檢測男性不育癥Galntl5基因1個致病突變位點的試劑盒及其PCR擴增方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學領域中的臨床檢測技術，涉及對人類男性不育癥基因致病突變位點的檢測方法。
[0002]本發明提供一種檢測人類男性不育癥致病基因突變的PCR試劑盒。本發明的內容涉及一種檢測男性不育癥Fkbp6基因中1個致病突變位點的試劑盒及其PCR擴增方法，該檢測結果可用來臨床輔助檢測男性不育癥。
【背景技術】
[0003]男性不育癥，是指男子在規律性生活且未避孕的情況下，一年內未使健康配偶妊娠。男性不育癥(Male Infertility)嚴重影響現代男性健康和家庭幸福，據WTO統計表明:育齡夫婦約15%不能生育，其中男性因素占50%。導致男性不育的原因復雜廣泛，涉及生殖系統解剖結構和功能、激素調節、遺傳物質、感染免疫等諸多方面的異常和障礙。其中相當一部分屬于原因不明的特發性不育，包括特發性無精子、弱精子、少精子、畸形精子癥。
[0004]目前，分子生物學方法已經深入到男性不育癥研究當中。導致男性不育的遺傳損害是多種多樣的，除了染色體非整倍體畸形和基因重排，還包括微缺失和單個基因缺陷。小鼠和果蠅基因敲除實驗發現超過3000個基因涉及雄性生育能力的遺傳調控，相關基因不僅涉及生精細胞系，還包括與性腺及軀體發育相關的功能基因調控網絡。目前發現了一大批涉及男性不育的染色體畸形和多效性單基因遺傳病。
[0005]1.AZF 基因
1976年，Tiepolo和Zuffardi通過核型分析發現了 6例無精子癥患者Y染色體長臂的微缺失并提出了無精子因子(AZF)概念，隨后的研究將其定位于Yqll.23，AZFa缺失表現為唯支持細胞綜合征，AZFb缺失表現為生精阻滯，AZFc缺失的病理表現為從正常到無精子。AZF并不是單一的基因，而是在功能上相互關聯的基因家族，在精子發生、發育和成熟中發揮重要作用，各種研究表明嚴重精子發生障礙包括無精子癥患者中約有3%-15%具有Y染色體微缺失。
[0006]2.X來源睪丸特異性逆基因
在精子發生的減數分裂期，性染色體隔離為XY小體，處于轉錄失活狀態，X染色體上活躍表達的管家基因也停止轉錄，而在此時，常染色體上一些X染色體來源睪丸特異性逆基因開始轉錄表達，對其前輩基因的缺失表達起到補償作用，這稱為補償假說，該假說認為逆基因在精子發生中發揮重要作用，它們的突變可能導致男性不育癥的發生。一名少精子癥男子發生在10q22的交互易位，CSTE2T基因就位于10q22~q23，研究推斷少精子癥的發生與其有關。
[0007]3.性激素相關基因
比較常見的有雄激素受體基因(AR),卵泡刺激素受體基因(FSHR),黃體生成素受體基因(LHR)，促性腺激素基因，促性腺激素釋放激素受體基因(GnRHR )。其中，人FSH受體基因第7個外顯子的純合子點突變表現為不同程度的生精損害。LHR基因突變導致的功能喪失會引起睪丸間質細胞發育不良，輕者表現為性腺功能減退，重者表現為男性假兩性畸形。FSH-b突變的男性呈現無精子癥的表現。
[0008]4.線粒體相關基因
線粒體DNA的完整性和精子活動及精液質量普遍相關。KaoS在1995年發現，活動力最低的精子細胞擁有最高的4977bp mtDNA缺失率，認為mtDNA突變在精子病變中發揮重要作用。
[0009]5.人類生精階段標志基因
精子的生成需要經歷有絲分裂、減數分裂和精子形成等幾個階段，不育癥患者可出現不同階段的生精阻滯。研究發現，在某一個階段特異性的表達某些調控生精的關鍵基因，利用睪丸活檢組織進行特定基因表達譜檢測，就可了解精子發生阻滯的階段。
