/mL;碳點:0.045mg/mL。
[0068]圖5a為加入不同濃度的凝血酶后的磷光恢復圖，濃度從低到高依次是:0，0.05，O
?I, 1.0, 2.5，5.0, 7.5，10.0, 12.5，15.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 80.0nM.插圖是凝血酶在低
濃度時的放大曲線；
[0069]圖5b為加入不同濃度凝血酶的線性曲線和經驗方程。每個數據點代表三個獨立的實驗誤差的平均值。所有的實驗都是在(0.01M, 0.15M NaCl, pH7.4)的Tris-HCl緩沖液中進行的，TBA-QDs 濃度為 0.03mg/mL, CNDs 濃度為 0.045mg/mL。
[0070]圖6為凝血酶適配體傳感器干擾離子的檢測。所有的干擾物質的濃度為1.0uM，凝血酶濃度為5nM。相對磷光強度PZPci (Ptl和P分別代表沒有加入凝血酶，但加入干擾物質和加入凝血酶后的磷光強度)。所有的實驗都是在(0.01M，0.15Μ NaCl, ρΗ7.4)的Tris-HCl緩沖液中進行的，TBA-QDs濃度為0.03mg/mL, CNDs濃度為0.045mg/mL。
[0071]圖7a為加入不同濃度的凝血酶后磷光強度的恢復，濃度從低到高依次:0，5.0, 10
?O, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 50.0, 80.0nM.[0072]圖7b線性曲線和經驗方程，每個數據點代表三個獨立實驗的平均值與誤差線，所有的實驗都是在(0.01M, 0.15M NaCl, ρΗ7.4)的Tris-HCl緩沖液中進行的，TBA-QDs濃度為 0.03mg/mL, CNDs 濃度為 0.045mg/mL。
[0073]圖8為本發明Mn摻雜ZnS量子點與碳納米點之間的磷光能量轉移檢測凝血酶原理圖。
【具體實施方式】
[0074]下面根據附圖對本發明進行詳細描述，其為本發明多種實施方式中的一種優選實施例。
[0075]本實施例將一條5’端帶有氨基修飾核酸適配體通過脫水縮合反應固定在巰基丙酸(MPA)包裹的Mn摻雜的ZnS磷光量子點表面,使得標記的磷光量子點靠近碳納米點表面，磷光被猝滅。利用核酸適配體與凝血酶的強結合作用，磷光基團遠離碳納米點表面，使得磷光強度恢復，用于測定凝血酶的量。本實驗首次采用磷光量子點和碳納米點之間的磷光能量轉移原理來檢測生物體內凝血酶的含量，提高了測定的選擇性和專一性，并且降低了熒光背景，猝滅時間大大縮短，提高了測定的靈敏度，檢測限也較低，采集到的磷光信號穩定，滿足了微量分析的要求。[0076]實驗設備:LS-55熒光分光光度計，石英比色皿(IcmX lcm)，掃描電子顯微鏡，透射電子顯微鏡，PH-3C酸度計，紫外分光光度計。
[0077]實驗材料:巰基丙酸(MPA)，ZnSO4.7H20, Na2S.9H20, MnCl2.4H20,乙醇，氮氣，十二磺基苯磺酸鈉(SDBS)，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl),蠟燭，超純水，凝血酶適配體(5，-NH2-GGTTGGTGTGGTTGG-3，)。
[0078]實驗步驟:
[0079](I)量子點的合成
[0080]錳摻雜的硫化鋅量子點的合成是根據已有報道的文獻做了少量的修改。在IOOmL的三口燒瓶內，加入 0.17mL 巰基丙酸，5mL0.lmol/L ZnSO4 和 0.2mL0.01mol/L MnCl2 水溶液，用NaOH調節溶液的pH值至11，在室溫下磁力攪拌，通氮氣飽和30分鐘，保證穩定劑與Zn2+和Mn2+絡合充分。隨后用注射器在隔絕空氣的條件下加入5mL0.lmol/L的Na2S水溶液，在室溫下繼續反應20分鐘。將得到的Mn摻雜ZnS量子點的溶液在空氣氛圍下陳化2小時，溫度控制在50°C。以相同體積的無水乙醇使量子點沉降，高速離心，傾去上層清液，置于室溫真空干燥24小時，即可得到實驗所需的納米粒子固體粉末。用LS-55磷光儀進行檢測，在581nm處有強的磷光發射峰。與文獻報道相符。
