專利名稱：無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量pcr方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域中DNA檢測方法，尤其涉及一種無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法，用于短片段DNA檢測。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲準種植和生產。這些轉基因作物在被加工成食品、飼料的同時也產生了大量的深加工轉基因產品和加工廢棄物。
由于轉基因產品的生態安全和食用安全一直備受爭議，30多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度。這就使對于轉基因深加工產品和加工廢棄物中小片段轉基因成分的檢測方法的研究顯得格外重要。目前，已有許多研究者致力于對深加工產品成分鑒定=Breton等通過簡單重復序列的擴增片段多態性、Pafundo等則通過擴增片段長度多態性，檢測食用油中的橄欖油成分(Breton等，2004 ;Pafundo等，2005) ；Bai等通過將PCR與芯片雜交技術相結合，快速鑒定植物油中的花生、棉花、油棕、芝麻、玉米、向日葵成分(Bai 等,2011) ；Zhou等利用磁珠法富集DNA片段，然后通過突光關聯光譜法(Fluorescence cross-correlation spectroscopy),利用P-35S兀件對樣品進行轉基因篩查(Zhou等， 2009)。以上方法都是基于DNA降解程度不嚴重，能成功回收，且有足夠的長片段作為模板。 但是由于深加工產品自身的特性，DNA的提取回收困難，且回收到的均為彌散小片段，對小片段核苷酸分子的快速檢測仍為一大難題。
我們希望通過對于小片段轉基因成分的檢測方法的研究探索，進而監測轉基因深加工產品和原料加工過程中產生的廢棄物中轉基因成分，規范我國轉基因食品市場和加工企業廢棄物的排放標準，進一步完善我國轉基因安全管理體系，保障我國轉基因產業的健康發展。發明內容
本發明的目的就在于克服現有轉基因檢測技術對于短片段DNA的檢測存在的困難，提供一種無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法。
本發明的目的是這樣實現的根據需要檢測的DNA靶標序列設計出擴增片段長度在35-45bp、特異性強、靈敏度高的引物組合，分別在其上下游引物接近3’端標記熒光基團和淬滅基團，在定量PCR擴增過程中，熒光信號會隨著擴增的進行逐漸降低。
適用于短片段DNA成分的檢測，解決了原有TaqMan熒光定量PCR必須包含2條引物I條探針從而使最短檢測靶標很難低于70bp，以及染料法在PCR產物過短情況下很難區分PCR產物和引物二聚體的問題。
一、方法本方 法包括下列步驟①收集序列收集水稻、玉米、油菜和大豆等轉基因作物內標準基因以及外源基因的序列；②利用上述序列特征設計引物利用上述水稻、玉米、油菜和大豆等轉基因作物內標準基因以及外源基因的序列分別設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合；并在上游引物靠近3’端的胸腺卩密唳堿基處標記突光基團6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；③PCR擴增以含有內標準基因和外源基因的轉基因作物為研究模板，分別利用上述引物組合進行熒光定量PCR擴增；轉基因作物基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。 并在延伸步驟后記錄熒光信號強度的變化，隨著PCR產物的積累，熒光信號會逐漸降低至設定的閾值。
工作機理普通Taqman熒光定量PCR需要一對引物以及一條5 ’端標記熒光基團，3 ’端標記淬滅基團的探針，這樣就導致其最短檢測靶標長度超過70bp，而本方法則是只需要二條分別標記了熒光集團和淬滅基團的引物，這樣其檢測靶標長度其實可以達到35-45bp，也就是差不多兩條引物的長度，二者的區別在于本方法在PCR反應的過程中熒光基團和淬滅基團是先分開的，然后隨著反應的進行而結合在一起，所以其熒光信號隨著反應的進行呈下降的趨勢并且逐漸降低至設定的閾值，而普通Taqman熒光定量PCR的熒光信號值隨著反應的進行是呈上升趨勢的。
二、應用 本方法可應用于短片段DNA成分的檢測。
已經實驗驗證的可適用于本方法進行定量檢測的基因包括下列6種水稻內標準基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜內標準基因CruA、玉米內標準基因 hmga、大豆內標準基因Lectin和大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS0
已經試驗驗證的可適用于本方法進行檢測的轉基因作物包括下列17種轉基因水稻TT51-1、轉基因水稻科豐6號、轉基因水稻克螟稻、轉基因油菜0XY235、轉基因油菜RT73、轉基因油菜RF3、轉基因油菜RF2、轉基因油菜MS8、轉基因油菜MS1、轉基因油菜Topas 19/2、轉基因玉米MIR604、轉基因玉米MIRl62、轉基因玉米59122、轉基因大 Μοη89788、轉基因大豆Α2704-12、轉基因大豆Α5547-127和轉基因大豆GTS40-3-2。
與現有短片段DNA檢測方法相比，本發明具有下列優點和積極效果1、避免了TaqMan熒光定量PCR必須包含2條引物I條探針從而使最短檢測靶標很難達到35_45bp的問題；2、避免了染料法熒光定量PCR在產物過短情況下很難區分PCR產物和引物二聚體的問題。
3、適用于轉基因水稻、油菜、大豆和玉米等作物中短片段DNA的檢測。


