一種制備人乳頭瘤病毒l1蛋白類病毒樣顆粒的方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥領域，公開了一種快速獲取重組人HPV L1類病毒樣顆粒(VLP)的方法，該方法是羥基磷灰石層析法(Hydroxyapatite，HAP)的優化。將表達重組HPV L1的細胞破碎后得到的粗樣液經初步純化，加入還原劑使目的蛋白組分充分解聚，以五聚體狀態均一存在，然后在一定條件下進行HAP，洗脫過程中目的蛋白L1能自組裝成VLP。本發明的技術方案不僅能有效提高目的蛋白純度，還能在層析過程中即獲得類病毒顆粒，省去了專門的解聚重組裝過程，對提高目的蛋白收率也有很大貢獻，使目的蛋白L1的分離純化工藝變得簡便、易于控制，并適于工業化生產。
【專利說明】
一種制備人乳頭瘤病毒L1蛋白類病毒樣顆粒的方法
技術領域
[0001]本發明涉及從表達人乳頭瘤病毒L1蛋白的原核生物(特別是畢赤酵母菌）中快速 有效獲得高純度的類病毒樣顆粒的方法。
【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒（Human Pap i 11 omav i rus，HPV )屬乳頭多瘤空泡病毒科 (Papovaviridae)乳頭瘤病毒屬。HPV為小的（50~60nm)、無包膜的、由72個五聚體組成的二 十面體DNA病毒。病毒基因組為約8kb的雙鏈閉環DNA，具有8個開放框(0RF)，0RF間可部分或 全部重疊。基因組早期區編碼E1、E2、E4、E5、E6、E7六個非結構蛋白；晚期區編碼L1、L2兩個 結構蛋白，其中L1是分子量為55-60kDa的主要結構蛋白，L1和L2蛋白質在不同的乳頭瘤病 毒中都是非常保守的，兩者共同構成HPV衣殼，比例約5:1，且大多數L2蛋白質在病毒衣殼中 的L1蛋白質的內部;長控制區(LCR)是非編碼區，不編碼任何蛋白。
[0003]由于無法通過組織培養獲得HPV病毒，并且考慮到HPV E6、E7基因的潛在致癌性， 因此不能通過減毒活疫苗或滅活疫苗等傳統疫苗制備方式獲得HPV疫苗。目前研究較多的 HPV疫苗主要是HPV病毒樣顆粒疫苗，而在多種表達系統中無需L2的輔助，單獨L1蛋白質可 以自發組裝成直徑與HPV成熟病毒大小相近的類病毒樣顆粒(Virus like particles，VLP) 的特性，正是制備HPV病毒樣顆粒疫苗的基礎。
[0004]目前較為常用的表達HPV L1的系統有痘病毒表達系統、昆蟲桿狀病毒表達系統、 酵母表達系統、大腸桿菌表達系統等，但都不同程度存在純化工藝繁瑣，病毒樣顆粒均一性 較差的問題，1^6,245,56881、0附0115328(^專利先將樣品中目的蛋白解聚，再用切向流超 濾法更換緩沖液，最后得到的病毒樣顆粒均一性有了較大提高，但額外增加的工藝步驟不 僅耗時費力，還會大大降低目的蛋白的回收率。專利CN1354787A利用羥磷灰石層析 (Hydr 〇Xyapatite，HAP)直接分離重組酵母細胞表達的VLP，但最終獲得的VLP均一完整度不 夠。因此，進行HPV LIVLP分離純化相關工藝的改進很有必要。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是針對現有工藝存在的不足，提供一種能將重組表達的不均一 VLP 以均一VLP的形式分離純化出來的方法。
[0006] -個完整的HPV L1VLP是由72個五聚體(含5個L1蛋白，較穩定的L1蛋白的最小單 位)組成，五聚體與五聚體之間存在二硫鍵，而L1具有自組裝成VLP的特性也得益于二硫鍵 形成時的作用力。通過基本重組表達的L1多以不均一VLP形式存在，因此要想獲得均一的 VLP，首先要進行解聚，可以通過加入一定濃度的還原劑破壞二硫鍵，然后進行重新組裝，即 通過有效方法去除還原劑，使二硫鍵重新形成。本發明即巧妙地將這一解聚重組裝過程嵌 合在了分離純化工藝當中。
【申請人】發明人在研究中意外地發現，在還原劑存在條件下，將 HPV L1用羥磷灰石層析分離純化，后在洗脫過程經去還原劑處理，可直接收獲高純度的組 裝完整且粒徑均一的類病毒顆粒。根據上述發現，
【申請人】研究得到了以下技術方案。
[0007] 本發明的技術方案提供了一種制備人乳頭瘤病毒L1蛋白類病毒樣顆粒的方法，其 特征在于，包括以下步驟：
[0008] 1)取含人乳頭瘤病毒L1蛋白類病毒樣顆粒的料液進行初步純化，初步純化過程中 加入還原劑，得到初步純化液；
[0009] 2)調節初步純化液電導率后，進行羥磷灰石層析，分兩步進行洗脫，第一步用含鹽 的pH6.0~9.0的緩沖液I洗脫，第二步用含磷酸根離子的pH6.0~9.0的緩沖液II洗脫，緩沖 液1、11均不含步驟1)所述還原劑。
[0010] 3)收集緩沖液II的洗脫組分，得到粒徑均一的人乳頭瘤病毒L1蛋白類病毒顆粒
