專利名稱：一種葉酸－殼聚寡糖－花菁熒光染料生物探針及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種高靈敏度葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針及制備方法，屬于化學及生物化學技術交叉學科領域。
背景技術：
癌癥現已成為威脅人類健康的第一殺手，如何有效地控制其發生和發展乃至于實現早期識別已成為當務之急。多數學者認為，對癌癥的早期診斷及有效識別可以極大地提高治療效果。癌細胞的大小形態不一，通常癌細胞比正常細胞體積要大，核質比顯著高于正常細胞；癌細胞的代謝旺盛，癌細胞組織的DNA和RNA聚合酶活性均高于正常細胞，核酸分解過程明顯低于正常細胞，DNA和RNA的含量較高。其次葉酸受體在大部分惡性腫瘤組織表面高度表達，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、結腸癌、鼻咽癌、肺癌等，而在正常細胞中表達高度保守。
傳統的癌細胞識別和診斷主要通過癌胚蛋白檢測，酶類標志物，腫瘤抗原檢測，血漿蛋白檢測和同位素檢測法來確定。但這些方法均存在效率低、識別率低等缺點。近年來，隨著分子生物標記技術不斷發展，在醫學領域尤其是在惡性腫瘤細胞的早期識別和診斷方面逐漸受到人們的關注。
采用生物熒光染料探針在生物領域的相關檢測方法和技術，文獻上已有報道，它與傳統的同位素檢測相比具有速度快、重復性好、用樣量少及無輻射等特點。目前用于細胞標記的生物熒光染料探針主要有吖啶、菲啶類，熒光素類，二氟烷硼類，二苯乙烯類、萘酰亞胺類、菁染料類等。但除菁染料類外，其它的染料自身都會產生強的熒光背景干擾。
2005年1月的《Bioconjugate Chem》上報道了一種用葉酸修飾過的花菁染料作為生物熒光染料探針檢測癌細胞的方法。
作為生物熒光染料探針，如何提高染料的水溶性，在增大其靈敏度的同時提高其光穩定性，并使其具有很好的癌細胞靶向性，是生物熒光染料探針研究的關鍵問題。
目前國內外關于生物熒光染料探針的研究主要集中在以下幾個方面1.熒光染料探針分子的設計、合成及修飾，以提高探針分子與DNA或細胞相互作用的光學靈敏性或增強水溶性為目的。2.增強熒光染料探針分子與癌細胞標記的靶向性修飾。染料分子用適當的配體修飾，通過配體-受體相互作用，實現對癌細胞的靶向性標記。

發明內容
本發明人進行了大量的研究工作后，提出了一種高靈敏度葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針及該探針的制備方法。這種新型探針的水溶性得到顯著提高，并增加了染料與細胞的相容性，在與生物組織結合及成像時表現出熒光加合效應，探針分子與DNA或細胞相互作用的光學靈敏性顯著提高，且具有很好的癌細胞標記的靶向性。
本發明新型探針結構如圖1所示。本發明探針是在一個殼聚寡糖分子上連接1至15個花菁染料分子，再與一個葉酸分子結合形成探針。殼聚寡糖分子的分子量優選195～6000，更優選分子量為200-2000。
本發明探針的制備可以通過本領域常用的方法得以實現，優選通過下述途徑實現，步驟包括
1)殼聚寡糖-花菁染料的制備將花菁染料、摩爾比為0.77∶1的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯和1-羥基苯并三唑溶于溶劑中，將所得溶液冷卻至-5℃后加入殼聚寡糖的水溶液或體積百分比為5％的鹽酸溶液，此時保持花菁染料與殼聚寡糖的摩爾比為0.38∶1；再加入濃度為每毫升含二異丙基乙胺1-3mg的二甲亞砜溶液，混合均勻，于室溫下連續攪拌反應8小時后加入乙醚，繼續攪拌0.5小時，過濾，用乙醚洗滌所得沉淀，于20-30℃下真空干燥后，得到殼聚寡糖-花菁染料干品。
所述溶劑是N，N′-二甲基甲酰胺溶液、氯苯和/或丙酮。
2)葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針的制備將上述殼聚寡糖-花菁染料干品與葉酸按摩爾比為1∶1溶解于二甲亞砜溶液中，于室溫下攪拌反應10小時后加入乙醚，產生沉淀，過濾；所得沉淀用乙醚洗滌后于25-35℃下真空干燥，即得葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針干品。
所述花菁染料為市售花菁熒光染料，優選1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽，1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚二碳菁-5，5′-二磺酸鹽，2-(9-蒽基)-2-羥基乙酸，熒光素和/或帶有羧基的多甲川花菁染料。
本發明探針以殼聚寡糖分子作為葉酸配體和染料分子之間的橋梁，增加了染料的細胞相容性、降低了對生物標記物的毒性，提高了生物探針的靈敏度、降低了探針標記的使用量。且由于殼聚寡糖具有很好的化學活性，很容易對其進行化學改性并修飾具有特定基團的熒光染料，還可根據特定的對象選擇合適的生物分子進行修飾，如修飾配體定位受體及修飾探針DNA檢測目標DNA等。
本發明的特點和優點為1、本發明生物探針制備方法簡單，對變異細胞初步標記研究表明，該探針具有較好的標記靶向性，為采用該類生物探針標記變異細胞進行構效關系研究提供了一種方法。
2、對檢測物的毒性低，靈敏度高，使用量少。由于一個殼聚寡糖分子上可連接眾多花菁染料分子，本發明探針在標記過程中表現出明顯的熒光加和效應，在提高其光穩定性的同時增大了其標記靈敏度，使用量減少。
3、親水性明顯增強，增加了生物探針和細胞的相容性。
4、具有光譜范圍廣、摩爾消光系數大、無熒光背景、熒光量子產率高和靈敏度高等特點。


圖1探針的葉酸-殼聚寡糖-熒光染料結構；圖2熒光染料-殼聚寡糖-葉酸探針標記牛血清蛋白的熒光光譜圖。
其中1.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針、2.花菁熒光染料、3.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針標記蛋白。
具體實施例方式下面以實施例進一步說明本發明，但不限制本發明。
實施例1葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I號的制備
1.制備殼聚寡糖-花菁染料將0.021mmol的1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽，0.027mmol的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)，0.027mmol的1-羥基苯并三唑(HOBT)溶解于5ml N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，將此溶液冷卻至-5℃后；加入含0.054mmol的殼聚寡糖(分子量為1900)的10ml水溶液，再加入含0.108mmol二異丙基乙胺(DIEA)的二甲亞砜(DMSO)溶液1ml后，將該混合物混合均勻后于室溫下連續攪拌反應8小時后加入乙醚并繼續攪拌0.5h后過濾沉淀、再用乙醚洗滌，于室溫(20-30℃)、真空(小于0.1MP)下干燥，得到殼聚寡糖修飾的花菁染料。