[0081](2)碳納米點(CNDs)的制備
[0082]取811^蠟燭灰，溶解在20110#:^||=1:1中，超聲幾小時，使蠟燭灰均勻溶解，然后用離心機3000轉/分鐘，離心2分鐘，移去大型粒子，收集上清液，再用6000轉/分鐘離心6分鐘，將上層液移去，收集沉淀，干燥沉淀物，得到產物2mg。將產物溶解在20mL0.02%SDBS (十二烷基苯磺酸鈉)中，超聲6小時，獲得產物的濃度為0.lmg/mL。
[0083](3)凝血酶適配體修飾的量子點
[0084]取2mg的量子點，超聲分散于0.1M pH=7的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入20mg 丁二酸酐，攪拌反應2小時。離心，用pH=7的PBS清洗后，將沉淀溶于0.02M NaCl的0.05MTris-HCl緩沖液中(pH=7.2)，并加入1.2mg EDC和1.8mg NHS,反應30分鐘。再加入50 μ L的凝血酶適配體(ΤΒΑ)，繼續反應12小時。反應結束后，離心分離，將沉淀溶于0.02Μ NaCl的0.05MTris-HCl緩沖液中(pH=7.2)，即得到目標產物。
[0085](4)磷光猝滅和雜交實驗
[0086]取一系列不同濃度的碳納米點和TBA-QDs混合，用pH=7.2Tris_HCl定容至2mL，室溫下反應40分鐘。用LS-55熒光儀調節至磷光模式檢測溶液的磷光強度。
[0087]實驗結論:
[0088](I)碳納米點和量子點的表征
[0089]MPA-QDs量子點的形貌通過TEM觀察(圖1a),顯示出球形的顆粒,尺寸均一,粒徑大小在5nm左右，這與之前文獻報道相符。從SEM圖中可以看出氧碳納米點的尺寸在50nm左右(圖lc)。量子點的磷光激發波長為316nm，發射光譜位置大約在581nm，而碳納米點的紫外吸收峰位置在254nm，并且具有很寬的吸收帶(圖1d)，使得磷光能量轉移能夠很好的發生。(2)碳納米點和量子點之間的磷光能量轉移
[0090]在磷光能量轉移進程中，TBA-QDs作為供體，碳納米點作為受體，為了進一步研究磷光能量轉移的機制，我 們研究了在TBA-QDs中加入不同濃度的碳納米點。如圖2a，在溶液中加入0.03mg/mL的TBA-QDs后逐漸加入不同濃度的碳納米點(從0.0到0.045mg/mL),磷光強度逐漸下降。當碳納米點的濃度達到0.045mg/mL時，猝滅效果最大。實驗結果表明，當碳納米點加入TBA-QDs體系中時，TBA-QDs的能量轉移到碳納米點上，從而導致TBA-QDs的磷光強度下降。猝滅效率的計算公式為(1-P/Po)，P0和P分別代表在不存在(Ptl)和存在(P)SffNTs時TBA-QDs的磷光強度。當體系中加入碳納米點的濃度達到0.045mg/mL時，猝滅效率可以達到最大值為95.9%。這個猝滅效率展現了碳納米點超強的猝滅效率。這個強的猝滅效率為敏感的“turn on”型傳感器的定量實驗提供了最佳的猝滅機制。我們還研究了沒有適配體標記的MPA-QDs的磷光猝滅機制(圖2c)，在理想的孵育條件下，加入0.045mg/mL碳納米點是磷光強度沒有明顯的變化。這個結果表明MPA-QDs和碳納米點之間的相互作用更是可以忽略不計的。TBA-QDs磷光猝滅的主要原因是適配體和碳納米點之間J1-Ji作用力。圖2d是TBA-QDs加入0.045mg/mL碳納米點時的磷光猝滅曲線。在20分鐘時達到最大值，隨著時間的增長，猝滅效率最大，出現平臺。為了保證猝滅效率達到最大值并且信號穩定，我們選擇30分鐘為最佳孵育時間。
