一種ctla4抗體、其藥物組合物及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤治療和分子免疫學領域，涉及一種CTLA4抗體、其藥物組合物及 其用途。具體地，本發明涉及一種CTLA4的單克隆抗體。
【背景技術】
[0002] 細胞毒性T淋己細胞相關抗原-4(c}ftotoxic TIympho巧te sociated antigen4, 亦簡稱為CTLA4)與CD28分子在基因結構、染色體定位、序列的同源性及基因表達具有十分 相近的關系，都是共刺激分子B7的受體，主要表達于被激活T細胞表面。但是作為淋己細 胞激活的共刺激信號，CTLA4與CD28分子的功能是相反的，CTLA4與B7結合后能抑制小鼠 和人T細胞的激活，在T細胞活化中起負調節作用。
[0003] CTLA4mAb或CTLA4配體可W阻止CTLA4與其天然配體結合，從而封閉CTLA4對 T細胞負性調節信號的傳導，增強T細胞對各種抗原的反應性，在送方面體內與體外研究 結果基本一致。目前已有CTLA4mAb處于臨床試驗階段用于治療前列腺癌，膀脫癌，結腸直 腸癌，胃腸道癌，肝癌，惡性黑色素瘤等（GrossoJF.，化re-KunkelMN.，CTLA-4blockade intumormodels:anoverviewofpreclinicalandtranslationalresearch.Cancer Tmmun 2013 ; 13:5.E；pub2013Jan22)。
[0004] 白細胞介素2(比-2)由T細胞產生，是調節T細胞亞群的生長因子，也是調控免 疫應答的重要因子，并可促進活化B細胞增殖，參與抗體反應、造血和腫瘤監視。重組的人 IL-2已經被美國抑A批準用于治療惡性腫瘤（包括黑色素瘤、腎腫瘤等），同時正在進行 治療慢性病毒感染的臨床研究（Qiavez,A.R.,etal.,Pharmacologica血inistrationof interleukin-2.AnnNYAcadSci，2009. 1182:p. 14-27)。體外實驗中，CTLA4mAb可特異 地解除CTLA4對機體免疫抑制，激活T細胞，誘導IL-2產生，在抗腫瘤及寄生蟲等疾病的基 因治療中有廣泛應用前景。
[0005] CTLA4及CTLA4mAb作為T細胞功能狀況的重要影響因素，通過干預機體免疫微環 境，可對疾病產生特異性治療作用，并發揮較高療效，補充傳統用藥的不足，由此開辟基因 治療的新途徑。CTLA4及CTLA4mAb應用于試驗及臨床各階段；如在自身免疫性疾病中有效 抑制哮喘動物模型的氣道高反應性、阻止風濕性疾病的發展W及在同種異體移植中介導機 體免疫耐受等。但同時，盡管生物基因治療在短期臨床試驗研究中未發現不良反應，我們亦 應注意到其長期應用所存在的潛在影響，如CTLA4mAb過度阻斷CTLA4-B7信號則可導致自 身免疫性疾病的發生。由于抗體可W特異結合其配體并導致祀細胞溶解或阻斷病理進程， 所W抗體尤其人源性抗體藥物的開發利用對人類惡性腫瘤及其他免疫性疾病臨床治療有 重要意義。
[0006] 目前，尚需要開發新的阻斷CTLA4與B7的結合的抗體及其人源化抗體。

【發明內容】

[0007] 本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，利用哺乳動物細胞表達系統表達出重 組的CTLA4作為抗原免疫小鼠，經小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合獲得雜交瘤細胞。發明 人通過進行對大量樣本的篩選，得到了一種雜交瘤細胞株能夠分泌產生與CTLA4特異性結 合的特異性單克隆抗體，并且該單克隆抗體能夠十分有效地阻斷CTLA4與B7的結合。并進 一步制得了人源化抗體。由此提供了下述發明：
[0008]本發明的一個方面涉及一種雜交瘤細胞株LTOOl(CTLA4-8D2)，其于2014年6月 18日保藏于中國典型培養物保藏中必（CCTCC)，保藏編號為CCTCCN0:C2014113,保藏地址 為中國.武漢.武漢大學，郵編；430072。
[0009] 本發明的另一方面涉及本發明的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
[0010] 本發明的再一方面涉及選自如下的單克隆抗體：
[0011] (1)重鏈可變區的氨基酸序如SEQIDNO;6所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ IDNO;8 所示；
[0012] (2)重鏈可變區的氨基酸序如SEQIDNO=IO所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如 沈QIDNO; 12所示；
[0013] (3)重鏈可變區的氨基酸序如SEQIDNO;14所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如 沈QIDNO; 16所示；和
