一種抑制腫瘤生長和轉移的短鏈核酸及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種抑制腫瘤生長的短鏈核酸及其應用。本發明所提供的短鏈核酸為如下(A)或(B)：(A)雙鏈RNA：所述雙鏈RNA由正義鏈(序列1)和反義鏈(序列2)組成；(B)由一條單鏈RNA(序列1)和一條單鏈DNA(將序列2中的U替換為T后所示序列)互補配對形成的嵌合雙鏈。本發明所提供的短鏈核酸在動物水平能在體內有效抑制腫瘤的生長；在細胞水平能夠抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞侵襲、抑制腫瘤細胞遷移和促進腫瘤細胞凋亡。因此，本發明所提供的短鏈核酸作為一種新型小核酸類的抗腫瘤藥物，既能抑制體內腫瘤的生長，降低腫瘤擴散風險，也有望用于預防腫瘤切除或放療、化療后的殘余腫瘤細胞導致的腫瘤復發。
【專利說明】
一種抑制腫瘤生長和轉移的短鏈核酸及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種抑制腫瘤生長和轉移的短鏈核酸及其應用。
【背景技術】
[0002] microRNA是一類由內源基因編碼的長度約為19-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分 子。其在不同的物種間具有很高的同源性，可能調控著人類基因的l/SmicroRNAs參與調控 個體發育，細胞的增殖分化、周期等活動主要有三種方式:成熟的microRNA互補結合mRNA， RI SC特異降解革EmRNA抑制mRNA的翻譯；成熟mi cr〇RNA在不影響mRNA穩定的前提下，與革巴 mRNA的3' UTR，抑制靶mRNA的表達;microRNA與剪切目標mRNA聚腺苷酸末端配對結合后，靶 mRNA被核酸外切酶水解，在轉錄后水平對靶mRNA進行負性調控。通過靶向不同的基因， microRNA實現其腫瘤細胞的功能調控。研究表明，越來越多的原癌或抑癌基因在腫瘤細胞 與正常組織間的表達存在顯著差異，且與腫瘤的發生、發展存在關聯性。運用microRNA的原 癌或抑癌基因的功能，利用相關技術，或可實現腫瘤精準治療的可能。

【發明內容】

[0003] 本發明的第一個目的是提供一種短鏈核酸。
[0004] 本發明所提供的短鏈核酸，為如下(A)或(B):
[0005] (A)雙鏈RNA:所述雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，所述正義鏈具有序列表中序列 1所示序列，所述反義鏈具有序列表中序列2所示序列；
[0006] (B)由一條單鏈RNA和一條單鏈DNA互補配對形成的嵌合雙鏈:所述嵌合雙鏈中的 所述單鏈RNA具有序列表中序列1所示序列，所述單鏈DNA具有將序列表中序列2中的U替換 為T后所示序列。
[0007] 在本發明中，所述(A)中，所述正義鏈的序列具體為序列表中序列1，所述反義鏈具 體為序列表中序列2。所述(B)中，所述單鏈RNA的序列具體為序列表中序列1，所述單鏈DNA 的序列具體為將序列表中序列2中的U替換為T后所示序列。
[0008] 根據需要所述短鏈核酸可經過如下修飾中的至少一種：
[0009] (1)對所述短鏈核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾(如磷酸二 酯鍵中的氧被硫取代）；
[0010] (2)對所述短鏈核酸的核苷酸序列中的核糖的-OH的修飾(如-OH經過甲氧基 取代、氟取代或者脫氧修飾）；
[0011] (3)對所述短鏈核酸的核苷酸序列中的堿基的修飾（如LNA等修飾;膽固醇、甲氧 基、硫代、氨基等修飾;3'或5'的特殊修飾，包括生物素、熒光基團及其它特殊標記）。
[0012] 進一步，所述短鏈核酸為化學合成，可以進行2'氟代甲氧基U^OMe)、 硫代(PS)和脫氧U^deoxy)化學修飾。修飾的短鏈核酸分子可分別表示如下:所述短鏈 核酸-2' -F、所述短鏈核酸-PS、所述短鏈核酸-2' -〇Me和所述短鏈核酸-2' -deoxy。或是核苷 酸序列的5' p、5'巰基、5' NH2、5' Choi、5-Me-dC修飾、5' TET、5' BiotinS' NH2、3' Choi、3' BHQ- ldlabcyl，或是C6S-S修飾等修飾。所述短鏈核酸分子有作用的重要腫瘤調控基因例如轉 錄因子Jun等，但不僅限于該靶基因。
[0013]進一步，含有所述DNA分子的重組載體或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
[0014]本發明的第二個目的是提供一種應用。
[0015] 本發明所提供的應用，具體為:所述短鏈核酸或所述DNA分子或所述重組載體或重 組菌在如下任一中的應用：
[0016] (al)制備用于抑制腫瘤生長的藥物，和/或抑制腫瘤生長；
[0017] (a2)制備用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物，和/或抑制腫瘤細胞增殖；
[0018] (a3)制備用于抑制腫瘤細胞侵襲的藥物，和/或抑制腫瘤細胞侵襲；
[0019] (a4)制備用于抑制腫瘤細胞迀移的藥物，和/或抑制腫瘤細胞迀移；
[0020] (a5)制備用于促進腫瘤細胞凋亡的藥物，和/或促進腫瘤細胞凋亡；
[0021] (a6)制備用于預防腫瘤復發的藥物，和/或預防腫瘤復發。
[0022]其中，所述預防腫瘤復發具體為預防腫瘤摘除術或放化療后殘余腫瘤細胞導致的 腫瘤復發。
[0023]本發明的第三個目的是提供一種藥物。
[0024] 本發明所提供的藥物具有如下(al)-(a6)功能中至少一種，其活性成分為所述短 鏈核酸或所述DNA分子或所述表達盒、重組載體或重組菌；
[0025] (al)抑制腫瘤生長；
[0026] (a2)抑制腫瘤細胞增殖；
[0027] (a3)抑制腫瘤細胞侵襲；
[0028] (a4)抑制腫瘤細胞迀移；
[0029] (a5)促進腫瘤細胞凋亡；
[0030] (a6)預防腫瘤復發。
[0031]根據需要，所述藥物還可包括藥學上可接受的載體。所述藥學上可接受的載體應 當與本發明藥物中的雙鏈RNA分子相容。
[0032]進一步，所述藥學上可接受的載體可為體內轉染試劑，如脂質體，聚乙烯亞胺 (PEI)、陽離子納米聚合物等。或是傳統的藥物載體，糖類、淀粉、纖維素及其衍生物、植物油 等滲緩沖液等。或者是新型藥物載體制劑:大分子物質，如免疫球蛋白、白蛋白、纖維原、葡 萄糖等;經過或未經過改造的細胞，如白細胞、紅細胞等;合成得到的生物可降解性大分子 脂質體，如靜脈乳、磁性球劑、玉脂聚糖球等;合成的非生物降解性大分子，如半滲透微囊、 聚丙烯凝膠等。本發明的藥物可以制成各種醫學上可接受的劑型，并可由醫師根據患者種 類、發病情況、給藥方式等因素中和考慮對病人進行有益的劑量施用。具體劑型可包括口服 液、注射劑、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過加以適當的賦形劑制備成粉劑、片劑、膠囊 劑等多種其他劑型。較佳的制劑為保持短鏈核酸的效能、毒副作用低、給藥途徑適宜。
[0033]在本發明的實施例中，所述藥學上可接受的載體具體為脂質體 Lipofectamine2000(Invitrogen)。相應的，所述藥物中，所述短鏈核酸和所述 Lipofectamine2000的配比具體為(5_50)pmol: lyL，如（20_32)pmol: lyL，具體如20pmol: ly L，或者30pmol: 1此，或者50pmol: 1此。更加具體的，所述藥物中，所述短鏈核酸溶液的濃度 為20wiiol/L，所述短鏈核酸溶液和所述Lipofectamine2000的體積配比具體為（1-1.6): 1， 如 1:1，或者 1.5:1，或者 1.6:1。
[0034]所述藥物中還可以包括葡萄糖、生理鹽水或者緩沖液等。
[0035]在本發明中，所述腫瘤具體為肝癌;所述腫瘤細胞具體為肝癌細胞。更加具體的， 所述肝癌細胞為H印G2細胞或SK-HEP-1細胞。
[0036]實驗證明，本發明所提供的短鏈核酸通過抑制肝癌腫瘤細胞內核轉錄因子Jun的 表達，實現抑制腫瘤生長的作用。在動物水平，將腫瘤細胞接種裸鼠，隨后用所述短鏈核酸 治療的實驗證明所述短鏈核酸能在體內有效抑制腫瘤的生長。另外，在細胞水平，還證實了 本發明所提供的短鏈核酸具有抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞侵襲、抑制腫瘤細胞迀移 和促進腫瘤細胞凋亡的作用。因此，本發明所提供的短鏈核酸作為一種新型小核酸類的抗 腫瘤藥物，既能抑制體內腫瘤的生長，降低腫瘤擴散風險，也有望用于預防腫瘤切除或放 療、化療后的殘余腫瘤細胞導致的腫瘤復發。
【附圖說明】
[0037] 圖1為CCK-8方法檢測實施例1制備的-OH短鏈核酸抑制腫瘤細胞增殖的折線圖；
[0038] 圖2為實施例1制備的2' -OH短鏈核酸抑制腫瘤細胞侵襲的照片圖和柱形圖；
[0039] 圖3為實施例1制備的-OH短鏈核酸抑制腫瘤細胞迀移的柱形圖；
[0040] 圖4為實施例1制備的-OH短鏈核酸促進腫瘤細胞凋亡的柱形圖；
[0041 ]圖5為實施例1制備的-OH短鏈核酸治療肝癌動物實驗結果的折線圖。
【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044] 下述實施例中所涉及的定量實驗，均設置至少3個重復，結果取均值。
[0045] 5周齡的雄性裸鼠：北京維通利華實驗動物技術有限公司(BALB/CNude401)。
[0046] Hep G2細胞：中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(TCHu 72)。
[0047] SK-HEP-1細胞：中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(TCHu 109)。
[0048]實施例1、短鏈核酸的制備
[0049] 本發明中所述短鏈核酸為雙鏈RNA;所述雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，所述正 義鏈的序列為序列表中序列1所示序列（5' -ACUGGGCAGGGCUGUGGUGAGU-3')，所述反義鏈的 序列為序列表中序列2所示序列（5' -ACUCACCACAGCCCUGCCCAGU-3')。選用一條隨機序列作 為陰性對照(NC)，NC的正義鏈的序列為:5' -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'(序列3)，反義鏈的 序列為:5' -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'(序列4)。所述短鏈核酸和所述陰性對照序列中的 A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷 酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核苷酸。
[0050] 所述短鏈核酸及所述陰性對照由上海生工（Sangon)生物工程股份有限公司合成。 將本發明合成的由序列1和序列2組成的短鏈核酸命名為2Z-OH-短鏈核酸。當然，也可以將 所述雙鏈RNA替換為由一條單鏈RNA和一條單鏈DNA互補配對形成的嵌合雙鏈;所述嵌合雙 鏈中的所述單鏈RNA的序列為序列表中序列1所示序列(5^
[0051 ] ACUGGGCAGGGCUGUGGUGAGIK^ )，所述單鏈DNA的序列為將序列表中序列2中的U替 換為T后所示序列 W -ACUCACCACAGCCCUGCCCAGU-30 ;
[0052]實施例2、2' -OH-短鏈核酸對腫瘤細胞增殖的影響
[0053] 將實施例1制備的-OH短鏈核酸和陰性對照粉末分別溶解于DEPC水中，配成終濃 度為20wii〇l/L的溶液。取對數期的肝癌細胞(IfepG2細胞和SK-HEP-1細胞），分別調整細胞懸 液濃度至5X10 5細胞/ml，按每孔lOOyL接種于96孔板;置于37°C，含5%C02的孵箱中使細胞 貼壁，培養過夜。轉染時，分別將〇. 3yL的Y -OH短鏈核酸溶液(濃度為20wiiol/L)和0.3yL的 Lipofectamine2000(Invitrogen)稀釋于25yL無血清培養液(Opti-MEM)中混勾，室溫孵育5 分鐘，然后將上述短鏈核酸溶液與Lipofectamine2000溶液混勻，于室溫靜置20分鐘，將約 50yL的短鏈核酸-脂質體復合物加到細胞培養板中（細胞生長融合率為65% )，分別培養0、 24、48、72和96小時;小心吸去上清，加入90yL新鮮培養基，再加入10yL CCK-8，繼續培養2.5 小時，在酶聯免疫檢測儀450nm處測量各孔的吸光值；同時設置調零孔(培養基，CCK-8)，每 組設置5個復孔。0D450的值越大，說明活細胞數越多，即細胞增殖能力越強；反之，0D450的 值越小，說明活細胞數越少，即細胞增殖能力越弱。
[0054] 結果如圖1所示，圖1表明轉染實施例1制備的210H短鏈核酸的腫瘤細胞的增殖受 到明顯抑制，與陰性對照組(NC)相比較，增殖速率明顯降低。
[0055] 實施例3d' -OH-短鏈核酸抑制腫瘤細胞侵襲能力
[0056] 將實施例1制備的210H短鏈核酸按實施例2的分組及實驗體系進行轉染實驗，轉 染完成后，于37 °C，含5 % C02的孵箱中培養過夜，更換為含5 % (體積分數)FBS的培養基饑餓 培養24h。實驗前，用含0.5% (體積分數)FBS的DMEM培養液按1:6稀釋50mg/L Matrigel(BD 公司Matrigel TM貨號354234)，取60yL包被transwell小室底部膜的上室面，放37°C5%C〇2 培養箱孵育4小時，吸棄上清。轉染后的肝癌細胞PC-3及DU145以胰酶消化，血球計數板計 數，按5 X 103細胞/孔的濃度接種于transwel 1小室，下室加入血清濃度為20 %的培養基700 yL，37 °C 5 % C02培養48h。取出小室，PBS洗一次。加入預冷的甲醇-20 °C固定10min。棄凈甲醇 后清洗三遍。用棉簽輕輕刮去小室上表面的Matrigel膠，用roS洗上表面3次。拿出小室 倒置，風干。將小室放入新的24-we 11中，加入200yL 0.1 %結晶紫(配制方法:稱取0.1 g結晶 紫加100ml冰乙酸溶解完全，搖勻即得），使膜浸沒，37°C染色30min。用ddH20洗3次。小室風 干后，放入孔中，倒置顯微鏡下取若干視野，拍照計數，統計穿過膜的細胞數。穿過膜的腫瘤 細胞數越多，說明腫瘤細胞的侵襲能力越強;反之，穿過膜的腫瘤細胞數越少，說明腫瘤細 胞的侵襲能力越弱。
[0057]結果如圖2所示，圖2表明，與陰性對照組(NC)相比，轉染了實施例1制備的2Z-OH短 鏈核酸的腫瘤細胞的侵襲能力受到明顯抑制。
[0058]實施例-OH-短鏈核酸抑制腫瘤細胞迀移能力。