[0010]隨著分子生物學技術的進步和男性不育癥致病基因定位的日漸明確，通過聚合酶鏈式反應(PCR)和基因測序等技術進行分子檢測逐漸大行其道，其中，“分子開關”檢測突變由于其操作簡單、不用測序、成本低廉等優勢，成為廣泛應用的一項技術。
[0011]高保真DNA聚合酶在進行DNA擴增時，當引物與模板完全配對時，則在聚合酶的聚合中心直接進行聚合反應；當引物與模板不完全配對時，則送到酶解中心進行校正，校正后的引物再被送回聚合中心進行聚合反應；如果引物不能被即時校正，則PCR反應無法正常進行，從而引發聚合反應的非成熟性終止。于是產生了“配對引物可以延伸，不配對引物不延伸”二元化效果。在進行點突變分析時，就可以利用這種二元化效果對特定位點進行非此即彼的二元化識別。而且，聚合酶對錯配堿基的識別并不局限于引物的3’末端或新生DNA分子，也能識別3’末端上游1個至數個堿基距離的錯配。根據這一特征，可以認為高保真聚合酶對DNA合成時的堿基錯配存在一個反復識別的過程。由此，可以將耐外切酶消化的硫化磷酸修飾的堿基特異性引物結合具有3’ -5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶進行PCR反應，而構成了受單堿基差異調控的復合突變敏感性“分子開關”。
[0012]該突變敏感性“分子開關”已經成功應用于神經性耳聾基因和苯丙酮尿癥/?"基因突變位點的檢測；對性染色體以及線粒體上的SNP位點的檢測也取得成功，說明“分子開關”突變檢測技術是一種簡便經濟實用的突變檢測方法。本專利運用突變敏感性“分子開關”突變檢測技術，建立了男性不育癥Fkbp6基因的1個致病突變位點的檢測方法。

【發明內容】

[0013]本發明的目的在于提供了一種檢測人類男性不育癥致病基因突變的PCR試劑盒及相應的PCR擴增方法。目的是建立導致人類男性不育癥的Fkbp6基因中1個致病突變位點的檢測方法，該檢測結果用于判讀患者是否攜帶Fkbp6致病突變。
[0014]本發明的技術要點是設計引物，根據目的片段的有無為臨床診斷提供依據。為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
根據男性不育癥的Fkbp6基因中1個致病突變位點T141G設計以下引物:
正常模板配對引物T141G N F:5’-TCCGAGAAGGAGCTG-3’ ；突變模板配對引物T141G ΜF:5’_ TCCGAGAAGGAGCGG-3’ ；共同的下游引物 T141G R:5’ -AGGCTGAGGCAGGAG-3’。其中，所述正常模板配對引物T141G N F和突變模板配對引物T141G M F的3’端的-3與-2位堿基之間的磷酸二酯鍵采用磷硫酰修飾，或將-2位堿基經鎖核酸化(LNA)修飾。其擴增產物長度284bp，其序列見序列表中的序列4。
[0015]本發明提供了檢測一種男性不育癥Fkbp6基因中1個致病突變位點T141G的試劑盒，包括'2 X PCR反應mix。mix中含有PCR反應緩沖液、dNTP、引物、耐熱性高保真DNA聚合酶、溴酚藍上樣緩沖液。
[0016]為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種采用權利要求1和4所述的試劑盒檢測男性不育癥Fkbp6基因1個致病突變位點的一套操作流程，包括:
1，PCR擴增采用權利要求書1的一組引物。
[0017]2，PCR擴增由預變性和30-40次擴增溫度循環組成。PCR反應條件為:95 °C預變性 10 min，94 °C變性 30 sec, 55 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 30 sec，循環 30-40 次。循環結束后72 1: