專利名稱：用于基因治療的含雜交啟動子的核酸構建體的制作方法
本申請涉及可以用于基因操作，特別是用于疾病預防或治療(下文稱為基因治療)的核酸構建體。在基因治療中，有待在有機體中表達的基因被引入到有機體中。這些基因表達的調節對基因治療的預防和治療效果有重要意義。
專利申請PCT/GB95/02000、PCT/EP95/03370、PCT/EP95/03371、PCT/EP95/03368和PCT/EP95/03339描述了基因表達的調節物。這些調節物包括激活物序列，其功能是，例如，細胞特異性或病毒特異性地激活基礎轉錄。此激活物序列的DNA序列通過其3′末端和啟動子組件的5′末端連接。接著結構基因通過其5′末端和此啟動子組件的3′末端連接。
啟動子組件由結合CDF和CHF家族或E2F和CHF家族之轉錄因子的核酸序列組成。在細胞周期的G0和G1期，這種結合導致上游激活物序列的抑制，結果使位于下游(即在轉錄方向上)的結構基因抑制或者轉錄。
在細胞分裂的G0和G1期，細胞含有的DNA以二倍體狀態存在。在G0期，細胞處于靜止狀態，而在G1期，其細胞周期進程受到抑制。G1期之后是S期，此期發生DNA合成并且基因組復制。然后是G2期，此期細胞處于四倍體狀態。G2期之后是細胞分裂期(有絲分裂＝M期)。然后子代細胞進入G0狀態和G1狀態。
在G0和G1期，細胞特異性或者病毒特異性的激活物序列和抑制激活物序列的啟動子組件組合使以細胞特異性或者病毒特異性以及細胞周期特異性(即局限于S和G2期)的方式調節結構基因的表達成為可能。
激活物序列和啟動子組件的組合體被稱為嵌合啟動子。嵌合啟動子在基因治療上有很多可能的應用，但由子其缺點也有很多限制這些限制的例子是—引起結構基因極低水平轉錄的弱激活物序列，
—在完全依靠細胞周期的方式中，不能被選擇的啟動子組件抑制的激活物序列的使用，—對兩種結構基因轉錄調節物(例如細胞特異性或病毒特異性和細胞周期特異性)的限制，—已經導入細胞中的結構基因之轉錄產物的不充分胞內運輸。
本發明通過提供本發明的核酸構建體，克服了利用已知嵌合啟動子表達外源基因的這些弱點，這些核酸構建體使得可以在宿主細胞中調節外源基因的表達。
本發明的目的是使得可以獲得能夠在宿主細胞中以精確的方式調節外源基因(轉基因)表達的核酸構建體。因此，本發明涉及核酸構建體，其中通過至少一種顯示出第一突變(這種突變抑制轉基因的正常表達)的核酸序列來完成轉基因的精確調節，另外，其中至少另一種核酸序列顯示出第二突變，這種突變消除(abolish)第一核酸序列(S)中由于突變而產生的抑制作用。
具體地說，本發明的核酸構建體通過利用可變(alternative)構建體調節宿主細胞中的轉基因表達。當含有第一突變的核酸序列是轉基因(b)(這種轉基因包含抑制所說的轉基因轉錄和/或翻譯或者抑制藥理活性化合物功能的突變)時，這種核酸構建體還包含定位于轉基因5′末端的第一啟動子或增強子序列(a)；或者，當含有第一突變的核酸序列是第一啟動子或增強子序列(a′)(其包含抑制第一啟動子功能的突變)時，核酸構建體還包含編碼藥理活性化合物的轉基因(b′)。另外，至少一種包含第二突變的核酸序列消除由于第一突變而引起的抑制作用。
這些核苷酸序列在相同或不同啟動子序列控制之下，因此轉基因只有在所有啟動子序列都被激活的情況下才能表達。
優選的是，新核酸構建體在5′末端至3′末端方向的閱讀框架中，包含至少下列組件第一(I)啟動子或者增強子序列(a)，其是非特異性的、細胞特異性或病毒特異性的，或者其可以被四環素或代謝性地和/或細胞周期特異性地激活，其激活轉基因的轉錄并且包含抑制此啟動子功能的突變(a′)，
作為結構基因的轉基因(b′)，這種轉基因編碼活性化合物并且可能包含終止結構基因轉錄和/或翻譯或者抑制結構基因產物功能的突變，第二(II)啟動子或者增強子序列(C)或(C′)，這種序列是非特異性的、細胞特異性或者病毒特異性的，或者其可以被代謝性地和/或細胞周期特異性地激活，其激活組件(d)或(d′)的基礎轉錄并且包含抑制此啟動子功能的突變，用于消除(relieve)一種或多種啟動子或者轉基因中的突變的tRNA(抑制基因tRNA)或者調節蛋白質(d)或者(d′)的基因。
第一(I)啟動子序列或者增強子序列(a)和第二(II)啟動子序列或者增強子序列(c)可以相同或不同，并且組件a)和c)至少一種可以是可非特異性地、細胞特異性地或者病毒特異性地激活的，可由四環素或者代謝性地(特別是由氧不足)或細胞周期特異性地激活的。
本發明也涉及核酸構建體，其中所說的組件b)顯示出核保留信號，這種核保留信號的cDNA在其5′末端直接或間接地和結構基因的3′末端連接，并且其中所說的核保留信號的轉錄產物顯示出結合核輸出因子的結構。
本發明也涉及核酸構建體，除組件a)和d)之外，其還含有下列組件—另一種激活核輸出因子基礎轉錄的啟動子或增強子序列(i)，和—編碼核輸出因子(k)的核酸，所說的核輸出因子和核保留信號(h)的轉錄產物結合，進而介導轉基因的轉錄產物從細胞核向細胞質的轉運。
在本發明的上下文中，啟動子序列或增強子序列a)和c)至少一種可以是嵌合啟動子，其中啟動子組件CDE-CHR或E2FBS-CHR和上游激活物序列(此激活物序列是可細胞特異性、病毒特異性或代謝性地激活的)相互作用，進而影響，特別是抑制下游基因的表達。
組件a)和c)也可以是激活物響應啟動子單位。這種構建體也具有下列組件—至少一種啟動子或增強子序列(e)，這種序列可以被非特異性地、病毒特異性地、代謝性地、由四環素或者細胞特異性地和/或細胞周期特異性地激活，—至少一種激活物亞單位(f)，其位于啟動子或者增強子序列(e)的下游，并且其轉錄由所述啟動子或增強子序列(e)激活，
—激活物響應啟動子(g)，其由(f)中描述的激活物亞單位或者幾種相同或不同激活物亞單位(f′)的表達產物激活。
在本發明的另一個實施方案中，所述核酸構建體是這種一種核酸構建體，其中啟動子序列或者增強子序列(a)和/或(c)和/或(i)和/或激活物響應啟動子(g)是嵌合啟動子，并且激活物亞單位(f)是至少一種激活激活物響應啟動子(g)之嵌合啟動子的轉錄因子。
本發明也涉及包含由兩種激活物亞單位(f，f′)激活的激活物響應啟動子(g)的核酸構建體，例如和SV40啟動子結合的LexA操縱子(單體或多體)。激活物亞單位f)包括LexA DNA結合蛋白的cDNA，這種cDNA編碼氨基酸1-81或1-202，其3′末端和Ga180蛋白質(氨基酸1-435)之cDNA的5′末端連接。第二激活物亞單位(f′)包含Ga14蛋白質的Ga180結合域之cDNA，這種cDNA編碼氨基酸851-881，其3′末端和SV40大T抗原之cDNA(編碼氨基酸126-132，其3′末端和HSV-1 VP16的反式激活域之cDNA(編碼氨基酸406-488)的5′末端連接)的5′末端連接。
在另一個由兩種激活物亞單位(f，f′)激活的激活物響應啟動子(g)的例子中，上述的Lex A操縱基因由Ga14結合域(單個或多個連續排列)替代，而LexA DNA結合蛋白質之基因由Ga14蛋白質的DNA結合域(AA1至147)替代。
本發明也涉及核酸構建體，這種核酸構建體作為激活物響應啟動子(g)，包含Ga14結合蛋白質之結合序列的單體和多體；激活物亞單位(f)包含SV40的核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；PKKKRKV，SEQ ID NO.1)、HSV-1 VP16(氨基酸406-488)的酸反式激活域(TAD)和CDA糖蛋白(氨基酸397-435)之細胞質部分的cDNA；激活物亞單位(f)包含SV40的核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；PKKKRKV)、Ga14蛋白質(氨基酸1-147)之DNA結合域的cDNA、p56 Ick蛋白質(氨基酸1-71)之CD-4結合序列的cDNA。
在另一個激活物響應啟動子單位的例子中，其中激活物的響應啟動子(g)的例子是Ga14結合序列，激活物亞單位(f)的Ga180蛋白質(氨基酸1-435)之cDNA由CD4糖蛋白(氨基酸397-437；Simpson等，癌基因41141(1989)；Maddon等，細胞4293(1985))之細胞質部分的cDNA替代，激活物亞單位(f)之Ga14蛋白質的Ga180結合域的cDNA(編碼氨基酸851-881)由p56 Ick蛋白質的CD4結合序列之cDNA替代(氨基酸1-71；Shaw等，細胞59627(1989)；Turner等，細胞60755(1990)；Perfmutter等，細胞生物化學雜志38117(1988))。
在另一個優選的實施方案中，新核酸構建體可以顯示出核保留信號(NRS)，此NRS在閱讀方向的下游(即通過其DNA的5′末端)和轉基因(b)(即在轉基因的3′末端)連接。
在另一個優選的實施方案中，核保留信號的轉錄產物具有結合核輸出因子(NEF)的結構。核輸出因子的cDNA優選通過其5′末端和另一個啟動子序列或增強子序列(其與啟動子序列a)和/或c)可以相同也可以不同)的3′末端連接。
核輸出因子(k)優選的是選自由反轉錄病毒(如HIV-1或HIV-2病毒、Visna-maedi病毒、羊關節炎腦炎病毒、馬傳染性盆血病毒和貓免疫缺陷病毒或HTLV)的rev基因、或者hnRNP-A1蛋白質的基因、或者轉錄因子TFIII-A的基因組成的組。
通常，所述核酸是DNA，此新的核酸構建體慣例上用作載體，特別是質粒載體(非病毒)或病毒載體。
通常，所述的轉基因是編碼藥理活性化合物的結構基因，這些化合物選自由細胞因子、生長因子、抗體或抗體片段、細胞因子或生長因子的受體、具有抗增殖或細胞抑制作用的蛋白質、酶、血管生成抑制劑、血栓形成誘導物質、凝結抑制劑、具有纖維蛋白溶解作用的蛋白質、血漿蛋白、補體激活蛋白、病毒包被蛋白、細菌抗原和寄生蟲抗原、對血液循環具有作用的蛋白質、肽激素、核糖核酸(如核酶和反義RNA)組成的組。
在特定的實施方案中，轉基因可以是編碼一種蛋白質的結構基因，該蛋白質觸發控制性細胞死亡。這些蛋白質的一個例子鞘磷脂酶。
在另一個實施方案中，轉基因(b)可以是編碼一種酶的結構基因，此酶切割藥物前體形成藥物。在特定的實施方案中，轉基因可以是編碼融合蛋白的結構基因，此蛋白由配位體和一種前述的蛋白或肽活性化合物組成。配位體可以是，例如抗原、抗原片段、細胞因子、生長因子、肽激素或者受體。在特定的實施方案中，結構基因可以編碼配位體—酶融合蛋白，酶切割藥物前體，進而形成藥物，并且配位體結合在細胞表面，優選的是內皮細胞或腫瘤細胞的表面。
啟動子序列、增強子序列或者激活物序列可以是選自由基因調節核苷酸序列組成的組，這些序列在內皮細胞、平滑機細胞、橫紋肌細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞、肝臟細胞、白細胞和神經膠質細胞中激活，或者選自由HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV病毒啟動子序列組成的組。
并且，激活物序列還可以是和相應抑制基因結合的四環素操縱基因。
本發明涉及包含新核酸構建體的病毒或非病毒載體，其局部或經口施用或注射到患者體內。另外，可以通過靜脈內、動脈內施用新核酸構建體到體腔、器官或皮下。
本發明也涉及分離的細胞或細胞系，其含有新核酸構建體，并且局部施用或注射給患者。
這些細胞的例子是腫瘤細胞、免疫細胞(如巨噬細胞或淋巴細胞)或者內皮細胞。具有這種特性的細胞可以用于制備治療疾病的藥物，藥物的制備包含將核酸構建體導入到靶細胞中。
新核酸構建體使得可以利用任何啟動子、增強子或者激活物序列。
轉基因(b)中或其上的新突變可以是一個或多個氨基酸的核酸序列的替代，這種替代的結果是表達的蛋白質不再具有功能。在這種情況下，組件d)是編碼tRNA的核酸序列，這種tRNA，一方面通過其反密碼子和轉基因(b)中突變的核苷酸序列之mRNA結合，另一方面，攜帶給出(take up)正確氨基酸以消除轉基因(b)的突變的末端基團。
然而，轉基因(b)中或其上的新突變也可以是結構基因中的翻譯終止密碼子(這種密碼子或者沒有發現，或者只在哺乳動物細胞中很少地發現)，以便轉基因不能被有效地翻譯。在這種情況下，組件d)是一種核酸序列，一方面其編碼具有反密碼子的tRNA，這種反密碼子和終止密碼子互補，進而消除由于結構基因(b)中的翻譯終止密碼子引起的翻譯抑制作用，另一方面，這種tRNA攜帶給出正確氨基酸的以消除轉基因(b)的突變的末端基團。