2.制備葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針將上述干燥后的花菁染料-殼聚寡糖和0.02mmol蝶酰單谷氨酸(葉酸)溶解于10ml二甲亞砜(DMSO)溶液中于室溫下攪拌反應10小時后，加入乙醚后產生沉淀，過濾，用乙醚洗滌后于25-35℃下真空度為0.1MP時真空干燥。干燥后即得葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I號。
實施例2葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針II號的制備將實施例1步驟1中的花菁染料1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽換成同量的2-(9-蒽基)-2-羥基乙酸；分子量為1900的殼聚寡糖換成分子量為200的殼聚寡糖，其余不變，得到葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針II號。
實施例3葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針III號的制備將實施例1步驟1中的花菁染料1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽換成同量的熒光素；分子量為1900的殼聚寡糖換成分子量為5900的殼聚寡糖，其余條件不變，得到葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針III號。
試驗例1葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針標記蛋白1.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針標記蛋白將實施例1中所得的葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I號溶解于10ml蒸餾水中備用。吸取該溶液2ml，加入5ml濃度為5mg/L的牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA)溶液，用pH＝7.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-HCl)緩沖溶液稀釋至25mL，攪拌30min后于熒光分光光度計上測定其熒光強度。
2.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針熒光強度的變化由于該探針上含有羧基，能和含有氨基的物質如蛋白結合，結合后該探針的熒光性會明顯減弱，由此可以判斷該熒光探針具有識別生物活性物質的能力。圖2是熒光光譜圖，表示了本發明探針用于標記牛血清蛋白時其熒光強度的變化。
試驗發現，葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針在和牛血清蛋白結合后探針的熒光強度在518nm處熒光強度明顯減弱，表明該探針能很好地和蛋白結合，完全可以用于標記蛋白。對蛋白的標記可以確定，該染料探針在用于識別癌細胞時，該探針可很好地和癌細胞表面的葉酸受體結合，染料分子能穿透細胞膜和細胞壁進入細胞核中，到達細胞核的染料分子能表現出熒光可用于識別癌細胞。
權利要求
1.一種葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針，其特征在于具有如下結構 其中n＝1～15。
2.根據權利要求1所述葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針，其特征在于195＜殼聚寡糖分子量＜6000。
3.根據權利要求1所述葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針，其特征在于200＜殼聚寡糖分子量＜2000。
4.根據權利要求1所述殼聚寡糖-花菁染料探針的制備方法，其特征在于制備步驟包括1)殼聚寡糖-花菁染料的制備將花菁染料、摩爾比為0.77∶1的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯和1-羥基苯并三唑溶于溶劑中，將所得溶液冷卻至-5℃后加入殼聚寡糖的水溶液或體積百分比為5％的鹽酸溶液，此時保持花菁染料與殼聚寡糖的摩爾比為0.38∶1；再加入濃度為每毫升含二異丙基乙胺1-3mg的二甲亞砜溶液，混合均勻，于室溫下連續攪拌反應8小時后加入乙醚，繼續攪拌0.5小時，過濾，用乙醚洗滌所得沉淀，于20-30℃下真空干燥后，得到殼聚寡糖-花菁染料干品；所述溶劑是N，N′-二甲基甲酰胺溶液、氯苯和/或丙酮；2)葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針的制備將上述殼聚寡糖-花菁染料干品與葉酸按摩爾比為1∶1溶解于二甲亞砜溶液中，于室溫下攪拌反應10小時后加入乙醚，產生沉淀，過濾；所得沉淀用乙醚洗滌后于25-35℃下真空干燥，即得葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針干品。
5.根據權利要求4所述殼聚寡糖-花菁染料探針的制備方法，其特征在于制備步驟1)中的花菁染料是1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽，1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚二碳菁-5，5′-二磺酸鹽，2-(9-蒽基)-2-羥基乙酸，熒光素和/或帶有羧基的多甲川花菁染料。
全文摘要
本發明涉及一種葉酸－殼聚寡糖－花菁熒光染料生物探針及制備方法。本發明探針是在一個殼聚寡糖分子上連接1至15個花菁染料分子，再與一個葉酸分子結合形成探針。本發明探針用于癌細胞的識別和診斷，具有較好的標記靶向性。本生物探針光譜范圍廣、摩爾消光系數大、無熒光背景、熒光量子產率高，與其他生物熒光染料探針相比，具有低毒性、低使用量、靈敏度高等特點。
文檔編號C09K11/00GK1975418SQ200610015040
公開日2007年6月6日 申請日期2006年7月31日 優先權日2006年7月31日
發明者費學寧, 楊少斌, 張寶蓮, 石博杰 申請人:天津城市建設學院