圖1是基于本方法設計的引物組合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻內標準基因PLD 的序列中的位置圖；圖2是基于本方法設計的引物組合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在轉基因水稻TT51-1 轉化事件所含CrylAc基因的序列中的位置圖；圖3是基于本方法設計的引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜內標準基因 CruA的序列中的位置圖；圖4是基于本方法設計的引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T在玉米內標準基因hmga 的序列中的位置圖；圖5是基于本方法設計的引物組合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆內標準基因Lectin 的序列中的位置圖；圖6是基于本方法設計的引物組合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修飾過的 CP4 EPSPS的序列中的位置圖；圖7是基于本方法的水稻內標準基因PLD加空白對照定量擴增曲線圖；圖8是基于本方法的水稻外源基因TT51加空白對照定量擴增曲線圖；圖9是基于本方法的油菜內標準基因CruA加空白對照定量擴增曲線圖；圖10是基于本方法的玉米內標準基因hmga加空白對照定量擴增曲線圖；圖11是基于本方法的大豆內標準基因Lectin加空白對照定量擴增曲線圖；圖12是基于本方法的大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS加空白對照定量擴增曲線圖； 圖13是基于本方法的水稻內標準基因PLD靈敏度實驗定量擴增曲線圖；圖14是基于本方法的水稻外源基因TT51靈敏度實驗定量擴增曲線圖；圖15是基于本方法的油菜內標準基因CruA靈敏度實驗定量擴增曲線圖；圖16是基于本方法的玉米內標準基因hmga靈敏度實驗定量擴增曲線圖；圖17是基于本方法的大豆內標準基因Lectin靈敏度實驗定量擴增曲線圖；圖18是基于本方法的大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS靈敏度實驗定量擴增曲線圖； 圖19是基于本方法檢測轉基因水稻TT51-1中內標準基因PLD定量擴增曲線圖；圖20是基于本方法檢測轉基因水稻科豐6號中內標準基因PLD定量擴增曲線圖；圖21是基于本方法檢測轉基因水稻克螟稻中內標準基因PLD定量擴增曲線圖；圖22是基于本方法檢測轉基因水稻TT51-1中外源基因TT51定量擴增曲線圖；圖23是基于本方法檢測轉基因水稻科豐6號中外源基因TT51定量擴增曲線圖；圖24是基于本方法檢測轉 基因水稻克螟稻中外源基因TT51定量擴增曲線圖；圖25是基于本方法檢測轉基因油菜0XY235中內標準基因CruA定量擴增曲線圖；圖26是基于本方法檢測轉基因油菜RT73中內標準基因CruA定量擴增曲線圖；圖27是基于本方法檢測轉基因油菜RF3中內標準基因CruA定量擴增曲線28是基于本方法檢測轉基因油菜RF2中內標準基因CruA定量擴增曲線29是基于本方法檢測轉基因油菜MS8中內標準基因CruA定量擴增曲線30是基于本方法檢測轉基因油菜MSl中內標準基因CruA定量擴增曲線31是基于本方法檢測轉基因油菜Topasl9/2中內標準基因CruA定量擴增曲線32是基于本方法檢測轉基因玉米MIR604中內標準基因hmga定量擴增曲線圖；圖33是基于本方法檢測轉基因玉米MIR162中內標準基因hmga定量擴增曲線圖；圖34是基于本方法檢測轉基因玉米59122中內標準基因hmga定量擴增曲線圖；圖35是基于本方法檢測轉基因大豆Mon89788中內標準基因Lectin定量擴增曲線圖； 圖36是基于本方法檢測轉基因大豆A2704-12中內標準基因Lectin定量擴增曲線圖； 圖37是基于本方法檢測轉基因大豆A5547-127中內標準基因Lectin定量擴增曲線圖；圖38是基于本方法檢測轉基因大豆GTS40-3-2中內標準基因Lectin定量擴增曲線圖；圖39是基于本方法檢測轉基因大豆Mon89788中外源基因修飾過的CP4 EPSPS定量擴增曲線圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明詳細說明一、本方法分別對下列四種進行1、以轉基因水稻品種TT51-1為例進行本方法包括下列步驟①收集序列收集水稻內標準基因PLD和轉基因水稻TT51-1轉化事件所含CrylAc基因的序列；②利用上述序列特征設計引物設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T ；引物序列分別為PLDF2714F gctgggaggacgtgtTcg,PLDR2755T ggtgcttggcgttgcTga,BtTT51F1140F aacagagttcgcctaTgga,BtTT51R1180T cggatggcaagtTagaagagg ；并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團 6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物 PLDR2755T 和 BtTT51R1180T 靠近 3’ 端的胸腺喃唳喊基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；該引物組合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻內標準基因PLD序列中的位置如圖1所示； 引物組合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在轉基因水稻TT51-1轉化事件所含CrylAc基因的序列中的位置如圖2所示；③PCR擴增以含有水稻內標準基因PLD和水稻外源TT51-1轉化事件的轉基因水稻TT51-1為研究模板，分別利用上述引物組合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51`F1140F/BtTT51R1180T進行熒光定量PCR擴增；轉基因水稻TT51-1基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR 反應。