在另一個實施方案中，轉基因(b)中或其上的突變可以是啟動子序列的TATA盒的突變，這種序列定位于結構基因5′末端的上游。此突變阻斷結構基因轉錄的抑制作用。在這種情況下，組件d)是編碼和突變的TATA盒結合之蛋白質進而使轉錄能夠發生的核酸序列。
本發明還涉及通過使細胞和細胞增殖抑制量的核酸構建體接觸來抑制細胞增殖的方法，所述構建體包含至少一種含有第一突變(此突變抑制轉基因的正常表達)的核酸序列和至少一種含有第二突變(此突變消除由第一突變產生的抑制作用)的核酸序列。
本發明也涉及治療患有和過量細胞增殖有關的疾病的患者的方法，其中所說的方法包括對患者施用細胞增殖抑制量的本發明的核酸構建體。核酸構建體特別有效的疾病是腫瘤及和血管中細胞增殖相關的心血管疾病。
另外，本發明涉及一種藥物組合物，該組合物包含在藥學上可接受的載體中的細胞增殖抑制量的核酸構建體。
附圖中公開的核酸構建體只是優選實施方案的例子，無意于將本發明限制在本文公開的特定組件中。


圖1A和1B描述了在可替換的方案中核酸構建體的單個組件的排列。
圖2描述了激活物響應啟動子單位單個組件的排列。
圖3描述了核酸構建體中優選的激活物響應啟動子單位。
圖4描述了利用嵌合啟動子構建體的激活物響應啟動子。
圖5A和5B描述了在可替換的方案中另一個核酸構建體的單個組件的排列。
圖6描述了另一個核酸構建體中單個組件的排列。
圖7描述了另一個核酸構建體中幾種相同的抗腫瘤或抗炎癥物質(A，A)或不同的抗腫瘤物質(A，B)之單個組件的排列。
圖8描述了病毒物質A和抗病毒物質B之單個組件的排列。
圖9描述了含有連接在一起的元件I和元件II的本發明雜交啟動子。
圖10描述了含有連接在一起的元件IIa、III及IV的本發明的雜交啟動子。
圖11描述了本發明優選的激活物響應啟動子單位之一的核苷酸序列。
圖12描述了激活物亞單位A的融合蛋白質。
圖13描述了激活物亞單位B的融合蛋白質。
本發明涉及用于宿主細胞中調節轉基因表達的核酸構建體，這種構建體包含至少一種含有第一突變(此突變抑制轉基因的正常表達)的核酸序列，以及至少另一種含有第二突變(此突變消除第一核酸序列(S)中由突變產生的抑制作用)的核酸序列。
這些核苷酸序列在相同或不同啟動子序列控制之下，因此只有在所有這些啟動子序列全部被激活時，轉基因才能表達。
優選的是，新的核酸構建體在5′至3′末端方向的閱讀框架中包含至少下列組件—第一啟動子或增強子序列(a)，這種序列激活轉基因的轉錄，并且可以包含也可以不包含抑制第一啟動子(a′)功能的突變，—編碼藥理活性化合的的轉基因(b′)，其可以包含也可以不包含突變(b)，這種突變終止轉基因的轉錄和/或者翻譯，或者抑制藥理活性化合物的功能，—第二啟動子或者增強子序列(c)，此序列激活組件d)的基礎轉錄，并且可以包含也可以不包含抑制第二啟動子功能的突變，—用于消除轉基因(b)或啟動子(a)或(c)至少一種中的突變的tRNA(抑制基因tRNA)或者調節蛋白質(d)的基因。
圖1A和1B(方案A和B)以舉例的方式描述了單個組件的排列。這些附圖顯示核酸構建體的可替換的實施方案。
在本發明的新核酸構建體中，組件a)或c)的啟動子或增強子序列可以相同或不同，并且，組件c)和d)可以定位在組件a)和b)的上游或下游。
至少一種強啟動子或者增強子序列(如來源于CMV(EP-A-0173177)或者SV40的)，或者和相應的阻遏物組合的四環素操縱基因，或者任何其它的啟動子序列或者增強子序列(這些對技術人員來說都是熟悉的)優選地用作啟動子或者增強子序列。
在優選的實施方案中，可以細胞特異性地、代謝性地(例如，由氧不足)、病毒特異性地或細胞周期特異性地激活新核酸構建體中至少一種啟動子序列或增強子序列。
下列啟動子或者增強子序列是特別優選的
能夠細胞特異性地激活內皮細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞、造血細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、神經膠質細胞或腫瘤細胞的那些啟動子序列或者增強子序列；和/或HBV、HCV、HSV、HPV、CMV、EBV、HTLV或者HIV病毒的啟動子或者增強子序列；和/或可以被代謝性地激活的啟動子或者增強子序列，例如氧不足可誘導的增強子(Semenza等，PNAS 88，5680(1991))或啟動子(Mc Burney等，核酸研究19，5755，(1991)；WO95/21927)；和/或可以被細胞周期特異地激活的啟動子，如cdc25C基因、細胞周期蛋白A基因、cdc2基因的啟動子(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995)，Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)，Zwicker等，核酸研究23，2833(1995)；B-myb基因啟動子(Lam等，EMBO J.12，2705(1995)；DHFR基因啟動子(Means等，分子細胞生物學12，1054(1992)和EI-1基因啟動子(Johnson等，基因進展8，1514(1994)，Hsiao等，基因進展8，15256(1994))或者其它結合轉錄因子的序列(這種序列在細胞增殖期間出現或激活)。這些結合序列的例子是被稱為Myc E盒的核苷酸序列的單體或多體(Blackwood和Eisenmam，科學251，1211(1991))。
還有可以由四環素激活的啟動子(如和相應的阻遏物組合的四環素操縱基因(Gos sen等，TIBS 18，471(1993)，Dingermann等，EMBO J.11，1487(1992)，Gossen等，科學268，1766(1995)也是本發明范圍內可以利用的。
在另一個優選的實施方案中，新核酸構建體中至少一種啟動子序列或者增強子序列是嵌合啟動子。在本發明中，嵌合啟動子是上游激活序列(其可以被細胞特異性地、代謝性地或者病毒特異性地激活)和下游啟動子組件的組合體。優選的是，該啟動子組件包含含有CDEE-CHR元件或者E2FBS-(Bmyb)-CHR元件的核苷酸序列，因此能夠在細胞周期的G0和G1期抑制上游激活物序列的激活(Lucibello等，EMBO J.14，132(1994)，PCT/GB95/02000；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，科學271，1595(1996))。
在另一個優選的實施方案中，新核酸構建體中至少一種啟動子序列或者增強子序列(組件a)或c))是激活物響應啟動子單位。
對此部分來說，激活物響應啟動子由下列組件組成—一種或多種相同或不同啟動子或者增強子序列(s)(e)，這種序列可以被，例如，細胞周期特異性地、代謝性地、細胞特異性地或病毒特異性地激活，或者可以被細胞周期特異性地與和代謝性地、細胞特異性地或病毒特異性地激活(所謂的嵌合啟動子)，—一種或幾種相同或者不同的激活物亞單位(s)(f)，其在任何情況下都定位在啟動子或者增強子序列的下游并且這些序列激活其基礎轉錄；—由一種或幾種激活物亞單位(s)的表達產物激活的激活物響應啟動子(g)。
附圖2的方案C以舉例的方式描述了激活物響應啟動子之單個組件的排列。
附圖3的方案D)以舉例的方式描述了新核酸構建體中優選的激活物響應啟動子的插入。
在激活物響應啟動子單位最簡單的形式中，其可以是，例如，如附圖4的方案E所描述的嵌合啟動子構建體。
在另一個實施方案中，按照本發明的激活物響應啟動子可以是結合嵌合轉錄因子的序列，這些序列由DNA結合域、蛋白質和蛋白質相互作用域和反式激活域組成。作為藥理活性化合物優選的結構基因是蛋白質和糖蛋白，這些蛋白質選自由細胞因子、生長因子、細胞因子或生長因子受體、抗體或抗體片段、配位體(如抗體或抗體片段)和細胞因子或者生長因子組成的融合蛋白質、具有抗增殖或細胞抑制作用的蛋白質、血管形成抑制因子、血栓形成誘導蛋白質、凝結抑制因子、血漿蛋白質、補體激活蛋白質、病毒包被物質和細菌包被物質。
按照本發明，在一個特定的實施方案中提供了具有突變(此突變阻止功能蛋白質(或肽)的表達)的結構基因(轉基因-組件b))。
此突變可以由一個或幾個氨基酸的核苷酸序列替代，替代的結果是表達的蛋白質不再具有功能(錯義突變)，即不再產生任何活性化合物或任何功能酶。在結構基因(轉基因-組件b))發生這種特性的突變時，組件d)是編碼tRNA的核苷酸序列，這種tRNA一方面通過其反密碼子和結構基因(組件b))之mRNA的突變位點結合，另一方面攜帶給出正確氨基酸以消除轉基因(抑制基因tRNA)中的突變的末端基團。
在上下文中，正常情況下，只很少地用于哺乳動物細胞中的那些tRNA將，具體地說，突變成抑制基因tRNA，以使細胞總翻譯效率的負結果最小化。
在另一個實施方案中，結構基因的突變是引入了一個或多個翻譯終止密碼子(無義突變)。已知mRNA中的核苷酸序列UAA、UGA和UAG是翻譯終止密碼子。這些終止密碼子相應的DNA序列是DNA的TAA、TGA和TAG編碼鏈。這些終止密碼子之一作為突變優選地插入到結構基因(組件b))的DNA序列中。
基因結構基因(組件b))發生這種特異的突變時，組件d)是編碼tRNA(抑制基因tRNA)的核酸序列，這種tRNA，一方面通過其反密碼子和突變，即和結構基因(組件b))之mRNA的導入的終止密碼子結合，另一方面，攜帶給出正確氨基酸(這些氨基酸在突變的位點上由原來的DNA序列編碼)的末端基團，已經描述了大腸肝菌、酵母和植物細胞中這種特性的核酸序列(b)(Dingermann等，分子細胞生物學12，4038(1992)，EMBO J.11，1487(1992)；Gossen等TIBS 18，471(1993)；Gatz等，植物雜志2，397(1992))。按照本發明，正常情況下在哺乳動物中只很少使用的tRNAs，在這種情況下，也突變成抑制基因tRNAs。
這樣，例如，可以選擇下列組合體(Lewin編輯，基因IV，牛津大學出版1990，151頁)
表1氨基酸 密碼子終止突變 抑制基因tRNA 和抑制基因tRNA 基因座(密碼子) (反密碼子)聯系的氨基酸Tyr UAU UAG CUA Tyr sup F(su+3)Tyr UAC UAA UUA Tyr sup C(su+4)Ser UCG UAG CUA Ser sup D(su+1)Gln CAG UAG CUA Gln sup E(su+2)Lys AAA UAA UUA Lys sup G(su+5)Lys AAG UAG UUA Lys sup G(su+5)TrP UGG UGA UCA Trp sup U(su+7)TrpUGG UCA Trp sup U(su+7)在另一個實施方案中，結構基因(組件b)中或其上的突變可以是位于結構基因5′末端上游之啟動子序列(組件a))的TATA盒的突變。TATA盒(TATAAA)被認為是RNA聚合酶II和III的中央起始位點，這些聚合酶出現在細胞核中。通過和TATA盒結合蛋白質(TBP)的結合，轉錄在TATA盒起始，在實質性的方式中，TBP和出現在細胞核中的所有RNA聚合酶(I、II、III)的轉錄相關。嚴格依賴TATA盒的啟動子的例子是U6基因的啟動子，此基因通過RNA聚合酶III轉錄，并且該基因產物以實質性的方式和mRNA的剪接相關。
按照本發明，依賴于突變的TATA盒的啟動子(組件a))定位于結構基因(組件b))的5′末端上游。這種變突的例子可以是TGTAA。突變的結果是不再能識別正常TBP的DNA結合位點，并且結構基因(b)不再有效地轉錄。在發生這種特性的突變時，組件d)是編碼共突變的TBP的核酸序列。共突變的結果是，TBP和組件a)中突變的TATA盒(例如和TGTAAA)結合，結果引起結構基因(組件b))的有效轉錄。TBP基因的這種共突變已由，例如，Strubin和Struhl(細胞68，721(1992))和Heard等(EMBO J.12，3519(1993)描述。
在另一個優選的實施方案中，在合適的位點將核保留信號(NRS)(h)和核輸出信號加入到新核酸構建體中，附圖5的方案F)和G)描述了新核酸構建體中單個組件的排列。
在另一個優選的實施方案中，方案F)和G)描述的核酸構建體彼此組合。這種方式的組合能夠包括另一個啟動子(啟動子IV，組件e))。附圖6的方案H)通過舉例的方式描述了這種組合中單個組件的排列。
核保留信號是阻止前信使RNA轉運的核苷酸序列，前信使RNA通過核膜和其連接，但另一方面，前信使RNA組成結合輸出蛋白質(被稱為核輸出因子)的結構。核輸出因子(NEF)介導含有NRS的前信使或者信使RNA從細胞核向細胞質的轉運。含有NRS的前信使或信使RNA通過和NEF結合，結果由細胞核分泌出(Fischer等，細胞82，475(1995))。
NRS(組件h))優選的是反轉錄病毒rev響應元件(RRE)序列。在HIV-1中RRE是env基因(malim等，自然338，254(1989)；kjems等，PNAS 88，683(1991))中的包含243個核苷酸(核基酸7362-7595；Muesing等，自然313，450(1985)的序列。然而，在本發明中，核保留信號(NRS)也可以是同源和/或功能相似(類似)的核苷酸序列，例如HBV病毒的RRE等同元件(Huang等，分子細胞生物學13，7476(1993))。
在新核酸構建體中，核輸出因子(NEF，組件K)是編碼結合NRS之mRNA蛋白質的核苷酸序列，并且介導包含NRS的前信使RNA或信使RNA從細胞核轉運到細胞質(或者從細胞質到細胞核)。在本發明的上下文中，具體使用來源于反轉錄病毒的rev基因，特別是來源于HIV-1病毒或HIV-2病毒的基因(Daly等，自然342，816(1989)；Emerman等，細胞57，1155(1989)；Felber等，PNAS 86，1495(1989)；Fischer等，EMBO J.13，4105(1994))。
反轉錄病毒的rev基因之rev蛋白通過其N末端域(Zapp等，自然342，714(1989)；malim等，細胞65，241(1991))和前信使mRNA的RRE結合(Iwai等，核酸研究20，6465(1992))。RRE和rev蛋白質的結合使非剪接的前信使RNA以及任何其它含有RRE的RNA從細胞核轉運到細胞質中(Fischer等，EMBO J.13，4105(1994)；Fischer等。細胞82，475(1995))，結果實質上是增加了翻譯。
在本發明的上下文中，編碼和HIV-1 rev蛋白質同源且功能相似之蛋白質(Bogerd等細胞82，485(1995)的核苷酸序列(如visna maedi病毒(VMV；Tiley等，病毒學雜志65，3877(19917)rev基因，或風濕性關節炎腦炎病毒(CAEV；Tiley等，病毒學雜志65，3877(19917)rev基因)也可以用作NEF。
然而，在本發明的上下文中，也可以利用那些編碼和HIV-1 rev蛋白質功能相似之蛋白質(在該蛋白質和rev蛋白質只具有很少的同源性或沒有同源性時)的基因。
這些基因的例子是HTLV-1 rex基因(Cullen，微生物學綜述56，375(1992)、馬傳染性盆血病毒(EIAV)rev基因和貓免疫缺陷病毒(FIV)rev基因(manusco等，病毒學雜志68，1988(1994))。
在另一個實施方案中，NEF也可以是一種蛋白質的核苷酸序列，這種蛋白質引起RNA從細胞核中分泌，甚至細胞核中沒有由NRS保留的這種RNA。這種蛋白質的例子是轉錄因子TFIIIA(Gaddat等，細胞60，619(1990)；Drew等，基因159，215(1995)或核內不均一核糖核蛋白復合體A1(hnRNPA1-蛋白質；Pinol-Roma等，自然355，730(1992))。
廣義來講，核轉運蛋白質也包括熱激蛋白70(hsc 70；mandell等，細胞生物學雜志111，1775(1990))和蛋白激酶抑制劑CPKI(Fantozzi等，生物化學雜志269，2676(1994)，Wen等，生物化學雜志269，32214(1994))。
NEF和其同源及相似蛋白質共有的特性是位于氨基末端用于單體蛋白質和NRS之RNA結合的域，以及大多數富含亮氨酸(hnRNPA1是一個例子)且對NEF運輸功能是必需的域(Wen等，細胞82，463(1995)；Fischer等，細胞82，475(1995)；malim等，病毒學雜志65，4248(1991)；Venkatesh等，病毒學178，327(1990))。
NEF基因(組件k))的表達可能在啟動子序列(組件i)＝啟動子和增強子序列III)的控制之下，這種啟動子序列位于NEF基因5’末端的上游。
可以選擇如已經描述的用于啟動子和增強子序列I和II(組件a)和c))的核酸序列之一可以選擇來用作按照本發明的啟動子和增強子序列III或IV(參見附圖6的方案H)。
核酸構建體優選由DNA組成。術語“核酸構建體”被理解為指可以在靶細胞中轉錄的人工核酸結構。其最好是插入到載體中，特別優選的是非病毒載體、質粒載體或病毒載體。這些載體和藥學上可接受的載體混合，以產生用于基因治療的藥物組合物。藥學上可接受的載體對本領域的技術人員是公知的，并且含有核酸構建體的優選劑量可以通過方便的技術很容易確定。然后將藥物組合物局部施用給患者，用于疾病的預防和治療，或者注射或者通過靜脈內、動脈內施用到體腔、器官或皮下。在治療腫瘤時，將藥物組合物直接注射到腫瘤中。然而，可以利用其它已知的通過合適載體的給藥方法(例如以導管為基礎的基因治療)。
由于術語“治療”涉及對患者施用包含本發明的核酸構建體之載體，其應當理解為包括對患者給藥，以用于疾病的預防和改善。這些載體對過量細胞增殖的疾病特別有用。
新核酸構建體可以用于與結構基因一起細胞特異性地、或病毒特異性地、或在限定的代謝條件下或在暴露于四環素下后和細胞周期特異性地表達轉基因(組件b))，所述結構基因優選的是編碼藥理活性化合物或其它切割非活性藥物前體形成活性藥物的酶的基因。可以選擇結構基因，以便藥理活性化合物或酶和配體一起作為融合蛋白質表達，這種配體和細胞(如增殖內皮細胞或腫瘤細胞)表面結合。
本發明也涉及含有新核酸構建體的酵母細胞或哺乳動物細胞。在特別優選的實施方案中，將核酸構建體導入到轉染后可用作轉基因表達的細胞系中。結果這些細胞可用作制備用于患者的藥物，并且也局部施用給或注謝到患者體內，以便用于疾病的預防或治療。
新核酸構建體實際上不能以這種形式出現，即活性化合物或酶或配體/酶融合蛋白質的轉基因或結構基因不能天然地突變和不能天然地與消除這種突變的核酸序列組合；并且，其也不能天然地與核保留信號(NRS)組合，同時這兩種序列都不能與啟動子I(a)及啟動子II(c)天然組合，這種組合體依次不能與由啟動子III和核輸出因子(NEF)組成的核苷酸序列天然組合。
作為應用的函數選擇新核酸構建體的啟動子I、II、III和IV以及活性化合物(或者酶)的結構基因。
根據核酸構建體計劃的用途，可以選擇下列實施方案
1.通過抑制增殖的內皮、治療腫瘤和慢性炎癥1.1a)在內皮細胞中激活的啟動子或者增強子序列的選擇在本發明的上下文中，由啟動子或者增強子組成的優選的啟動子或者增強子序列包括那些基因調節序列和/或編碼蛋白質的基因元件，所述蛋白質具體地說可以在內皮細胞中(或者在其它和增殖內皮細胞極接近的細胞中)檢測到。
Borrow等(藥物理論64，155(1994))和Plate等(腦病理學，4，207(1994))描述了這些蛋白的一部分。這些內皮細胞特異性蛋白質的特定例子是-人腦特異性，內皮葡萄糖-I-轉運蛋白Murakami等(生物化學雜志267，9300(1992))描述了啟動子序列。
-EndoglinBellon等(歐洲免疫學雜志23，2340(1993)))和Ge等(基因138，201(1994))描述了啟動子序列的一部分。
-VEGF受體識別了兩種不同的受體(Plate等，國際癌雜志(Int.J.Cancer)59，520(1994))·VEGF受體-1(flt-1)(de Vries等，科學255，989(1992)；Wakiya等血管研究雜志33，105(1996))和·VEGF受體-2(flk-1，KDR)(Terman等BBRC 187，1579(1992))。
這兩種受體都只在內皮細胞中發現(Senger等，癌遷徒研究12，303(1993))。
-其它內皮細胞特異性受體酪氨酸激酶·til-1和til-2(Partanen等，分子細胞生物學12，1698(1992)，Schniirch和Risau，發育19，957；Dumont等，癌基因7，1471(1992))·B61受體(Eck受體)(Bartley等，自然368，558(1994)，Pandey等，科學268，
567(1995)；van der Geer等，細胞生物學年度綜述10，251(1994))-B61B61分子是B61受體的配位體(Holzman等，美國腎學會雜志4，466(1993)；Bartley等，自然368，558(1994))-特別是內皮·內皮BBenatti等(臨床研究雜志91，1149(1993))描述了啟動子序列。
·內皮-1Wilson等(分子細胞生物學10，4654(1990))描述了啟動子序列。
-內皮受體，特別是內皮B受體(Webb等，分子病理學47，730(1995)；Haendler等，心血管病理學雜志20，1(1992))。
-甘露糖-6-磷酸鹽受體Ludwig等(基因142，311(19949)；Oshima等，生物化學雜志263，2553(1988))和Pohlmann等(PNAS US 84，5575(1987))描述了啟動子序列。
-von Willebrand因子Jahroudi和Lynch(分子細胞生物學14，999(1994))、Ferreira等(生物化學雜志293，641(1993))和Aird等(PNAS US 92，4567(1995)))描述了啟動子序列。
-IL-1α，IL-1βHangen等(分子致癌物質2，68(1986))、Terner等(免疫學雜志143，3556(1989))、Fenton等(免疫學雜志138，3972(1987))、Bensi等(細胞生長分化1，491(1990))、Hiscott等(分子細胞生物學13，6231(1993))和Mori等(血液84，1688(1994))描述了啟動子序列。
-IL-1受體Ye等(PNAS US 90，2295(1993))描述了啟動子序列。
-血管細胞附著分子(VCAM-1)Neish等(分子細胞生物學15，2558(1995))、Ahmad等(生物化學雜志270，8976(1995))、Neish等(實驗醫學雜志176，1583(1992))、Jademarco等(生物化學雜志267，16323(1992))和Cybulsky等(PNAS US88，7859(1991))描述了VCAM-1啟動子序列。
-合成的激活物序列作為天然的內皮特異性啟動子的一種替換，也可以利用合成的激活物序列，這種序列包含在內皮細胞中是優先或選擇性活性的轉錄因子之寡聚結合位點。這種轉錄因子的例子是轉錄因子GTTA-2，其在內皮細胞um-基因中的結合位點是5-TTATCT-3′(Lee等，生物化學雜志266，16188(1991)；Dorfmann等，生物化學雜志267，1279(1992)和Wilson等，分子細胞生物學10，4854(1990))。
1.1.b)在激活的內皮細胞附近之細胞中激活的啟動子或者激活物序列的選擇當內皮細胞進行增殖時，通過打開緊密接頭，相鄰的細胞變得能夠使來源于血液的大分子進入。這種功能和結構相互作用的結果是，和激活的內皮細胞鄰近之細胞成為本發明意義之內的靶細胞。
-VEGFVEGF基因的基因調節序列是·VEGF基因的啟動子序列(5′側翼區)(Michenko等，細胞分子生物學研究40，35(1994)；Tischer等，生物化學雜志266，11947(1991))或者·VEGF基因的增強子序列(3′側翼區)(Michenko等，細胞分子生物學研究40，35(1994))或者·C-Src基因(Mukhopadhyay等，自然375，577(1995)；Bonham等，癌基因8，1973(1993)；Parker等，分子細胞生物學5，831(1985)，Anderson等，分子細胞生物學5，112(1985))或者·V-Src基因(Mukhodpadhyay等，自然375，577(1995)；Anderson等，分子細胞生物學5，112(1985)；Gibbs等，病毒學雜志53，19(1985))-類固醇激素受體和他們的啟動子組件(Truss和Beato，內分泌學研究14，459(1993))，特別是
·小鼠乳房腫瘤病毒啟動子Chalepakis等(細胞53，371(1988))及Truss和Beato(內分泌學研究14，459(1993))描述了MMTV長末端重復區的啟動子區之cDNA序列。
1.2.抗腫瘤(或者抗炎癥)物質的結構基因1.2.a)增殖抑制劑在本發明中，抗腫瘤或者抗炎癥物質應理解為抑制內皮細胞增殖之蛋白質的DNA序列。這種DNA序列的例子是以下蛋白質的DNA序列-成視網膜細胞瘤蛋白質(pRb/p110)或者其類似物p107和120-p53蛋白質-p21(WAF-1)蛋白質-p16蛋白質-其它CdK抑制蛋白-GADD45蛋白質-bak蛋白質。
為了阻止這些細胞周期抑制劑在胞內迅速失活，優選使用在表達蛋白質的失活位點顯示出突變，因而這些蛋白質的功能沒有受到破壞的那些基因。
成視網膜細胞瘤蛋白質(pRb)和相關的p107和p130蛋白質通過磷酸化滅活。優選使用發生點突變的pRb/p110、p107或者p130 cDNA序列，這樣編碼蛋白質的磷酸化位點由不能磷酸化的氨基酸替代。
1.2.b)凝結誘導因子和血管形成抑制劑抗腫瘤或者抗炎癥物質也將理解為誘導凝結和/或者抑制血管形成之蛋白質的DNA序列。這些蛋白質的例子是-組織因子(TF)和其凝結活性片段(Morrissey等，細胞50，129(1987)；Scarpati等，生物化學26，5234(1987)；Spicer等，PNAS US 84，5148(1987)；Rehemtulla等，Thromb.Heamost.65，521(1991))-血纖維蛋白溶酶原激活抑制劑-1(PAI-1)-PAI-2-PAI-3
Angiostatin和類似的抗血管生成肽(O′Reilly等，自然醫學2，689(1996)；Folkman等，新英格蘭醫學雜志26，1757(1995))-干擾素·IFNα·IFNβ·IFNγ-Thrombospondin-TNFα-血小板因子4-IL-2-TIMP-1-TIMP-2-TIMP-3-白血病抑制因子(LIF)1.2.c)細胞抑制和細胞毒素蛋白質然而，抗腫瘤或者抗炎癥物質也應理解為對腫瘤細胞直接或者間接顯示出細胞抑制作用的蛋白質之DNA序列。具體地說，所述蛋白質包括-抗體或抗體切割產物-穿孔素-粒酶-IL-2-IL-4-IL-12-干擾素，例如·IFNα·IFNβ·IFNγ-TNF·TNFa·TNFB
-制瘤素M-神經磷脂酶(Jarvis等PNAS-美國91，73(1994))-瓜蟾抗菌肽和瓜蟾抗菌肽衍生物(Cruciani等，PNAS 88，3792(1991)；Jacob等，Ciba Found.Symp.186，197(1994)；Peck-Miller等，癌化學療法藥理學32，109(1993))1.2.d)感染誘導物抗腫瘤物質也應理解為這樣一種蛋白質的DNA序列，這種蛋白質除了其抗腫瘤作用外，也能刺激感染，進而有助于腫瘤細胞的消除。這些蛋白質特定的例子是-RANTES(MCP-2)-單核細胞趨化性和激活因子(MCAF)-IL-8-巨噬細胞炎性蛋白-1(MIP-1α和-β)-嗜中性白細胞活化因子-2(NAP-2)-IL-3-IL-4-IL-5-人類白血病抑制因子(LIF)-IL-7-IL-11-IL-13-GM-CSF-G-CSF-M-CSF-眼鏡蛇毒因子(CVF)或它的部分序列，其功能相當于人類補體因子C3b，即其能夠和補體因子B結合，在用因子D切割之后，形成C3轉化酶。Frikinger等(美國科學院學報91，12775(1994))公開了CVF的DNA序列和其部分序列。
-人類補體因子C3和它的部分序列C3b。De Bruijn等(美國科學院學報82，708(1985))公開了C3的DNA序列及其部分序列。
-和CVF功能及結構類似的人類補體因子C3的切割產物。OKeefc等(生物化學雜志263，12690(1988))描述了這種特性的切割產物。
-激活補體或者觸發炎癥的細菌蛋白質，如Salminella typhimurium膜孔蛋白(Galdiero等，感染和免疫性46，55(1994))、金黃色釀膿葡萄球菌叢生因子(Espersen ACTA Path.Microb.Et Imm.Scandin.Sect C93，59(1985))、modulins，特別是那些革蘭氏陰性細菌(Henderson等，炎癥研究44，187(1995))、軍團菌屬的主要外部膜蛋白(Bellinger-Kawahara等，實驗醫學雜志172，1201(1990))、或者嗜血菌屬的流感B型(BHetherington等，感染和免疫60，852(1992))、或者來源于克雷伯氏菌屬(Alberti等，感染和免疫61，852(1992))、或者來源于鏈球菌屬G族的M分子(Campo等，傳染病雜志171，601(1995))。
融合蛋白的DNA序列，一方面其在所列出的細胞因子或生長因子和細胞膜上的受體配位體(例如，內皮細胞或腫瘤細胞特異性的抗體，或者人類免疫球蛋白的Fc部分)之間形成，另一方面，其可作為本發明的活性物質。已經描述了例如在EPA 0464 633 A1中具有這種性質的DNA序列。
1.2.e)用以激活細胞抑制劑前體的酶然而，抗腫瘤或者抗炎癥物質也應理解為一種酶的DNA序列，這種酶能夠把抗腫瘤活性化合物的前體轉化成為抗腫瘤活性化合物。
Deonarain等(英國癌癥雜志70，786(1994))、Mullen(藥物治療63，199(1994))和Harris等(基因治療1，170(1994))已經描述了具有這種特性的酶(其切割非活性前體物質(前藥物(prodrugs)，進而形成在每種情況下相關的活性細胞抑制劑(藥物)、前體藥物和藥物)。
例如，下列酶之一的DNA序列可被使用-單純皰疹病毒胸苷激酶(Garapin等，PNAS US 76，3755(1979)；Vile等，癌研究，53，3860(1993)；Wagner等，PNAS US 78，1441(1981)；Moelten等，癌研究46，5276(1986)；國家癌癥協會雜志82，297(1990))-水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶
(Huber等，PNAS US 88，8039(1991)，Snoeck，完美抗菌劑雜志(Int.J.Antimicrob.)4，211(1994))-細菌硝酸還原酶(Michael等，FEMS微生物學通訊125，195(1994)；Bryant等，生物化學雜志266，4126(1991)；Watanabe等，核酸研究。18，1059(1990))-細菌β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson等，PNAS US 83，8447(1986))-Secale cereale的植物β-葡萄糖醛酸酶(Schulz等，植物化學26，933(1987))-人類β-葡萄糖醛酸酶(Bosslet等，英國癌癥雜志65，234(1992)；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))·例如，人類羧肽酶(CB)，·肥大細胞CB-A(Reynolds等，臨床研究雜志89，273(1992))·胰CB-B(Yamamoto等，生物化學雜志267，2575(1992)；Catasus等，生物化學雜志270，6651(1995))·細菌羧肽酶(Hamilton等，細菌學雜志174，1626(1992)；Osterman等，蛋白質化學雜志11，561(1992))-細菌β-內酰胺酶(Rodrigues等，癌研究55，63(1995)；Hussain等，細菌學雜志164，223(1985)；Coque等，EMBO J.12，631(1993))-細菌胞嘧啶脫氨酶(Mullen等，PNAS US 89，33(1992)；Austin等，分子藥理學43，380(1993)；Danielson等，分子微生物學6，1335(1992))-人類過氧化氫酶或者過氧物酶(Ezurum等，核酸研究21，1607(1993))-磷酸酶，特別是
·人類堿性磷酸酶(Gum等，癌研究50，1085(1990))·人類酸性前列腺磷酸酶(Sharieff等，美國人類基因雜志49，412(1991)；Song等，基因129，291(1993)；Tailor等，核酸研究18，4928(1990))·5型酸性磷酸酶(基因130，201(1993))-氧化酶，特別是·人類賴氨酰氧化酶(Kimi等，生物化學雜志270，7176(1995))·人類酸性D-氨基氧化酶(Fukui等，生物化學雜志267，18631(1992))-過氧化物酶，特別是·人類谷胱甘肽過氧化物酶(Chada等，基因組學6，268(1990)；Ishida等，核酸研究15，10051(1987))·人類嗜酸性細胞過氧化物酶(Ten等，實驗醫學雜志169，1757(1989)；Sahamaki等，生物化學雜志264，16828(1989))·人類甲狀腺過氧化物酶(Kimura，PNAS US 84，5555(1987))。
-半乳糖苷酶為了有利于所列出酶的分泌，在每種情況下都包含在DNA序列中的同源信號序列可以由促進胞外分泌的異源信號序列代替。
這樣，β-葡萄糖醛酸酶的信號序列(DNA位點≤27-93；Oshima等，PNAS84，685(1987))可以由，例如，免疫球蛋白的信號序列(DNA位點≤63-≥107；Riechmann等，自然332，323(1988))或者由CEA的信號序列(DNA位點≤33-≥134；Schrewe等，分子細胞生物學10，2738(1990)，Berling等，癌研究50，6534(1990))或者由人類呼吸合胞體病毒糖蛋白的信號序列(氨基酸的cDNA≤38-≥50或48-65；Lichtenstein等，普通病毒學雜志77，109(1996))替代。
此外，優選的是選擇這些酶的基因，作為點突變的結果，這些酶只很少地儲存在溶酶體中，并以增加的程度分泌。已經描述了這種性質的點突變，例如，β-葡萄糖醛酸酶的(Shiplex等，生物化學雜志268，12193(1993))。
另外(或者此外)，可以將跨膜域的序列導入到信號序列中，目的是將酶錨定在酶形成細胞的細胞膜上。
這樣，可以將人類巨噬細胞菌落激活因子的跨膜序列(DNA位點≤1485-≥1554；Cosman等，Behring.Inst.Mitt.83，15(1988))、或者人類呼吸合胞體病毒(RSV)糖蛋白G的信號及跨膜域之DNA序列(氨基酸1-63或者它們的部分序列，氨基酸38-63； Vijaya等，分子細胞生物學8，1709(1988)；Lichtenstein等，普通病毒學雜志77，109(1996))、或者流感病毒神經氨酸酶之信號及跨膜域的DNA序列(氨基酸7-35或者其部分序列(氨基酸7-27)；Brown等，病毒學雜志62，3824(1988))插入到啟動子DNA序列和酶(例如D-葡萄糖醛酸酶)的DNA序列之間。
為了擴大翻譯，可以將核苷酸序列GCCACC或者GCCGCC插入到信號及跨膜序列啟動子的3′末端，并恰好在起始信號(ATG)的5′末端之前(Kozak，細胞生物學雜志108，299(1989))。
然而，為了將酶錨定在酶形成細胞的細胞膜上，也可以插入糖磷化物錨的核苷酸序列。
將糖磷化物錨的核苷酸序列插入到該酶核苷酸序列的3′末端；這種插入可以是除信號序列之外的插入。
已經描述了糖磷化物錨，例如，CEA(DNA位點≤893-≥1079；Berling等，癌研究50，6534(1990))、N-CAM(Cunningham等，科學236，799(1987))和其它跨膜蛋白(如Thy-1)(Clissold，生物化學雜志281，129(1992))或者CD16(Selvaray等，自然333，565(1988))。
Ferguson等(生物化學年度綜述57，285(1988))已經出版了錨定糖磷化物膜蛋白的綜述。
按照本發明，另一個細胞膜錨定酶的選擇是利用配位體-酶融合蛋白的DNA序列。這種融合蛋白的配位體的特異性直接針對存在于增殖的內皮細胞或者腫瘤細胞之細胞膜上的膜結構。
和增殖的內皮細胞表面結合的配位體包括，例如，直接針對于內皮細胞膜結構的抗體和抗體片段，這一點已經描述過，例如，Burrows等(藥物治療64，155(1994))、Hughes等(癌研究49，6214(1989))和Maruyama等(PNAS US 87，5744(1990))。特別是，它們包括VEGF受體的抗體。