[0011] 根據本發明實施例，步驟1)所述初步純化包括菌體細胞破碎、離心，過濾，在一些 實施方式中，還需要陽離子交換層析;所述的陽離子交換層析所用填料為市售的陽離子填 料，在一些實施方式中，填料是含有-r-s〇 3h的強酸型樹脂，含有-p〇3h2、-p〇2h2或-o-p〇 2h2的 中強酸型樹脂，含有-C00H或-OH的弱酸型樹脂。
[0012] 根據本發明實施例，步驟1 )所述還原劑能破壞二硫鍵，選自二硫蘇糖醇 (Dithiothreitol，DTT)、β-疏基乙醇（Mercaptoethanol)、三（2-駿乙基）勝（Tris(2_ carboxyethy 1)phosphine，TCEP)、半脫氨酸（L( + )-Cysteine)或抗壞血酸(Vitamin C) 〇
[0013] 根據本發明實施例，步驟1)溫度為4-30°C，還原劑的濃度為10-20mM。
[0014] 根據本發明實施例，步驟2)中所述調節初步純化液電導率為15-25mS/cm。
[0015] 根據本發明實施例，步驟2)中所述羥磷灰石層析，溫度為4-25Γ或15-20°C。
[0016] 根據本發明實施例，步驟2)緩沖液I中所含的鹽為不含磷酸根離子的中性鹽，選自 氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀。
[0017]根據本發明實施例，步驟2)緩沖液I中所含的鹽的濃度為1.2~2.0M。
[0018] 根據本發明實施例，步驟2)中所述緩沖液I選自所有不影響目的蛋白穩定性的溶 液，優選為不含還原劑的有酸堿緩沖能力的溶液，包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 (Phosphate Buffer，PB)，[三-(羥甲基)-氨基甲烷]-鹽酸緩沖液，緩沖液I pH為6 · 0-9 · 0或 7 · 0-8 · 5或 7 · 2-7 · 8;緩沖液 I 的濃度為 10-100mM 或 20-80mM 或 40-60mM。
[0019] 根據本發明實施例，步驟2)中所述緩沖液I選自含磷酸根離子的溶液，優選地為磷 酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，磷酸根離子的濃度為 50mM-lM或200mM-700mM或400mM-600mM ;洗脫緩沖液 IIpH為6 · 0-9 · 0，或7 · 0-8 · 5或7 · 2-7 · 8; 洗脫線性流速為40-240cm/h或50-120cm/h或60-70cm/h;洗脫緩沖液中不含前述還原劑。
[0020] 本發明的技術方案提供的方法適于不同型別的人乳頭瘤病毒(HPV) VLP的均一化， 優選能致癌或具有高風險的病毒株，包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52及 HPV58〇
[0021] 本發明的技術方案提供的方法適用于包括痘病毒表達系統、昆蟲桿狀病毒表達系 統、酵母表達系統、大腸桿菌表達系統等表達出來的類病毒顆粒的均一化，包括天然病毒顆 粒的均一化，通常優選酵母表達系統和大腸桿菌表達系統表達的類病毒顆粒的均一化。 [0022]本發明的技術方案提供的方法解聚和重組裝獲得的均一 VLP可由L1蛋白質單獨組 裝，也可由L1蛋白質在L2蛋白質的輔助下組裝。VLP直徑約為50nm。
[0023]本發明中的數字均為近似值，無論有否使用"大約"或"約"等字眼。數字的數值有 可能會出現1%、2%、5%、7%、8%、10%等差異。每當公開一個具有N值的數字時，任何具有 N+/-1%，N+/-2%，N+/-3%，N+/-5%，N+/-7%，N+/-8% 或N+/-10%值的數字會被明確地公 開，其中是指加或減，并且N-10%到N+10 %之間的范圍也被公開。例如，對于"VLP直徑 約為50nm"，則有50nm+/-l%，50nm+/-2%，50nm+/-3%，50nm+/-5%，50nm+/-7%，50nm+/_ 8%和50nm+/_10%的值被同時公開，同時，50nm_10%到50nm+10%之間的范圍也屬于公開 的范圍，亦即45nm-55nm之間的值。
[0024] 本發明使用的定義"或"表示備選方案，如果合適的話，可以將它們組合，也就是 說，術語"或"包括每個所列出的單獨備選方案以及它們的組合。例如，"還原劑選自二硫蘇 糖醇、巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或抗壞血酸"表示在一些實施方式中，還原劑 可以是二硫蘇糖醇、巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或抗壞血酸之中的一種，也可 以是其一種以上的組合。
[0025] 本發明的實施方式中使用的水均為去離子水。