2、以轉基因油菜品種0XY235為例進行本方法包括下列步驟①收集序列收集油菜內標準基因CruA的序列；②利用上述序列特征設計引物設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T ；引物序列分別為BnCruAF1635F :gatgacccatctaatgcTgacg，BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa，并在上述引物BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團 6-carboxy-fluorescein (FAM),對應下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺卩密唳堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；該引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜內標準基因CruA序列中的位置如圖 3所示；③PCR擴增以含有油菜內標準基因CruA的轉基因油菜0XY235為研究模板，分別利用上述引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T進行熒光定量PCR擴增；轉基因油菜0XY235基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。
3、以轉基因玉米品種MIR604為例進行本方法包括下列步驟①收集序列收集玉米內標準基因hmga的序列；②利用上述序列特征設計引物設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T ；引物序列分別為ZmHMGFlOlF :cgtggcgtccgaagcaTt，ZmHMGRI44T :ggcggatgtcataaTaacagaaa，并在上述引物ZmHMGFlOlF靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團 6-carboxy-fluorescein (FAM),對應下游引物ZmHMGR144T靠近3’端的胸腺喃唳堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；該引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T在玉米內標準基因hmga序列中的位置如圖4所示；③PCR擴增以含有玉米內標準基因hmga的轉基因玉米MIR604為研究模板，分別利用上述引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T進行熒光定量PCR擴增；轉基因玉米MIR 604基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。
4、以轉基因大 品種Mon89788為例進打本方法包括下列步驟①收集序列收集大豆內標準基因Lectin和外源基因修飾過的CP4 EPSPS的序列；②利用上述序列特征設計引物設計擴增片段長度在35_45bp的引物組合GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T ；引物序列分別為GmLeF530F ctatcagatccaTcaaaacgacg,GmLeR568T tggccaaaTcccaagacg,MoCEF732F tccatcctctactgcttTccc,MoCER770T agcaaggcagcaaccaaTg ；并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團 6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物 GmLeR568T 和 MoCER770T 靠近 3’ 端的胸腺 U密P定喊基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)；該引物組合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆內標準基因Lectin序列中的位置如圖5所示；引物組合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS序列中的位置如圖6所示；③PCR擴增以含有大大豆內標準基因Lectin和外源基因修飾過的CP4 EPSPS的轉基因大豆 Mon89788為研究模板，分別利用上述引物組合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/ MoCER770T進行熒光定量PCR擴增；轉基因大豆Mon89788基因組DNA被水稀釋至不同含量， 進行熒光定量PCR反應。