優選的是利用人源化形式的鼠單克隆抗體。以Winter等(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等(V.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))描述的方法實現人源化。按照本領域的方法制備抗體片段，例如，以Winter等(自然349，293(1991))、Hoogenbooms 等(V.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))、Girol.Mol.Immunol.28，1379(1991)或者Huston等(國際免疫學綜述10，195(1993))描述的方法制備。
并且，配位體包括所有和內皮細胞的膜結構或者膜受體結合的活性化合物。這些活性化合物包括，例如，含有末端甘露糖的物質、還有IL-1或生長因子或它們的片段、或部分序列(它們都和內皮細胞表達的受體(如PDGF，bFGF，VEGF，TGGO(Pusztain等，病理學雜志169，191(1993)))結合)、或者細胞分裂素和細胞分裂素的衍生物或類似物。它們還包括和激活的和/或增殖的內皮細胞結合的附著分子。已經描述了具有這種特性的附著分子，例如，Slex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、CLA-4或者玻連蛋白和其衍生物或類似物(Augustin-Voss等的綜述，細胞生物學雜志119，483(1992)；Pauli等，癌轉移綜述9，175(1990)；Honn等，癌轉移綜述11，353(1992)；Varner等，細胞附著和共有3，367(1995))。)然而，配位體也包括抗體或者他們的片段，這些物質直接針對于腫瘤細胞膜上的腫瘤特異性或腫瘤結合性抗原。
Sedlacek等(輔助腫瘤學(Contrin.Oncol.)32(1988)和輔助腫瘤學43(1992))給出了具有這種性質的抗原和相關抗體。已經描述了抗體-酶融合蛋白，例如，Bosslet等，英國癌研究65，234(1992)。為了有利于所引用的配位體/酶融合蛋白質的分泌，在每種情況下都包含在酶DNA序列中的同源信號序列(如已經描述過的)可以由促進胞外分泌的異源信號序列代替。
1.3.幾種抗腫瘤或者抗炎癥物質的組合本發明也涉及包含幾種相同的抗腫瘤或抗炎癥物質(A，A)或者不同的抗腫瘤物質(A，B)之組合的核酸構建體。為了表達這兩種DNA序列，優選將內部核糖體進入位點(IRES)的cDNA作為調節組件插入其中。(參見圖7)。
例如，Mountford和Smith(TIG 11，179(1995))、Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))、Morgan等(核酸20，1293(1992))、Dirks等(基因128，247(1993))、Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技術12，694(1994))已經描述了具有這種特性的IRES。
這樣，脊髓灰質炎病毒IRES序列的cDNA(位點≤5′UTR的140-≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可以用于和抗炎物質A的DNA(3′末端)和抗炎物質B的DNA(5′末端)連接。
取決于組合，具有這種特性的活性化合物在本發明的范圍內具有加和(A+A，A+B)或協同效應。
2.消除血液細胞缺失形成的活性化合物2.1.選擇造血細胞的啟動子或者激活物序列在本發明中，基因調節序列，或者在造血細胞中編碼特別強烈或選擇表達之蛋白質的基因元件，最好用作由啟動子或增強子組成的啟動子或者激活物序列。基因調節序列包括細胞因子或者其受體基因的啟動子序列，這種基因調節序列在未成熟造血細胞中的表達發生在隨后的細胞因子之前，需要這種細胞因子作為活性物質是所需的，并對造血細胞發揮作用。對未成熟的造血細胞發揮作用的這種特性之細胞因子的例子是-干細胞因子-IL-1-IL-3-IL-6-GM-CSF2.2.造血細胞活性物質結構基因的選擇在本發明中，活性物質應理解為這樣一種DNA序列，其表達的蛋白質引起血液細胞的增殖和/或分化。
3.治療自身免疫疾病、變應性變態反應和炎癥以及預防器官排斥的活性化合物
3.1.特別的用于自身免疫疾病之啟動子或者激活物序列的選擇在免疫反應期間，在巨噬細胞和/或者淋巴細胞中形成增加的蛋白質的基因調節序列將用作包含啟動子或者增強子的啟動子或者激活物序列。具有這種特性的蛋白質的例子是-IL-1-IL-1β-IL-1受體-IL-2-IL-2受體-IL-3-IL-3受體-IFNγ-IL-4-IL-4受體-IL-5-IL-6-LIF-IL-7-IL-10-IL-11-IL-12-IL-13-GM-CSF-GM-CSF受體-整聯蛋白β-2蛋白質3.2.特別的用于自身免疫疾病之活性化合物的基因選擇在本發明中，活性物質是編碼抗體、抗體片段，細胞因子、趨化因子、生長因子或者其一種抑制劑、血漿蛋白質、核酶(催化這些DNA序列之一的轉錄產物或者催化編碼細胞周期控制蛋白質之基因的轉錄產物)的DNA序列或者是抗體或酶的DNA序列。活性物質的選擇取決于所治療的基本疾病和所選擇的啟動子序列。
4.治療風濕性關節炎的活性化合物4.1.風濕性關節炎激活物序列之啟動子的選擇在本發明中，由啟動子或者增強子或者基因調節序列組成的激活物序列應理解為，優選的是和與轉錄因子(轉錄因子在滑液細胞和炎癥性細胞中形成或具有活性)相互作用的那些基因聯合。在本發明中，優選的啟動子序列包括編碼(特別是在滑液細胞和炎癥性細胞中)所表達的蛋白質之基因的基因調節序列或元件。
4.2.風濕性關節炎之活性物質結構基因的選擇在本發明中，活性物質應理解為這樣一種DNA序列，其表達的蛋白質直接或間接抑制關節炎癥，例如，和/或促進關節胞外基質(軟骨、結締組織)的重建。
5.針對感染物的活性化合物的制備可以通過兩種根本不同的形式制備活性化合物-用于治療病毒感染和寄生物侵入，或者-用于預防病毒、細菌或寄生蟲引起的傳染病為了預防傳染病，利用了疫苗。然而，通過常規的方法制備有效疫苗的可能性受到限制(Brown，Tnt.J.Technol.Assessm.10，161(1994))；Ellis，實驗醫學生物學進展327，263(1992)；Arnon等，FASEB J.6，3265(1992))。
因此，發展了DNA疫苗技術。然而，這些DNA疫苗引起有關功效程度、安全性和副作用的問題(Fynan等，國際免疫藥物學雜志17，79(1995)；Donnelly等，免疫學2，20(1994))。
在本發明中，用于預防傳染病的活性化合物，由于它們的細胞特異性和受細胞周期調節，因此以高度的安全性引人注目。
5.1.啟動子或者激活物序列的選擇5.1.a)用于傳染病的治療選擇細胞基因(特別是其活性通過細菌或者寄生物感染而變化的那些基因)的啟動子序列作為激活物序列，或者選擇來源于這些病毒的啟動子序列，這些病毒轉化它們感染的細胞并刺激這些細胞增殖。
這些病毒的例子是HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV和HTLV。
5.2.活性物質結構基因的選擇5.2.a)用于治療傳染病顯示出細胞抑制、細胞毒性、抗細菌或者抗病毒作用之蛋白質的DNA選為活性物質。上文已經闡述了細胞毒素和細胞抑制蛋白質的例子。抗體或抗體片段可以作為抗細菌或抗病毒之蛋白質的例子提到。當選擇酶時，隨后必須施用抗病毒的細胞毒素和抗寄生蟲物質的前體(此前體可以由酶切割)。
并且，在本發明中，用于抗病毒蛋白質的活性物質是細胞因子和生長因子，這兩種物質具有抗病毒活性。例如，它們包括下列活性物質的DNA序列-IFNα-IFNβ-IFNγ-TNFβ-TNFα-IL-1-TGFβ然而，在所列出的細胞因子、生長因子或受體的胞外部分之間形成的融合蛋白之DNA序列，以及配位體，都可以用作本發明的活性物質；例如，EPA 0464 633 A1中已經描述了含有人類免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白。
消化細胞周期控制蛋白質之基因的mRNA或者病毒的mRNA之核酶的基因，也可以作為活性物質。例如，Christoffersen等(醫用化學雜志38，2033(1995))已經綜述了催化HIV的核酶。
并且，在本發明中的化學物質是具有特異性的抗體的DNA序列，這種特異性能滅活相關的病毒、或其含有VH-和VL-片段、或者通過接頭連接在一起的VH和VL片段，例如，這些片段按照Marasco等描述的方法制備(美國科學院學報90，7889(1993))。具有這種特異性抗病毒特性之抗體的例子在5.2.b)部分給出。
5.2.b)用于預防傳染病待選擇的活性物質是對感染物特異性的抗體或抗體片段的DNA，或者是通過感染物形成的且通過觸發或免疫反應(即由于抗體結合和/或由于細胞毒素T淋巴細胞)導致該感染物的中和和/或破壞之蛋白質的DNA。所說的具有這種特性的中和抗原已作為疫苗抗原(參見Ellis的實驗醫學生物學進展327，263(1992))。編碼中和抗原之DNA序列的例子可從下列出版物中找到-流感A病毒抗原(Ulmer等，科學259，1745(1993)；Robinson等，疫苗11，957(1993)；Fynan等，國際免疫藥學雜志17，79(1995))-HIV抗原(Wang等，PNAS US 90，4156(1993))-狂犬病病毒抗原(Donnelly等，免疫學2/1，20(1994))-HSV(單純皰疹病毒)抗原(Fleckenstein等，自然274，57(1978))-RSV(呼吸合胞體病毒)抗原(Du等，生物技術12，813(1994)；Hall，科學265，1393(1993))-副流感病毒抗原(Du等，生物技術12，813(1994))-輪狀病毒屬抗原(Albert等，臨床微生物學雜志25，183(1987)；Anderson等，傳染病雜志153，823(1986)；Battaglia等，傳染病雜志155，140(1987)；Chanock等，傳染病雜志148，49(1983)；Dyall-Smith等，病毒學雜志38，1099(1981)；Glass等，科學265，1389(1994))-VZV(水痘-帶狀皰疹病毒)抗原(Straus等，內科醫學年鑒109，438(1988)；Gershon，兒科傳染病2，171(1991)；Kinchington等，病毒學雜志64，4540(1990))-CMV(細胞肥大病毒)抗原(Plotkin，科學265，1383(1994))-麻疹病毒抗原
(Katz和Kellin，科學265，1391(1994))-HPV(人類乳頭狀瘤病毒)抗原(Tindl和Frazer，當今微生物免疫學主題186，217(1994))-HBV(肝炎B病毒)抗原(Valenzuela等，自然280，815(1979)；Heerman等，病毒學雜志52，396(1984))-HCV(肝炎C病毒)抗原(Cerny等，當今微生物免疫學主題189，169(1994)；Esteban等，肝疾病進展10，253(1992)；Jung等，歐洲臨床研究雜志24，641(1994種))-HDV(肝炎D病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.24，129(1992)；Consolo等，腎瘤(Nephron)61，251(1992))-HEV(肝炎E病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.24，129(1992)；Consolo等，腎瘤(Nephron)61，251(1992))-HAV(肝炎病毒)抗原(d′Hondt，疫苗10，48(1992)；Andre，傳染病雜志171，33(1995)；Lemon等，疫苗10，40(1992)；Melnick等，疫苗10，24(1992)；Flehmig，Baillieres臨床胃腸病學4，707(1990))-霍亂弧菌抗原(Levine和Kaper，疫苗11，207(1993))-布氏疏螺旋體抗原(Schaible等，免疫學通訊36，219(1993)；Wallich等，實驗醫學17，669(1993))-幽門螺桿菌抗原(Crabtree等，Lancet 338，332(1991)；Blascr，傳染病雜志161，626(1990)；Cover和Blaser，生物化學雜志267，10570(1993)；Cover等，傳染免疫學58，603(1990)；Dunn等，生物化學雜志265，9464(1990)；Dunn等，傳染免疫學60，1946(1992)；Lagc等，比利時胃腸病學學報56(增刊)，61(1993)；Mobley等，Scand.J.Gastroint 26(增刊.187)，39(1991)-瘧疾抗原(Nussenzweig和Long，科學265，1381(1994)；Maurice，科學267，320(1995)；Enders等，疫苗10，920(1992)；Knapp等，傳染病免疫學60，2397(1992))然而，在本發明中，具有這種特性的活性物質也包括抗獨特型抗體或者其抗原結合片段，它的抗原結合結構(即互補決定區)構成了感染物中和抗原的蛋白質結構或者碳水化合物結構的拷貝。