[0059]將實施例1制備的-OH短鏈核酸和陰性對照粉末分別溶解于DEPC水中，配成終濃 度為20wii〇l/L的溶液。取對數期肝癌細胞(HepG2細胞和SK-HEP-1細胞），分別調整細胞懸液 濃度至1.5X10 6細胞/ml。按1.5X106細胞/孔的濃度接種6孔板，混勻后于37°C5%⑶2培養 過夜。轉染時，分別將8 y L的2' - 0 H短鏈核酸溶液（濃度為2 0 y m 〇 1 / L )和5 y L的 Lipofectamine2000(Invitrogen)稀釋于250此無血清培養液(Opti-MEM)中混勾，室溫孵育 5分鐘，然后將上述短鏈核酸溶液與Lipofectamine2000溶液混勻，于室溫靜置20分鐘，將約 500yL的短鏈核酸-脂質體復合物加到細胞培養板中（細胞生長融合率為85% )。轉染后將6 孔板于37°C5%rad^養過夜，用20iiL槍頭比著直尺，在6孔板中均勻畫直線橫穿過孔，每孔 三條。用TOS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入3 % (體積分數)FBS培養基。放入37 °C5 %⑶2 培養箱繼續培養，分別于Oh、8、24、48h拍照。利用Image-ProPlus量出各照片劃痕的面積及 長度，按劃痕寬度值=劃痕面積面積/劃痕長度值，算出各劃痕寬度;進而計算第48小時劃 痕愈合率，第48小時劃痕愈合率=(Oh劃痕寬度-48h劃痕寬度)/0h劃痕寬度。劃痕愈合率越 大，說明腫瘤細胞的迀移能力越強;反之，劃痕愈合率越小，說明腫瘤細胞的迀移能力越弱。
[0060]結果如圖3所示，圖3表明，與陰性對照組(NC)相比，轉染了實施例1制備的2Z-OH短 鏈核酸的腫瘤細胞的迀移能力受到明顯抑制。
[0061 ]實施例5、2~0H-短鏈核酸促進腫瘤細胞凋亡。
[0062] 將實施例1制備的短鏈核酸按實施例4的分組及實驗體系進行轉染實驗。轉 染完成后，于37°C，含5%C02的孵箱中培養至48h，用不含EDTA的胰酶消化細胞，離心收集細 胞，微量離心機轉速2000rpm，離心時間5min，棄培養基。用冷PBS洗滌細胞兩次(2000rpm，離 心時間5min收集細胞）。
[0063] 用400yL 1 XBinding Buffer(Mbchem M3036)重懸細胞，調整細胞濃度至為 1 X 106cells/ml。在細胞懸浮液中加入5yL AnnexinV-FITC，輕輕混勾后于2_8°C避光條件下孵 育15分鐘。加入10此PI后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。1小時內用流式細胞儀 檢測。沒有熒光或者僅有很低背景熒光的為正常細胞;僅有較強綠色熒光的為早期凋亡細 胞;有紅色和綠色雙重熒光的為晚期凋亡細胞;僅有較強紅色熒光的為壞死細胞。
[0064] 結果如圖4所示，圖4表明，與陰性對照組(NC)相比，轉染了實施例1制備的2Z-OH短 鏈核酸的腫瘤細胞的凋亡比例明顯更高，即實施例1制備的2Z-OH短鏈核酸能夠促進腫瘤細 胞的凋亡。
[0065] 實施例6、-OH短鏈核酸對腫瘤生長的抑制作用
[0066]取對數生長期的肝癌細胞(HepG2細胞），制成單細胞懸液，調節細胞濃度7X 107個 細胞/ml。在5周齡的雄性裸鼠腹股溝中上部注射0.2ml細胞懸液，共注射10只，注射16天后， 皮下可見5mm3的實體瘤，開始用實施例1制備的2Z-OH短鏈核酸和陰性對照處理。將裸鼠分 為兩組，一組為2Z-OH短鏈核酸處理組，一組為陰性對照組。方法如下：用不含RNA酶的無菌 水分別溶解-OH短鏈核酸及陰性對照，配成終濃度為20iimol/L的溶液，以 Lipofectamine2000(Invitrogen)為轉染試劑，分別將150此短鏈核酸溶液(濃度為20M1O1/ 1)和100此的1^口(^6(^&111；[1162000(111￥；[1：1'08611)稀釋于150此無血清培養液（(^1:;[-]\^]\〇中混 勻，室溫孵育5分鐘，然后將上述短鏈核酸溶液與Lip 〇fectamine2000溶液混勻，于室溫靜置 20分鐘后，距腫瘤5mm左右進針，皮下潛行至腫瘤，多點緩慢注射，每只裸鼠100此，每隔兩天 注射一次，共注射5次。再飼養三天后處死所有裸鼠，取出瘤體稱重。注射腫瘤細胞（即接種 腫瘤細胞開始）16天后開始隔兩天測量瘤體長短徑，計算瘤體體積。計算公式為:V(mm 3) = 0.5父長徑\短徑2。