二、具體方法1、準備工作利用SDS法提取轉基因作物DNA模板先將 20% SDS 預熱至Ij 65。C，取 15 ml SDS 抽提 buffer (O.1TrisHCl, O. 05M EDTA, IM NaCl pH8. O)加入到50ml離心管，再加入2. 5 μ β -巰基乙醇，混勻；液氮研磨3g左右的轉基因水稻TT51-1葉片、轉基因水稻科豐6號葉片、轉基因水稻克螟稻葉片、轉基因油菜 0XY235葉片，轉基因油菜RT73葉片、轉基因油菜RF3葉片、轉基因油菜RF2葉片、轉基因油菜MS8葉片、轉基因油菜MSl葉片、轉基因油菜Topasl9/2葉片、轉基因玉米MIR604種子、 轉基因玉米MIR162種子、轉基因玉米59122種子、轉基因大豆Mon89788種子、轉基因大豆 A2704-12種子、轉基因大豆A5547-127種子、轉基因大豆GTS40-3-2種子,將粉末轉至50ml 含抽提buffer的50 ml離心管中，在振蕩器上振蕩混勻，加入2 ml預熱的20%SDS，混勻， 65° C水浴至少30分鐘，其間要輕輕搖動試管；水浴后，迅速將離心管置于冰上，加入3ml 3M KAc，混勻，在冰上放置30分鐘；4 ° C 5000g離心5min ;將上清轉移到新的50 ml離心管中，加入2/3體積的異丙醇，混勻，-20° C放置30min以上；6000g，4° C離心15min， 倒掉上清，用75%乙醇洗一遍，真空干燥，用超純水溶解DNA，溶解后，將溶液轉移到15ml的離心管中；按DNA溶解體積的1%加蛋白酶K，55° C水浴30min ;加入等體積苯酚，混勻，輕搖30min,8000g離心IOmin ;轉移上清至新的tube中，加等體積的苯酹-氯仿-異戍醇(25 24 :1),輕搖20min,8000g離心15min ;轉移上清至新的tube中，加等體積的氯仿-異戍醇 (24 :1)，輕搖20min，8000g離心15min ;吸取上清，每管加入5μ1 RNase,混勻，37。C水浴 Ihr降解RNA ;用等體積的苯酹抽提一次,輕搖20min，8000g離心15 min ;轉移上清至新的離心管中，加等體積的氯仿-異戍醇(24:1)，輕搖20min,8000g離心15min ;吸上清加入 1/10體積3M NaAC，混勻，加入等體積異丙醇，-20° C放置30min，沉淀DNA ;6000g，4° C 離心15min，倒掉上清，用75%乙醇洗2遍，離心去掉75%乙醇，真空干燥；干燥后，用超純水溶解DNA備用。
2、具體操作①以水稻內標準基因PLD和水稻TT51-1轉化事件外源基因CrylAc的序列設計擴增片段長度在35-45bp的熒光標記引物組合PLDF2714F/PLDR2755T和BtTT51F1140F/ BtTT51R1180To 引物序列分別為PLDF2714F: gctgggaggacgtgtTcg, PLDR2755T: ggtgcttggcgttgcTga 以及 TT51F1140F: aacagagttcgcctaTgga, BtTT51Rl180T: cggatggcaagtTagaagagg。并在上述引物 PLDF2714F 和 TT51F1140F 靠近 3’ 端的胸腺U密唳喊基處標記突光基團 the fluorescent re·porter 6-carboxy-fluorescein (FAM), 對應下游引物PLDR2755T和BtTT51R1180T靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
針對無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法設計的上述引物組合用于熒光定量PCR分析。熒光定量PCR分析在一臺CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上進行，檢測及分析軟件為 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
轉基因水稻TT51-1轉化事件的初始模板濃度均稀釋為20ng/^l。
PCR反應體積25μ1，含模板DNA μ ，其他組分含量為lx TaqMan Universal Master,引物 PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T 各 400μΜ。
TaqMan反應條件為95° C 2分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95° C 15秒變性，60° C I分鐘退火及延伸，收集熒光信號。
分別以 PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T 為引物，以上述濃度為20ng/^l的轉基因水稻TT51-1轉化事件為模板稀釋至lOng/μΙ進行熒光定量PCR 擴增，并且做空白對照試驗，擴增曲線如圖7、8所示。所有的熒光定量反應都重復4次。
用水將轉基因水稻TT51-1基因組DNA稀釋至不同濃度，以 μ 基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含20，4，0.8，0.16，0.0321^轉基因水稻 ΤΤ51-1轉化事件基因組DNA樣品被用于靈敏度分析實驗。所有的熒光定量反應都重復4 次。
②以油菜內標準基因CruA的序列設計擴增片段長度在35_45bp的熒光標記引物組合 BnCruAF1635F/BnCruAR1679T0 引物序列分別為BnCruAF1635F gatgacccatctaatgcTgacg, BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa。并在上述引物 BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺卩密唳喊基處標記突光基團6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
針對無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法設計的上述引物組合用于熒光定量PCR分析。熒光定量PCR分析在一臺CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上進行，檢測及分析軟件為 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