具體地說，具有這種特性的抗獨特型抗體在細菌感染物存在的情況下，能夠代替碳水化合物抗原。
Hawkins等(免疫療法雜志14，273(1993))和Westerink和Apicella(免疫病理學Springer討論會。15，227(1993))已經綜述了抗獨特型抗體和它們的切割產物。
5.3用于治療和預防傳染病之相同或不同活性物質的組合本發明還涉及包含相同活性物質(A，A)或不同活性物質(A，B)之DNA序列組合的活性物質。為了表達兩種序列，優選內核糖體進入位點的cDNA作為調節元件插入。
例如，Montford和Smith(TIG11，179(1995))、Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))、Morgan等(核酸研究20，1293(1992))、Cirk等(基因128，247(199 3))、Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技術12，694(1994))已經描述了具有這種特性的IRES。
這樣，脊髓灰質炎病毒IRES序列的cDNA(位點≤5′UTR的140-≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可以用于連接病毒物質A的DNA(3′末端)和病毒物質B的DNA(5′末端)(參見圖8)。
依據組合，在本發明的范圍內的具有這種特性的活性化合物，具有加和(A+A，A+B1)或協同效應。
這樣，對于例如治療病毒疾病，兩種相同或兩種不同的抗活性物質可以彼此組合。
這樣，在預防傳染病的過程中，編碼一種感染物之不同抗原或不同感染物之不同抗原的幾種活性物質可以彼此組合。并且，編碼感染物抗原的活性物質可以和編碼細胞因子或者細胞因子受體之活性物質組合。
同時，這樣形成(即在注射活性化合物之后形成的)的細胞因子或者細胞因子受體作為感染物受體可以影響正在進行的免疫反應的特性和強度。
5.2.d)已經描述了擴增體液免疫反應之細胞因子和細胞因子受體的DNA序列，5.2.a)和5.2.c)描述了擴增細胞免疫反應的序列。
下列是整體上擴增免疫反應之細胞因子的DNA序列的例子-I1-1α(Fenton，國際免疫藥學雜志14，401(1992)；Furntani等，核酸研究14，3167(1986)；Lafage等，血液73，104(1989)；Aarch等，自然315，641(1985))-I1-1β(Bensi等，基因52，9(1987)；Auron等，PNAS 81，7907(1984)；Clark等，核酸研究14，7897(1986))-I1-2(Fletscher等，淋巴循環研究6，45(1987)；Matsui等，淋巴因子12，1(1985)；Tanaguchi等，自然302，305(1983))-GM-CSF(Gough等，自然309，763(1979)；Nicola等，生物化學雜志254，5290(1979)；Wong等，科學228，810(1985))6.治療腫瘤的活性化合物6.1.腫瘤細胞啟動子或激活物序列的選擇和在腫瘤細胞中形成或激活的轉錄因子相互作用的基因調節序列被稱為啟動子或激活物序列。
新核酸構建體能夠達到的腫瘤是優選的。例如，這些腫瘤是白血病細胞(除在不同類型固體腫瘤鄰區中的增殖的內皮細胞外)(靜脈施用核酸構建體之后)、卵巢癌和胰癌(例如在腹膜內注射核酸構建體之后)、肺癌(例如在支氣管內施用構建體)。
在本發明中，優選的啟動子或者激活物序列包括編碼特別是在白血病細胞、癌細胞或者肉瘤細胞中形成的蛋白質之基因的基因調節序列或元件。這樣，N-CAM蛋白質的啟動子在小細胞支氣管癌的情況下優選使用；而肝炎生長因子受體或L-網質的啟動子在卵巢癌的情況下優選使用；L-網質或多形上皮粘蛋白(PEM)之啟動子在胰癌的情況下優選使用；前列腺特異性抗原(PSA)的啟動子在前列腺腫瘤的情況下優選使用。
6.2.腫瘤細胞活性物質之結構基因的選擇在本發明中，活性物質被理解為這樣一種DNA序列，其表達的蛋白質抑制細胞(特別是白血病細胞)的增殖。例如，這些細胞周期抑制劑包括如已經描述過的抑制性細胞抑制和細胞毒素蛋白質的DNA序列、抗體或抗體切割產物的DNA序列、酶的DNA序列。
并且，細胞周期抑制劑應理解為表達對腫瘤細胞或者白血病細胞直接或間接顯示出細胞抑制或者細胞毒素效應之蛋白質的DNA序列。
細胞周期抑制劑也應理解為一種核酶的DNA序列，這種核酶催化細胞周期控制蛋白之基因的mRNA。腫瘤細胞的活性物質也應理解為一種DNA序列，這種DNA序列表達的蛋白質或肽組成了觸發免疫反應的腫瘤抗原。
7.抑制與血管閉塞相關的平滑肌細胞增殖之活性化合物7.1.平滑肌細胞啟動子或者激活物序列的選擇在本發明中將使用的由啟動子或者增強子組成的啟動子或者激活物序列優選的是編碼特別在平滑肌細胞中形成的蛋白質之基因的基因調節序列或元件。
7.2.平滑肌細胞活性物質結構基因的選擇在本發明中，活性物質應理解為這樣一種DNA序列，其表達的蛋白質抑制平滑肌細胞的增殖。這些增殖抑制劑包括1.2.a)和1.2.c)已經提及的蛋白質。
然而，活性物質也應理解為把細胞抑制劑的非活性前體轉化為細胞抑制劑酶的DNA序列(參見1.2.f)8.對凝結有作用的活性化合物8.1.對凝結有作用的啟動子或者激活物序列的選擇在本發明中，使用的啟動子或者激活物序列優選的是編碼可以在平滑肌細胞、激活的內皮細胞、激活的巨噬細胞或者激活的淋巴細胞中檢測到的蛋白質的基因的基因調節序列或元件。
8.1.a)平滑肌細胞已經給出了平滑肌細胞中基因啟動子序列的例子。
8.1.b)激活的內皮細胞具體地說，Burrows等(藥物治療64，155(1994))已經描述了在激活的內皮細胞中形成的蛋白質的例子。具體地說，這些蛋白質的例子是在內皮細胞中表現出增加的程度的蛋白質(例如，上文已經描述的那些蛋白質和它們基因的啟動子序列)。
8.1.c)激活的巨噬細胞和/或者激活的淋巴細胞在本發明中，激活物序列也應理解為在免疫應答期間在巨噬細胞和/或者淋巴細胞中形成增加的程度的蛋白質的基因的啟動子序列。這種特性的蛋白質已經描述過。
8.2.對凝結有作用之活性物質的結構基因的選擇本發明中所使用的活性物質是編碼直接或間接抑制血小板聚合或者血液凝固因子或者刺激纖維蛋白溶解之蛋白質的DNA序列。
具有這種特性的活性物質定義為凝結抑制劑。血纖蛋白溶酶或者血纖蛋白溶酶原激活物(PAs)(如組織PA(tPA)或者類尿激酶PA(uPA)、或者蛋白C、抗凝血酶III、C-1S抑制劑、α1-抗胰蛋白酶、組織因子途徑抑制劑(TFPI)或者水蛭素)都可以用作凝結抑制劑。
然而，編碼促進血液凝結之蛋白質的DNA序列也作為本發明的活性物質。具有這種特性的蛋白質的例子是血漿蛋白質(如FVIII或者FIX或者組織因子)。
9.防止CNS破壞的活性化合物9.1.由防止CNS破壞之活性化合物的啟動子或者增強子形成的啟動子或者激活物序列9.1.a)在內皮細胞中激活的啟動子或者激活物序列具體地說，這些序列包括內皮細胞特異性蛋白質基因的啟動子序列。
9.1.b)在神經膠質細胞中激活的啟動子或者激活物序列優選的激活物序列也應理解為和神經膠質細胞中以特殊的程度形成或具有活性的轉錄因子相互作用的核苷酸序列(啟動子序列或者增強子序列)。
9.2神經特異性因子結構基因的選擇在本發明中，神經特異性因子應理解為編碼神經生長因子的DNA序列。
利用下列實施例幫助更詳細地解釋本發明，而不是把本發明限制在這些實施例中。實施例1制備雜交啟動子新雜交啟動子由下列不同的核苷酸序列組成，這些序列在下游方向上相繼排列。元件I-VEGF受體I基因啟動子(核苷酸-1195至100；Morishita等，生物化學雜志270，27948(1995)。TATA盒(核苷酸TATAAA在位點-31至-26)突變成TGTAAA)-序列GCCACC(Kodak，細胞生物學雜志108，229(1989))-免疫球蛋白信號肽的cDNA(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1988))-β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))元件II-cdc25C基因的啟動子(核苷酸-487至+121，優選的核苷酸是-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子細胞生物學。14，999(1994)，特別是核苷酸-290至+121)-TATA盒結合蛋白質的基因(核苷酸序列+1至+1001，此序列在下列位點發生突變核苷酸862(T替換A)889和890(AC替換GT)及895(G替換C)(Strubin和Struhl，細胞68，721(1992)；Heard等，EMBO J.12，3519(1993))元件I和元件II的核苷酸序列如附圖9的方案所示連接。
把以這種方式制備的核苷酸構建體克隆到pUC18/19或Bluescript衍生的質粒載體中，然后將這種載體直接或以膠態分散體系統用于體內給藥。
此構建體的單個組件通過合適的限制位點連接，在PCR擴增期間在不同組件的終點引入這些限制位點。利用對這些限制位點特異性的，并且技術人員熟悉的酶及DNA連接酶進行連接。
將在培養物中一直保留的人類臍帶內皮細胞和成纖維細胞(Wi-38)用所描述的質粒之一，利用技術人員熟知的方法轉染(Lucibello等，EMBOJ.14，132(1995))，利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物檢測內皮細胞產生的β-葡萄糖醛酸酶的數量。
為了檢測細胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸48小時，使內皮細胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有關制備的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在熒光激活細胞分選儀中測定細胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
得到了下列結果和未轉染的成纖維細胞相比，在轉染的成纖維細胞中沒有檢測到β-葡萄糖醛酸酶的增加。
轉染的內皮細胞較未轉染的內皮細胞實質上表達了更多的β-葡萄糖醛酸酶。
增殖的內皮細胞(DNA＞2S；S＝單染色體組)較G0/G1同步化的內皮細胞(DNA＝2S)實質上分泌更多的β-葡萄糖醛酸酶。
已經描述的多啟動子引起β-葡萄糖醛酸酶結構基因的細胞特異性、細胞周期依賴性表達。實施例2和核保留信號(NRS)及核輸出因子(NEF)組合的雜交啟動子的制備。
新雜交啟動子由下列不同的核苷酸序列組成，這些核苷酸序列在下游的方向上相繼排列元件III-VEGF受體I基因的啟動子(核苷酸-1195至100；Morishita等，生物化學雜志270，27948(1995)。TATA盒(核苷酸TATAAA在位點-31至-26)突變成TGTAAA)-序列GCCACC
(Kodak，細胞生物學雜志108，229(1989))-免疫球蛋白信號肽的cDNA(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1988))-β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))-作為核保留信號(NRS)的HIV-1病毒RER之cDNA(核苷酸序列7357至7602；Ratner等，自然313，277(1985)；Malim等，自然338，254(1989))。元件IIa-cdc25C基因的啟動子(核苷酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究23，3822(1995))-包含共突變的TATA盒結合蛋白的基因(核苷酸序列1至1001，此序列在下列位點發生突變核苷酸862(T替換A)889和890(AC替換GT)及895(G替換C)(Strubin和Struhl，細胞68，721(1992)；Heard等，EMBO J.12，3519(1993))元件IV-von Willebrand因子(vWF)基因的啟動子(核苷酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子細胞生物學14，999(1994))-作為核輸出因子(NEF)的HIV-1病毒REV的cDNA氨基酸序列1-117；Ratner等，自然313，277(1985)。
元件II、III和IV的核苷酸序列如附圖10的方案所示連接。
把以這種方式制備的核苷酸構建體克隆到pUC 18/19或Bluescript衍生的質粒載體中，然后將這種載體直接或以膠態分散體系統用于體內給藥。
此構建體的單個組件通過合適的限制位點連接，在PCR擴增期間在不同組件的終點引入這些限制位點。利用對這些限制位點特異性的，并且技術人員熟悉的酶及DNA連接酶完成連接。
將在培養物中一直保留的人類臍帶內皮細胞和成纖維細胞(Wi-38)用所描述的質粒，利用技術人員熟知的方法轉染(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))，利用4-methylumbellifcryl-β-葡糖苷酸作為底物檢測內皮細胞產生的β-葡萄糖醛酸酶的數量。
為了檢測細胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸48小時，使內皮細胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有關制備的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在熒光激活細胞分選儀中測定細胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
得到了下列結果和未轉染的成纖維細胞相比，在轉染的成纖維細胞中沒有檢測到β-葡萄糖醛酸酶增加的可能性。
轉染的內皮細胞較未轉染的內皮細胞實質上表達了更多的β-葡萄糖醛酸酶。
增殖的內皮細胞(DNA＞2S)較G0/G1同步化的內皮細胞(DNA＝2S)實質上分泌更多的β-葡萄糖醛酸酶。
已經描述的多啟動子引起β-葡萄糖醛酸酶結構基因的細胞特異性、細胞周期依賴性表達。實施例3和激活物響應啟動子單位組合的雜交啟動子的制備。
新激活物響應啟動子單位由下列不同的核苷酸序列組成，這些核苷酸序列在下游的方向上相繼排列元件V激活物亞單位-cdc25C基因的啟動子(核苷酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，核酸酸研究23，3822(1995))-Ga14蛋白質DNA結合域的cDNA(氨基酸1至147；Chasman和Kornberg，分子細胞生物學10，2916(1990))-Ga180的cDNA(氨基酸1至435；Leuther等，科學256，1333(1992))激活物亞單位B-VEGF受體I基因啟動子(核苷酸-1195至+100；Morishita等，生物化學雜志270，27948(1995)；在核苷酸-31至-26發生TGTAAA突變)-Ga14的Ga180結合域的cDNA(氨基酸851至881；Leuther等，科學256，1333(1992))-SV40的核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126至132PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))-HSV-1VP16的酸反式激活域(TAD)(406至488氨基酸；Triezenberg等，基因發展2，718(1988)；Triezenberg，基因發展的現代觀點5，190(1995))激活物響應啟動子具有和SV40基礎啟動子(核苷酸48至5191；Toozeb編輯，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約；冷泉港實驗室)偶聯之核苷酸序列5-CGGACAACTGTTGAC CG-3′(SEQ ID NO2，Chasman和Kornberg，分子細胞生物學)的Ga14結合序列。
激活物響應啟動子單位核苷酸序列的排列順序如圖11的方案所示。
描述的激活物序列功能如下-cdc25C啟動子以細胞周期特異性方式調節Ga14結合蛋白和Ga180的組合cDNA的轉錄。
-VEGF受體I啟動子限制Ga14的Ga180結合域、SV40 NSL和內皮細胞TPA之偶聯的cDNA的轉錄。然而，這種激活作用由突變抑制。
-激活物亞單位A和B的表達產物通過Ga14的Ga180結合域和Ga180結合二聚化。
圖2通過圖解的方式表示了二聚化。
二聚化的蛋白質是Ga14結合域/SV40啟動子的激活物響應啟動子DNA序列的嵌合轉錄因子。
按照本發明圖13的方案，所述啟動子在其3′末端和序列GCCACC連接(Kocak，細胞生物學雜志108，229(1989))，后者和免疫球蛋白信號肽的cDNA連接(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1989))。之后是β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))。
接下來，此單位在其3′末端和元件VI連接，然而，這種元件IV也可以加入到核苷酸構建體的5′末端。元件VI元件VI包括-von Willebrand因子基因的啟動子(核苷酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子細胞生物學14，999(1994))-TATA盒結合蛋白基因(核苷酸序列1至1001，此序列在下列位點發生突變核苷酸862(T替換A)889和890(AC替換GT)及895(G替換C)。
TATA盒結合蛋白的共突變消除了VEGF受體啟動子激活(激活物亞單位B)的抑制作用。
把以這種方式制備的核苷酸構建體克隆到pUC 18/19或Bluescript衍生的質粒載體中，然后將這種載體直接或以膠態分散體系統用于體內給藥。
此構建體的單個組件通過合適的限制位點連接，在PCR擴增期間在不同組件的終點引入這些限制位點。利用對這些限制位點特異性的，并且技術人員熟悉的酶及DNA連接酶完成連接。
將在培養物中一直保留的人類臍帶內皮細胞和成纖維細胞(Wi-38)用所描述的質粒，利用技術人員熟知的方法轉染(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))，利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物檢測內皮細胞產生的β-葡萄糖醛酸酶的數量。
為了檢測細胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸48小時，使內皮細胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有關制備的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在熒光激活細胞分選儀中測定細胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
得到了下列結果
和未轉染的成纖維細胞相比，在轉染的成纖維細胞中沒有檢測到β-葡萄糖醛酸酶增加的可能性。
轉染的內皮細胞較未轉染的內皮細胞實質上表達了更多的β-葡萄糖醛酸酶。
增殖的內皮細胞(DNA＞2S)較G0/G1同步化的內皮細胞(DNA＝2S)實質上分泌更多的3-葡萄糖醛酸酶。
已經描述的多啟動子引起β-葡萄糖醛酸酶結構基因的細胞特異性、細胞周期依賴性表達。
如實施例I-III描述的按照本發明的活性化合物，在局部給藥(例如在腫瘤位點)、或者在顱內或蛛網膜下給藥、或者全身(優選的是靜脈或動脈)給藥后，作為激活物響應啟動子亞單位的細胞周期特異性或者內皮細胞特異性的結果，具有確保主要(如果不是唯一的)增殖分泌β-葡萄糖醛酸酶的內皮細胞的作用。此β-葡萄糖醛酸酶切割強耐受阿霉素-β-葡萄糖醛酸化物(Jacquesy等，EPO 0 511 917 A1)，現在這種物質被注射到具有細胞抑制作用的阿霉素中。阿霉素抑制內皮細胞增殖，并且對內皮細胞和鄰近的腫瘤細胞具有細胞抑制作用。這導致腫瘤細胞的生長受到抑制。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Hoechst Aktiengesellschaft(B)街道-(C)城市Franlfurt(D)州-(E)國家德國(F)郵政編碼(ZIP)65926(G)電話069-305-3005(H)傳真069-35-7175(I)電報-(ii)發明名稱用于基因治療的含雜交啟動子的核酸構建體(iii)序列數2(iv)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn #1.0，#1.25版本(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(ix)特性(A)名稱/關鍵詞肽(B)位點1..7(xi)序列描述SEQ ID NO1Pro Lys Lys Lys Arg LysVal1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關鍵詞外顯子(B)位點1..17(xi)序列描述SEQ ID NO2CGGACAACTG TTGACCG1權利要求
1.一種用于在宿主細胞中調節轉基因表達的核酸構建體，這種核酸構建體包含至少一種含有第一突變的核酸序列，這種突變抑制所說的轉基因正常表達，和至少一種含有第二種突變的核酸序列，這種突變消除由第一突變產生的抑制作用。
2.權利要求1的用于在宿主細胞中調節轉基因表達的核酸構建體，其中(i)當所說的含有所說的第一突變的核酸序列是包含抑制所說的轉基因的轉錄和/或翻譯，或者抑制藥理活性化合物的功能的突變的轉基因(b)時，所說的核酸構建體還包含第一啟動子或增強子序列(a)，此序列定位在所說轉基因5′末端的上游，或者(i′)當所說的含有所說的第一突變的核酸序列是包含抑制第一啟動子的功能的突變的啟動子或增強子序列(a′)時，所說的核酸構建體還包含編碼藥理活性化合物的轉基因(b′)。
3.按照權利要求1或2的用于在宿主細胞中調節轉基因表達的核酸構建體，這種核酸構建體在5′至3′末端方向的閱讀框架中包含下列組件(i)激活所說的轉基因轉錄的第一啟動子或增強子序列(a)，或包含抑制第一啟動子功能的突變的第一啟動子或增強子序列(a)；(ii)編碼藥理活性化合物的轉基因(b′)或者包含一種突變的轉基因(b)，這種突變抑制所說的轉基因的轉錄和/或翻譯，或者抑制由所說的轉基因編碼的藥理活性化合物的功能；(iii)第二啟動子或增強子序列(c)，這種序列激活組件(d)的基礎轉錄或包含抑制第二啟動子功能的突變；和(iv)編碼消除啟動子(a)和(c)至少之一或轉基因(b)中突變之tRNA或調節蛋白的基因。
4.權利要求3的核酸構建體，其中所說的啟動子(a)和(c)是非特異性的、細胞特異性或病毒特異性的，并且其中啟動子(a)和(c)可以被包括下列幾種激活機制在內的至少一種機制激活非特異性地、病毒特異性地、代謝性地、由四環素、由氧不足、細胞特異性地和細胞周期特異性地。
5.如權利要求1-4之任一所要求的核酸構建體，其中所說的轉基因(b)包含核保留信號(NRS)，這種核保留信號在其5′末端直接或間接和轉基因的3′末端連接，并且，其中所說的NRS的轉錄產物提供結合核輸出因子(NEF)的結構。