[0091](3)磷光猝滅機制研究
[0092]磷光猝滅一般被分為靜態淬滅和動態猝滅。動態猝滅可以用Stern-Volmer’ s方程來描述(方程I)，靜態粹滅可以用Lineweaver-Burk方程來描述(方程2),如下:
[0093]P0/P=l+KsvXcq (I)
[0094]I/(P0-P) = I/P0+KLB/(P0Cq) ⑵
[0095]其中，Ptl和P分別代表在TBA-QDs中不加入和加入碳納米點時的磷光強度。Ksv為動態淬滅常數，Klb為靜態猝滅常數。Pc/P和cq, I/(PO-P)和Ι/c,點之間的關系在圖3a和圖3b中展現。
[0096]TBA-QDs和碳納米點之間的磷光粹滅機制既不符合Stern-Volmer’ s方程也不符合Lineweaver-Burk方程。這個結果可能是動態粹滅機制和靜態粹滅機制共同作用的結果，暗示了一個復雜猝滅模式。如圖2b，In(PcZP-1)和c,之間較好的線性關系可以用下面這個經驗公式來表示:`
[0097]In (P0/P-l) =51.26cq - 1.65 (R=0.9933)
[0098]文獻表明在單鏈DNA和富含Ji電子的碳材料，例如碳納米點，石墨烯和碳納米管之間可以發生作用。本實驗中，TBA-QDs和碳納米點之間形成無磷光的復雜基態歸因與DNA和碳納米點之間的相互作用。
[0099](4) “打開型”磷光能量轉移檢測凝血酶
[0100]我們研究了 TBA-QDs-CNDs的磷光能量轉移體系對凝血酶的響應。圖4a描述的是在TBA-QDs-CNDs體系中加入20nM的凝血酶，TBA-QDs-CNDs體系的磷光強度恢復圖(曲線d),結果表明在TBA-QDs-CNDs體系中加入凝血酶后，適配體和凝血酶之間形成四鏈體的結構，作用力大于適配體和碳納米點之間的作用。因此，能量受體碳納米點從能量供體的表面脫離，導致能量供體的磷光強度恢復。基于這個磷光恢復原理，為我們建立“打開型”磷光能量轉移檢測凝血酶實現可能。我們又考察了在TBA-QDs-CNDs體系中加入凝血酶后磷光恢復的時間影響。圖4b，在TBA-QDs-CNDs體系中加入5nM凝血酶后，磷光強度迅速增加，并在40分鐘后達到最大值。因此，我們選取40分鐘作為磷光恢復的最佳時間。
[0101]在最佳的實驗條件下，圖5a是在TBA-QDs-CNDs體系中加入不同濃度的凝血酶時磷光強度的恢復圖。隨著凝血酶濃度的增加，TBA-QDs-CNDs體系的磷光強度也逐漸增加。定義(Ρ-Ρο/ΡοΧΡ和Po分別代表加入不同濃度的凝血酶和不加凝血酶時的磷光強度)，圖5b中凝血酶的濃度從O增加到40nM時的線性圖，相關系數為0.9958，標準曲線方程為(P-Ptl) /Ptl=0.8356+0.5639c (c單位為nM)。最低檢出限為0.013ηΜ (3σ)。σ表示八次空白測定的標準偏差。這些分析參數優于之前文獻報道的相關參數(如Table SI)。結合磷光分析的優點，適配體和蛋白質的特異性結構，這種分析技術，有低的檢出限。這些方法的相對標準偏差為4.37%，是由測量5nM的凝血酶和七次重復測量的標準偏差得到的。這也表明TBA-QDs-CNDs體系磷光能量轉移系統對凝血酶的檢測有很高的可重復性。
[0102]表格1 (與其它方法的比較)
[0103]
【權利要求】
1.一種磷光能量轉移體系，其特征在于，能量的供體為Mn摻雜的ZnS量子點，能量的受體為碳納米點。
2.如權利要求1所述磷光能量轉移體系的合成方法，其特征在于，作為能量供體的量子點的采用如下步驟合成: (1)容器內加入巰基丙酸，ZnSO4和MnCl2水溶液； (2)調節溶液的pH值； (3)攪拌并飽和； (4)加入Na2S水溶液； (5)反應并陳化； (6)沉降并高速離心； (7)傾去上層清液并干燥，即得。
3.如權利要求2所述磷光能量轉移體系的合成方法，其特征在于， 步驟(1)中在IOOmL的三口燒瓶內，加入0.17mL巰基丙酸，5mL0.lmol/L ZnSO4和0.2mL0.01mol/L MnCl2 水溶液，和 / 或， 步驟(2)中用NaOH調節溶液的pH值至11，和/或， 步驟(3)中在室溫下磁力攪拌，通氮氣飽和30分鐘，保證穩定劑與Zn2+和Mn2+絡合充分，和/或，` 步驟(4)中注射器在隔絕空氣的條件下加入5mL0.lmol/L的Na2S水溶液，和/或，步驟(5)中，在室溫下繼續反應20分鐘，將得到的Mn摻雜ZnS量子點的溶液在空氣氛圍下陳化2小時，溫度控制在50°C，和/或， 步驟(6)中以相同體積的無水乙醇使量子點沉降，高速離心，和/或， 步驟(7)中，置于室溫真空干燥24小時，即可得到實驗所需的納米粒子固體粉末。
4.如權利要求2或3所述磷光能量轉移體系的合成方法，其特征在于，作為能量受體的碳納米點的采用如下步驟合成: 1)蠟燭灰溶于V水:Vill=1:1溶液中； 2)離心并收集上清液； 3)離心并收集沉淀； 4)干燥沉淀物； 5)將步驟4)產物溶于十二烷基苯磺酸鈉中； 6)超聲，即得。
5.如權利要求4所述磷光能量轉移體系的合成方法，其特征在于， 步驟(1)中取8mg蠟燭灰，溶解在20mLV#:V =1:1中，超聲幾小時，使蠟燭灰均勻溶解，和/或， 步驟(2)中用離心機3000轉/分鐘，離心2分鐘，移去大型粒子，收集上清液，和/或， 步驟(3)中用6000轉/分鐘離心6分鐘，將上層液移去，收集沉淀，和/或， 步驟(5)中產物溶解在20mL0.02%SDBS(十二烷基苯磺酸鈉)中，和/或， 步驟(6)中獲得產物的濃度為0.lmg/mL。
6.如權利要求1所述磷光能量轉移體系的用途，其特征在于，用于對凝血酶的檢測。
7.—種凝血酶的檢測方法，其特征在于，采用磷光量子點和碳納米點之間的磷光能量轉移來檢測生物體內凝血酶的含量。
8.如權利要求7所述的凝血酶的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: a.將適配體固定在Mn摻雜的ZnS磷光量子點表面； b.使得標記的磷光量子點靠近碳納米點表面； c.磷光被猝滅； d.利用核酸適配體與凝血酶的強結合作用，磷光基團遠離碳納米點表面； e.使得磷光強度恢復； f.測定凝血酶的量。
9.如權利要求7或8所述的凝血酶的檢測方法，其特征在于，所述凝血酶適配體修飾的量子點采用如下步驟制得:取2mg的量子點，超聲分散于0.1M pH=7的磷酸鹽緩沖液PBS中，加入20mg 丁二酸酐，攪拌反應2小時；離心，用pH=7的PBS清洗后，將沉淀溶于0.02MNaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液中，并加入1.2mg EDC和1.8mg NHS,反應30分鐘；再加入50 μ L的凝血酶適配體ΤΒΑ，繼續反應12小時；反應結束后，離心分離，將沉淀溶于0.02ΜNaCl 的 0.05Μ Tris-HCl 緩沖液中 ρΗ=7.2，即得。
10.如權利要求7-9中任一項所述的凝血酶的檢測方法，其特征在于，步驟a中具體為將一條5’端帶有氨基修飾核酸適配體通過脫水縮合反應固定在巰基丙酸MPA包裹的Mn摻雜的ZnS磷光量子點表面。`
【文檔編號】B82Y40/00GK103881701SQ201310753364
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】高峰, 張璐 申請人:安徽師范大學