轉基因油菜0XY235轉化事件的初始模板濃度均稀釋為20ng/^l。
PCR反應體積25μ1，含模板DNA μ ，其他組分含量為lx TaqMan Universal Master,弓丨物 BnCruAF1635F/BnCruAR1679T 各 400μΜ。
TaqMan反應條件為95° C 2分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95° C 15秒變性，60° C I分鐘退火及延伸，收集熒光信號。
以BnCruAF1635F/BnCruAR1679T為引物，以上述濃度為20ng/^l的轉基因油菜0XY235轉化事件為模板稀釋至lOng/μΙ進行熒光定量PCR擴增，并且做空白對照試驗， 擴增曲線如圖9所示。所有的熒光定量反應都重復4次。
用水將轉基因油菜0XY235基因組DNA稀釋至不同濃度，以 μ 基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含20，4，O. 8，O. 16，O. 032ng轉基因油菜 0XY235轉化事件基因組DNA樣品被用于靈敏度分析實驗。所有的熒光定量反應都重復4 次。
③以玉米內標準基因hmga的序列設計擴增片段長度在35_45bp的熒光標記引物組合 ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T。引物序列分別為ZmHMGF101F cgtggcgtccgaagcaTt, ZmHMGR144T :ggcggatgtcataaTaacagaaa。并在上述引物 ZmHMGFlOlF 靠近 3’ 端的胸腺卩密唳堿基處標記突光基團6-carboxy-fluorescein (FAM),對應下游引物ZmHMGR144T靠近3’端的胸腺卩密唳喊基處標記淬滅基團tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
針對無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法設計的上述引物組合用于熒光定量PCR分析。熒光定量PCR分析在一臺CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上進行，檢測及分析軟件為 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
轉基因玉米MIR604轉化事件的初始模板濃度均稀釋為20ng/^l。
PCR反應體積25μ1，含模板DNA μ ，其他組分含量為lx TaqMan Universal Master,引物 ZmHMGFlO lF/ZmHMGR144T 各 400μΜ。
TaqMan反應條件為95° C 2分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95° C 15秒變性，60° C I分鐘退火及延伸，收集熒光信號。
以ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T為引物，以上述濃度為20ng/^l的轉基因玉米MIR604 轉化事件為模板稀釋至lOng/μΙ進行熒光定量PCR擴增，并且做空白對照試驗，擴增曲線如圖10所示。所有的突光定量反應都重復4次。
用水將轉基因玉米MIR604基因組DNA稀釋至不同濃度，以 μ 基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含20，4，O. 8，O. 16，O. 032ng轉基因玉米 MIR604轉化事件基因組DNA樣品被用于靈敏度分析實驗。所有的熒光定量反應都重復4 次。
④以大豆內標準基因Lectin和外源基因修飾過的CP4 EPSPS的序列設計擴增片段長度在35-45bp的熒光標記引物組合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T。弓丨物序列分別為GmLeF530F ctatcagatccaTcaaaacgacg, GmLeR568 T tggccaaaTcccaagacg 以及 MoCEF732F tccatcctctactgcttTccc, MoCER770T :agcaaggcagcaaccaaTg。 并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團 6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物 GmLeR568T 和 MoCER770T 靠近 3’ 端的胸腺U密P定喊基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)。
針對無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法設計的上述引物組合用于熒光定量PCR分析。熒光定量PCR分析在一臺CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, USA)上進行，檢測及分析軟件為 CFX Manager Version1. 6 (Bio-Rad, Hercules, USA)0
轉基因大豆Mon89788轉化事件的初始模板濃度均稀釋為20ng/^l。
PCR反應體積25μ1，含模板DNA μ ，其他組分含量為lx TaqMan Universal Master,弓丨物 GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T 各 400μΜ。
TaqMan反應條件為95° C 2分鐘預變性以后，進行50次PCR循環95° C 15秒變性，60° C I分鐘退火及延伸，收集熒光信號。