[0014] (4)重鏈可變區的氨基酸序如SEQIDNO;18所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如 沈QIDNO; 20所示。
[0015] 根據本發明任一項所述的單克隆抗體，其中，其重鏈恒定區為小鼠抗體的重鏈恒 定區或人抗體的重鏈恒定區，其輕鏈恒定區為小鼠抗體的輕鏈恒定區或人抗體的輕鏈恒定 區。
[0016] 本發明的再一方面涉及一種分離的核酸序列或者核酸序列組合，其編碼本發明任 一項所述的單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區；具體地，所述核酸序列或核酸序列組 合選自如下的（1)至（4);
[0017] (1)沈Q ID N0;5(編碼重鏈可變區），沈Q IDN0;7(編碼輕鏈可變區）；
[001引 （2)SEQIDNO;9(編碼重鏈可變區），SEQIDNO;11 (編碼輕鏈可變區）；
[0019] (3)SEQID NO; 13 (編碼重鏈可變區），SEQIDNO; 15 (編碼輕鏈可變區）；和
[0020] (4)沈QIDNO; 17 (編碼重鏈可變區），沈QIDNO; 19 (編碼輕鏈可變區）。
[0021] 本發明的再一方面涉及一種單克隆抗體偶聯物，包括單克隆抗體和偶聯部分，其 中，所述單克隆抗體為本發明中任一項所述的單克隆抗體，所述偶聯部分為選自放射性核 素、藥物、毒素、細胞因子、酶、英光素、和生物素中的一種或多種；具體地，所述偶聯部分為 藍麻毒素；更具體地，所述偶聯部分為藍麻毒素A鏈。
[0022] 本發明的再一方面涉及一種藥物組合物，其含有本發明中任一項所述的單克隆抗 體或者本發明的單克隆抗體偶聯物；可選地，其還包括藥學上可接受的載體或輔料。
[0023] 本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或者本發明的單克隆 抗體偶聯物在制備預防和/治療和/或輔助治療腫瘤的藥物中的用途；具體地，所述腫瘤選 自黑色素瘤、腎腫瘤、前列腺癌、膀脫癌、結腸直腸癌、胃腸道癌和肝癌。
[0024] 本發明的再一方面涉及本發明中任一項所述的單克隆抗體或者本發明的單克隆 抗體偶聯物在制備如下藥物中的用途：
[0025] 阻斷CTLA4與B7結合的藥物、調節（例如下調）CTLA4活性或CTLA4水平的藥物、 解除CTLA4對機體免疫抑制的藥物、激活T淋己細胞的藥物或者提高T淋己細胞中IL-2表 達的藥物。
[0026] 本發明的再一方面涉及一種預防和/治療和/或輔助治療腫瘤的方法，包括使用 有效量的本發明中任一項所述的單克隆抗體或者本發明的單克隆抗體偶聯物的步驟；具體 地，所述腫瘤選自黑色素瘤、腎腫瘤、前列腺癌、膀脫癌、結腸直腸癌、胃腸道癌和肝癌。
[0027] 本發明的再一方面涉及一種在體內或體外方法，包括使用有效量的本發明中任一 項所述的單克隆抗體或者本發明任一項所述的單克隆抗體偶聯物的步驟，所述方法選自如 下：
[0028] 阻斷CTLA4與B7結合的方法、調節（下調）CTLA4活性或CTLA4水平的方法物、解 除CTLA4對機體免疫抑制的方法、激活T淋己細胞的方法或者提高T淋己細胞中IL-2表達 的方法。
[0029] 在本發明的一個實施方案中，所述方法是非治療目的的。
[0030] 在本發明中，術語ECg。是指半最大效應濃度（concentrationfor50 %of maximaleffect)，是指能引起50 %最大效應的濃度。
[0031] 本發明中，如果沒有特別說明，所述B7為B7-1和/或B7-2 ;其具體蛋白序列為現 有技術中已知序列，可W參考現有文獻或者GenBank中公開的序列。例如，B7-1 (CD80,NCBI GeneID:941) ；B7-2(CD86,NCBIGeneID:942)〇
[0032] 發明的有益效果
[0033] 本發明的單克隆抗體8D2能夠很好地特異性與CTLA4結合，并且能夠十分有效地 阻斷化TA4與B7的結合，特異地解除CTLA4對機體免疫抑制，激活T淋己細胞。
【附圖說明】
[0034] 圖1;CTLA4ECD-mFc融合蛋白的SDS-PAGE檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品 及其上樣量依次為；M;markerl0UL;CTLA4ECD-mFc融合蛋白1Ug;CTLA4ECD-mFc融合蛋 白 2Ug;CTLA4ECD-mFc融合蛋白 3U邑。
[0035] 圖2 ;8D2抗體的SDS-PAGE檢測結果。從左至右的4個泳道的樣品及其上樣量依 次為；M:markerlO U L ;還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體0. 3 U g ;非還原型蛋白電泳上 樣緩沖液2UL ;非還原型蛋白電泳上樣緩沖液樣品抗體0. 3U邑。
[0036] 圖3 ;8D2重組抗體（8D2巧e))的SDS-PAGE檢測結果。從左至右的4個泳道的樣 品及其上樣量依次為；M:markerlOUL;