[0067]結果如圖5所示，表明在肝癌的腫瘤模型上，2Z-OH短鏈核酸治療的裸鼠腫瘤的體 積及重量均明顯小于陰性對照處理組(NC)，說明所述2Z-OH短鏈核酸能明顯抑制腫瘤的生 長。
【主權項】
1. 一種短鏈核酸，為如下(A)或(B): (A) 雙鏈RNA:所述雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成，所述正義鏈具有序列表中序列1所 示序列，所述反義鏈具有序列表中序列2所示序列； (B) 由一條單鏈RNA和一條單鏈DNA互補配對形成的嵌合雙鏈:所述嵌合雙鏈中的所述 單鏈RNA具有序列表中序列1所示序列，所述單鏈DNA具有將序列表中序列2中的U替換為T后 所示序列。2. 根據權利要求1所述的短鏈核酸，其特征在于:所述(A)中，所述正義鏈的序列為序列 表中序列1，所述反義鏈為序列表中序列2; 所述(B)中，所述單鏈RNA的序列為序列表中序列1，所述單鏈DNA的序列為將序列表中 序列2中的U替換為T后所形成的序列。3. 根據權利要求1或2所述的短鏈核酸，其特征在于:所述短鏈核酸經過如下修飾中的 至少一種： (1) 對所述短鏈核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾； (2) 對所述短鏈核酸的核苷酸序列中的核糖的2' -OH的修飾； (3) 對所述短鏈核酸的核苷酸序列中的堿基的修飾。4. 編碼權利要求1或2所述短鏈核酸的DNA分子。5. 含有權利要求4所述DNA分子的重組載體或重組菌。6. 權利要求1 _3中任一所述的短鏈核酸或權利要求4所述的DNA分子或權利要求5所述 的重組載體或重組菌在如下任一中的應用： (al)制備用于抑制腫瘤生長的藥物，和/或抑制腫瘤生長； (a2)制備用于抑制腫瘤細胞增殖的藥物，和/或抑制腫瘤細胞增殖； (a3)制備用于抑制腫瘤細胞侵襲的藥物，和/或抑制腫瘤細胞侵襲； (a4)制備用于抑制腫瘤細胞迀移的藥物，和/或抑制腫瘤細胞迀移； (a5)制備用于促進腫瘤細胞凋亡的藥物，和/或促進腫瘤細胞凋亡； (a6)制備用于預防腫瘤復發的藥物，和/或預防腫瘤復發。7. 具有如下(al)-(a6)功能中至少一種的藥物，其活性成分為權利要求1-3中任一所述 的短鏈核酸或權利要求4所述的DNA分子或權利要求5所述的重組載體或重組菌； (al)抑制腫瘤生長； (a2)抑制腫瘤細胞增殖； (a3)抑制腫瘤細胞侵襲； (a4)抑制腫瘤細胞迀移； (a5)促進腫瘤細胞凋亡； (a6)預防腫瘤復發。8. 根據權利要求7所述的藥物，其特征在于:所述藥物還包括藥學上可接受的載體。9. 根據權利要求8所述的藥物，其特征在于：所述藥學上可接受的載體為 Lipofectamine2000 ;所述藥物中，所述短鏈核酸和所述Lipofectamine2000的配比為（5-50)pmol:lyLo10. 根據權利要求6所述的應用或權利要求7-9中任一所述的藥物，其特征在于:所述腫 瘤為肝癌;所述腫瘤細胞為肝癌細胞。
【文檔編號】A61P35/04GK106032533SQ201610633898
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2016年8月4日
【發明人】姜薇, 崔健
【申請人】北京信生元生物醫學科技有限公司