6.權利要求5的核酸構建體，這種核酸構建體還包含下列組件(v)激活NEF基礎轉錄的第三啟動子或增強子序列(i)；和(vi)編碼和NRS轉錄產物結合進而介導轉基因轉錄產物從細胞核向細胞質轉運的NEF(k)的核酸序列。
7.權利要求3或4的核酸構建體，其中所說的啟動子或增強子序列(a)和(c)是相同的。
8.如權利要求3-7之任一所要求的核酸構建體，其中啟動子或增強子序列(a)和(c)至少之一是含有啟動子組件CDE-CHR或E2FBS-CHR的嵌合啟動子，其中所說的啟動子組件對下游基因的表達起作用，并且和鄰區、上游、激活物序列相互作用。
9.如權利要求1-8之任一所要求的核酸構建體，其中所說的下游基因的表達是受細胞周期特異性抑制的。
10.權利要求6的核酸構建體，其中啟動子或增強子序列(a)、(c)和(i)至少之一是包含下列組件的激活物響應啟動子單位(vii)至少一種啟動子或增強子序列(e)，這種啟動子或增強子序列由包括下列幾種激活方法在內的至少一種方法激活非特異性地、病毒特異性地、代謝性地、由四環素、細胞特異性地和細胞周期特異性地；(viii)至少一種位于啟動子或增強子序列(e)下游的激活物亞單位(f)，并且其中所說的激活物亞單位的基礎轉錄由啟動子或增強子序列(e)激活；和(ix)一種激活物響應啟動子(g)，這種啟動子由該激活物亞單位(f)或幾種相同亞單位(f)或不同激活物亞單位(f′)的表達產物激活。
11.權利要求10的核酸構建體，其中啟動子或增強子序列(a)、(c)或(i)和激活物響應啟動子(g)至少之一是嵌合啟動子，并且激活物亞單位(f)是編碼至少一種激活嵌合啟動子的轉錄因子之基因。
12.權利要求10或11的核酸構建體，其中所說的激活物響應啟動子(g)是和SV40啟動子結合的單體或多體LexA操縱基因，并且由兩種激活物亞單位(f)和(f′)激活；其中激活物亞單位(f)包含編碼LexA DNA結合蛋白的cDNA，其3′末端和編碼Ga180蛋白之cDNA的5′末端連接；和激活物亞單位(f′)在5′至3′末端的閱讀框架上包含編碼Ga14蛋白的Ga180結合域的cDNA、編碼SV40大T抗原的cDNA和編碼HSV-1 VP16反式激活域的cDNA。
13.權利要求12的核酸構建體，其中所說的編碼LexA DNA結合蛋白的cDNA編碼LexA DNA結合蛋白的1-81或1-202位氨基酸；編碼Ga180蛋白的cDNA編碼Ga180蛋白的1-435氨基酸；編碼Ga14蛋白之Ga180結合域的cDNA編碼Ga14蛋白的851-881位氨基酸；編碼SV40大T抗原的cDNA編碼SV40大T抗原的126-132位氨基酸；編碼反式激活域的cDNA編碼HSV-1VP16的406-488位氨基酸。
14.權利要求12或13的核酸構建體，其中所說的LexA操縱基因的單體或多體由Ga14結合域的單體或多體替代；并且編碼LexA DNA結合蛋白的cDNA由編碼Ga14蛋白的DNA結合域的cDNA替代。
15.權利要求10-13之任一所要求的核酸構建體，其中所說的激活物響應啟動子(g)是編碼Ga14結合蛋白之結合序列的單體或多體；激活物亞單位(f)包含來源于SV40大T抗原的核定位信號(NLS)和來源于HSV-1 VP16的酸反式激活域(TAD)；或者激活物亞單位(f′)含有來源于SV40大T的核定位信號(NLS)、編碼Ga14蛋白質DNA結合域的cDNA和編碼p56 Ick蛋白質CD4結合序列的cDNA。
16.權利要求15的核酸構建體，其中NLS編碼SEQ ID NO.1，TAD編碼HSV-1 VP16的406-488位氨基酸，Ga14蛋白質DNA結合域的cDNA編碼Ga14蛋白質的1-147位氨基酸，CD4結合序列的cDNA編碼p56 Ick蛋白質的1-71位氨基酸。
17.權利要求6的核酸構建體，其中所說的編碼NRS的核酸序列選自由來源于HIV-1或HIV-2的Rev響應元件(RRE)、不同于HIV-1和HIV-2的反轉錄病毒之RRE相等保留信號及HBV的RRE相等保留信號組成的組。
18.權利要求6的核酸構建體，其中所說的NEF(k)選自由反轉錄病毒的rev基因、編碼hnRNP-A1蛋白質的基因或編碼轉錄因子TFIII-A的基因組成的組。
19.權利要求6核酸構建體，其中所說的反轉錄病毒選自由HIV-1、HIV-2、Visna-maedi病毒、羊關節炎腦炎病毒、馬傳染性盆血病毒和貓免疫缺陷病毒和HTLV組成的組。
20.權利要求10的核酸構建體，其中啟動子(a)、(c)、(g)和(i)至少之一的至少一種TATA序列是突變的；并且組件(d)是編碼TATA結合蛋白質(TBP)的基因，這種基因是突變的且和突變的TATA盒結合，使得能夠轉錄。
21.權利要求20的核酸構建體，其中所說的TATA盒突變成TGTAAA，編碼TBP的基因在N862突變成T，在N889突變成A，在N890突變成C，在N895突變成G。
22.權利要求2-21之任一所要求的包含雜交啟動子的核酸構建體，所說的雜交啟動子在5′至3′末端方向的閱讀框架中包含下列元件元件I，其包含-VIGF受體I基因的啟動子包含核苷酸-1195至+100，其中所說的TATAA的TATA盒在-31至-26位上的核苷酸突變成TGTAAA；-序列GCCACC-編碼免疫球蛋白信號肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和-編碼β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位的核苷酸序列；和元件II，其包含cdc25C基因啟動子的-487至+121位核苷酸；TATA盒結合蛋白質的+1至+1001位核苷酸序列，這種核苷酸序列在下列位點上發生突變核苷酸862(T替代A)、889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。
23.如權利要求2至21之任一所要求的核酸構建體，其包含在5′至3′方向的閱讀框架中含有下列元件的雜交啟動子元件III-包含核苷酸-1195至100的VIGF受體I基因之啟動子，并且其中所說的TATAAA的TATA盒之核苷酸在-31至-26位上突變成TGTAAA；-序列GCCACC-編碼免疫球蛋白信號肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和-編碼β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位核苷酸序列；和-編碼作為核保留信號(NRS)的HIV-1病毒RER之cDNA的7357至7602位核苷酸序列；和元件IIa-cdc25C基因啟動子的-290至+121位核苷酸；-TATA盒結合蛋白質的+1至+1001位核苷酸序列，這種核苷酸序列在下列位點上發生突變核苷酸862(T替代A)、889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。元件IV-von Willebrand因子(vWF)基因啟動子的-487至+247位核苷酸；和-編碼作為核輸出因子(NEF)的1-117位氨基酸序列的HIV-1病毒REV之cDNA。
24.如權利要求2至21之任一所要求的核酸構建體，其包含雜交啟動子和激活物響應啟動子單位(包含在5′至3′末端方向閱讀框架中)的這種核酸構建體包含下列元件元件V，其包含1)激活物亞單位A，其包含-cdc25C基因啟動子的-290至+121位核苷酸；-Ga14蛋白質1-147位氨基酸的DNA結合域之cDNA；和-編碼Ga1801-435位氨基酸的cDNA；2)激活物亞單位B，其包含-VIGF受體I基因的啟動子，其包含-1195至+100位核苷酸，并且在其-31至-26核苷酸位上是TGTAAA；-Ga14 851-881位氨基酸的Ga180結合域的cDNA；-編碼SEQ ID NO.1的核定位信號(NLS)；和-編碼HSV-1 VP16 406-488位氨基酸的酸反式激活域；和3)激活物響應啟動子，其包含-具有SEQ ID NO.2核苷酸序列的Ga14之結合序列，這種結合序列可操作地和SV40基礎啟動子的48-5191位核苷酸連接；-序列GCCACC；-編碼免疫球蛋白信號肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和-β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位核苷酸序列；和元件VI包含von Willebrand因子(vWF)基因啟動子的-487至+247位核苷酸；和TATA盒結合蛋白質的+1至+1001位核苷酸序列，這種核苷酸序列在下列位點上發生突變核苷酸862(T替代A)，889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。
25.權利要求20的核酸構建體，其中包括轉基因(b)、核輸出因子(k)、TBP(d)和激活物響應啟動子(g)的結合蛋白(f)和/或(f′)在內的組件中至少之一的至少一種基因發生突變，結果使表達的蛋白質沒有功能，并且其中所說的組件d)是具有反密碼子的tRNA的基因，這種反密碼子和該突變互補或者攜帶給出正確的氨基酸以消除所說的組件中的突變的末端基團。
26.權利要求25的核酸構建體，其中至少一種下列密碼子UAU，UUF，UAC，CAG，AAA，AAG或UGG突變成UAG，UAA，UAG，UGA或UGG，并且抑制基因tRNA(組件d))是sup F(su+3)；sup C(su+4)；sup D(su+1)；supE(su+2)；sup G(su+5)或sup U(su+7)基因。
27.權利要求1的核酸構建體，其中所說的核酸是DNA。
28.權利要求27的核酸構建體，其中所說的核酸構建體是載體，如質粒載體或病毒載體。
29.如權利要求1-28之任一所要求的核酸構建體，其中所說的轉基因是編碼藥理活性化合物的結構基因，這些藥理活性化合物選自由下列物質組成的組細胞因子；干擾素；生長因子；抗體；來源于細胞因子或生長因子受體的抗體片段；具有抗增殖、apoptotic、細胞抑制或溶細胞作用的蛋白質；血管生成抑制劑和/或血栓形成誘導蛋白；凝結抑制劑；具有纖維蛋白溶解作用的蛋白質；血漿蛋白；補體激活蛋白(如眼鏡蛇毒因子)；人類C3b；修飾的C3b；細菌蛋白；病毒外被蛋白；細菌抗原和寄生蟲抗原；腫瘤抗原；對血液循環具有作用的蛋白質；肽激素；酶；由配位體和活性化合物組成的融合蛋白；反義RNA和核酶。
30.如權利要求1-29之任一所要求的核酸構建體，其中所說的轉基因是編碼酶和/或編碼配位體/酶融合蛋白的結構基因，所述酶切割藥物前體形成藥物。
31.權利要求30的核酸構建體，其中所說的配位體和增殖的內皮細胞結合，并且選自由下列物質組成的組抗體和它們的片段；含有末端甘露糖的蛋白質；細胞因子；生長因子和附著分子。
32.權利要求29的核酸構建體，其中所說的細胞因子是IL-1或TNF；生長因子是PDGF、G-FGF、VEGF或TGFβ；附著因子是SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-1。
33.一種分離的細胞，這種細胞含有如權利要求1-32之任一所要求的核酸構建體。
34.權利要求33的分離細胞，其中所說的細胞是巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞和腫瘤細胞。
35.一種通過制備含有細胞增殖抑制量核酸構建體的藥物抑制細胞增殖的方法，這種藥物用于治療患有下列疾病的患者和過量細胞增殖有關的疾病、腫瘤、心血管疾病、自身免疫疾病、變應性變態反應、炎癥、器官排斥、關節炎、傳染病或神經元疾病。
36.一種藥物組合物，其含有在藥學上可接受的載體中的細胞增殖抑制量的如權利要求1-32之任一所要求的核酸構建體。
全文摘要
用于基因治療和基因操作的含雜交啟動子的核酸構建體。本發明涉及用于在宿主細胞中精確調節基因表達之核酸構建體,這種構建體顯示出至少一種抑制所表達的基因正常表達的突變,并且顯示出至少另一種消除由第一突變產生的抑制作用的第二突變;本發明還涉及一種分離的細胞,這種細胞含有所述的核酸構建體;本發明也涉及這種核酸構建體在制備藥物和治療具有過量細胞增殖疾病上的用途。
文檔編號C07H21/00GK1179470SQ97119658
公開日1998年4月22日 申請日期1997年9月23日 優先權日1997年9月23日
發明者K－H·塞法特, R·穆勒, H－H·斯德拉斯克 申請人:赫徹斯特股份公司