分別以GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T 為引物，以上述濃度為 20ηδ/μ1的轉基因大豆Μοη89788轉化事件為模板稀釋至lOng/μΙ進行熒光定量PCR擴增， 并且做空白對照試驗，擴增曲線如圖11、12所示。所有的熒光定量反應都重復4次。
用水將轉基因大豆Μοη89788基因組DNA稀釋至不同濃度，以 μ 基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含20，4，O. 8，O. 16，O. 032ng轉基因大豆 Mon89788轉化事件基因組DNA樣品被用于靈敏度分析實驗。所有的熒光定量反應都重復4 次。
二、應用上述，可適用于本方法進行定量檢測的基因包括水稻內標準基因PLD、水稻外源基因 TT51、油菜內標準基因CruA、玉米內標準基因hmga、大豆內標準基因Lectin、大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS0已經試驗驗證的可適用于本方法進行檢測的轉基因作物包括基因水稻TT51-1、轉基因水稻科豐6號、轉基因水稻克螟稻、轉基因油菜0XY235，轉基因油菜RT73、 轉基因油菜RF3、轉基因油菜RF2、轉基因油菜MS8、轉基因油菜MS1、轉基因油菜Topas 19/2、 轉基因玉米MIR604、轉基因玉米MIR162、轉基因玉米59122、轉基因大豆Mon89788、轉基因大豆A2704-12、轉基因大豆A5547-127、轉基因大豆GTS40-3-2。
針對無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法分別設計針對于水稻內標準基因PLD、水稻外源基因TT51、油菜內標準基因CruA、玉米內標準基因hmga、大豆內標準基因Lectin、大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS的引物組合PLDF2714F/PLDR2755T、 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T、BnCruAF1635F/BnCruAR1679T、ZmHMGFlOlF/ZmHMG R144T、 GmLeF530F/GmLeR568T、MoCEF732F/MoCER770T,如下表所示
權利要求
1.一種適用于轉基因作物檢測的無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移 定量PCR方法，其特征在于 所述的轉基因作物包括轉基因水稻、玉米、油菜和大豆； ①收集序列 收集轉基因作物內標準基因以及外源基因的序列； ②利用上述序列特征設計引物 利用上述轉基因作物內標準基因以及外源基因的序列分別設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合； 并在上游引物靠近3’端的胸腺卩密唳堿基處標記突光基團6-carboxy-fluorescein(FAM)，對應下游引物靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記淬滅基團tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； ③PCR擴增 以含有內標準基因和外源基因的轉基因作物為研究模板，分別利用上述引物組合進行熒光定量PCR擴增；轉基因作物基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應，并在延伸步驟后記錄熒光信號強度的變化，隨著PCR產物的積累，熒光信號會逐漸降低至設定的閾值。
2.基于權利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于適用于轉基因水稻檢測的定量PCR方法 ①收集序列 收集水稻內標準基因PLD和轉基因水稻TT51-1轉化事件所含CrylAc基因的序列； ②利用上述序列特征設計引物 設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T ； 引物序列分別為PLDF2714F gctgggaggacgtgtTcg,PLDR2755T ggtgcttggcgttgcTga,BtTT51F1140F aacagagttcgcctaTgga,BtTT51R1180T cggatggcaagtTagaagagg ； 并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物 PLDR2755T 和 BtIT51R1180T 靠近 3’ 端的胸腺喃唳喊基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 該引物組合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻內標準基因PLD序列中的位置如圖1所示；引物組合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在轉基因水稻TT51-1轉化事件所含CrylAc基因的序列中的位置如圖2所示； ③PCR擴增 以含有水稻內標準基因PLD和水稻外源TT51-1轉化事件的轉基因水稻TT51-1為研究模板，分別利用上述引物組合PLDF2714F/PLDR2755T和BtIT51F1140F/BtTT51R1180T進行熒光定量PCR擴增；轉基因水稻TT51-1基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。
3.基于權利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于適用于轉基因油菜檢測的定量PCR方法 ①收集序列 收集油菜內標準基因CruA的序列； ②利用上述序列特征設計引物 設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T ； 引物序列分別為BnCruAF1635F :gatgacccatctaatgcTgacg，BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa， 并在上述引物BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團6-carboxy-f luorescein (FAM),對應下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺卩密唳堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 該引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T在油菜內標準基因CruA序列中的位置如圖3所示； ③PCR擴增 以含有油菜內標準基因CruA的轉基因油菜0XY235為研究模板，分別利用上述引物組合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T進行熒光定量PCR擴增；轉基因油菜0XY235基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。
4.基于權利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于適用于轉基因玉米檢 測的定量PCR方法 ①收集序列 收集玉米內標準基因hmga的序列； ②利用上述序列特征設計引物 設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T ； 引物序列分別為ZmHMGFlOlF :cgtggcgtccgaagcaTt，ZmHMGR144T :ggcggatgtcataaTaacagaaa， 并在上述引物ZmHMGFlOlF靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團6-carboxy-f luorescein (FAM),對應下游引物ZmHMGR144T靠近3’端的胸腺卩密唳堿基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 該引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T在玉米內標準基因hmga序列中的位置如圖4所示； ③PCR擴增 以含有玉米內標準基因hmga的轉基因玉米MIR604為研究模板，分別利用上述引物組合ZmHMGFlOlF/ZmHMGR144T進行熒光定量PCR擴增；轉基因玉米MIR604基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。
5.基于權利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于適用于轉基因大豆檢測的定量PCR方法 ①收集序列 收集大豆內標準基因Lectin和外源基因修飾過的CP4 EPSPS的序列； ②利用上述序列特征設計引物 設計擴增片段長度在35-45bp的引物組合GmLeF530F/GmLeR568T 和 MoCEF732F/MoCER770T ； 引物序列分別為GmLeF530F :ctatcagatccaTcaaaacgacg，GmLeR568T :tggccaaaTcccaagacg，MoCEF732F :tccatcctctactgcttTccc，MoCER770T agcaaggcagcaaccaaTg ； 并在上述引物GmLeF530F和MoCEF732F靠近3’端的胸腺嘧啶堿基處標記熒光基團6-carboxy-fluorescein (FAM)，對應下游引物 GmLeR568T 和 MoCER770T 靠近 3’ 端的胸腺U密P定喊基處標記淬滅基團 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 該引物組合GmLeF530F/GmLeR568T在大豆內標準基因Lectin序列中的位置如圖5所示；引物組合MoCEF732F/MoCER770T在大豆外源基因修飾過的CP4 EPSPS序列中的位置如圖6所示； ③PCR擴增 以含有大大豆內標準基因Lectin和外源基因修飾過的CP4 EPSPS的轉基因大豆Mon89788為研究模板，分別利用上述引物組合GmLeF530F/GmLeR568T和MoCEF732F/MoCER770T進行熒光定量PCR擴增；轉基因大豆Mon89788基因組DNA被水稀釋至不同含量，進行熒光定量PCR反應。
全文摘要
本發明公開了一種適用于轉基因作物檢測的無探針雙引物標記交互熒光能量共振轉移定量PCR方法，涉及生物工程技術領域中DNA檢測方法。所述的轉基因作物包括轉基因水稻、玉米、油菜和大豆；所述的方法是①收集序列；②利用上述序列特征設計引物；③PCR擴增。本發明避免了TaqMan熒光定量PCR必須包含2條引物1條探針從而使最短檢測靶標很難達到35-45bp的問題；避免了染料法熒光定量PCR在產物過短情況下很難區分PCR產物和引物二聚體的問題；適用于轉基因水稻、油菜、大豆和玉米作物中短片段DNA的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103045733SQ201210551429
公開日2013年4月17日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者吳剛, 李偉, 李曉飛 申請人:中國農業科學院油料作物研究所