[0026]本發明的有益效果在于：（1)能將不均一的VLP均一化，最終獲得具有完整顆粒度 的VLP; (2)省去額外的解聚重組裝步驟，使解聚重組裝作用在層析過程中得以實現，簡略蛋 白純化步驟、減少工作量的同時，還能有效降低因純化步驟過多造成的蛋白損失；（3)根據 本發明的方法，只需兩步層析即可獲得高純度、完整的VLP，省時省力，實驗簡便，特別是羥 基磷灰石具有較高的目的蛋白載量，更易于實現工業化生產。
[0027]另外，該方法工藝簡單，只需要實驗室常用的層析裝置;相關工藝步驟上下銜接緊 密，中間不需要更換緩沖液;所述填料使用壽命較長，節約成本。
【附圖說明】
[0028]圖1是本發明實施例1中不同階段純化HPV16L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結 果。
[0029]圖2是本發明實施例1經羥磷灰石層析步驟獲得的酵母表達的HPV16L1VLP透射電 鏡觀察結果。
[0030] 圖3是本發明實施例1經羥磷灰石層析步驟獲得的酵母表達的HPV16L1VLP高壓液 相色譜-分子篩層析結果。
[0031] 圖4是本發明實施例2所述不同階段純化HPV16L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 結果。
[0032] 圖5是本發明實施例2所述經羥磷灰石層析步驟獲得的大腸桿菌表達的 HPV16L1VLP透射電鏡觀察結果。
【具體實施方式】
[0033]以下所述的是本發明的優選實施方式，本發明所保護的不限于以下優選實施方 式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發明創造構思的基礎上，做出的若干變形和 改進，都屬于本發明的保護范圍。實施例中所用的原料均可以通過商業途徑獲得。
[0034] 實施例1 [0035] 1)初步純化
[0036]菌體細胞破碎：收獲發酵培養轉化表達HPV16L1VLP的畢赤酵母細胞，用生理鹽水 洗滌菌體細胞三次，去除發酵培養基組分殘余，收集到的菌體細胞于-20 °C凍存。取出凍存 的菌體，稱重后以菌液比1:10比例加入預冷至0°C的含Ο . 2M NaCl、5mM EDTA-2Na、Ο . 05 % Tween-80、pH 8.050mM 1?緩沖液，攪拌解凍至完全融溶，高壓勻漿破碎，1200bar的操作壓 力下循環兩次，使95%以上的菌體細胞破碎，溶胞產物在4°C繼續攪拌lh，使目的蛋白完全 溶解在溶胞懸液中，同時加入20mM DTT，使存在形式較不均一的目的蛋白完全解聚成為均 一性較好的L1蛋白五聚體。
[0037] 離心+深層過濾澄清:將溶胞懸液于12000gX20min離心，除去大部分的不溶性雜 質和菌體碎片，收集上清，微濾膜過濾。微濾裝置是Merck Mi 11 ipore死端過濾器，濾膜孔徑 大小0.65微米。滯留物用1/5體積的微濾緩沖液沖洗收集殘留的溶胞產物。微濾緩沖液是 20mM DTT、0.2M NaCl、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB。獲得的含目的蛋白的溶胞懸液置 于室溫放置待用。
[0038]目的蛋白的捕獲層析：以下步驟均在室溫下進行。GEAKTApurif ier UPC10層析系 統。裝填一個15mL的層析柱Upl.lcirι\2(k；m)，填料為GEMarco-Cap-SP強陽離子交換層析介 質。該柱在使用前用0.5N NaOH溶液清洗消毒，同時將層析柱處理成0H-型，然后用10CV的去 離子水沖洗至中性，再用10CV的微濾緩沖液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]充分平衡。將含目的蛋白的溶胞懸液在室溫條件下上樣至已平衡的陽離子層 析柱，上樣流速200cm/h，上樣完成后用10CV的微濾緩沖液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05% Tween-80、pH 7.450mM PB]沖洗去除未結合雜蛋白及不溶物。以200cm/h的流速，20CV的緩 沖液，采用連續線性梯度洗脫法洗脫目的蛋白，從100%緩沖液A[20mM DTT、0.3M NaCl、 0.05%了￥6611-80、？!1 7.450111]\1?8]到100%緩沖液8[20111]\101'1'、1.01恥(：1、0.05%了￥6611-80、pH 7.4、50mM PB]，280nm檢測，5mL/管分部收集，間隔2-3管進行分析檢測，確認目的蛋 白峰。將各目的蛋白合并，用〇. 45微米濾膜過濾，4 °C備用。
[0039] 2)羥磷灰石層析
[0040] 所有步驟均在室溫下進行。GE AKTA purifier UPC10層析系統。裝填一個llmL的 層析柱（(P丨.丨填料為 Π 型BI0-RAD Marco-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type Π 。該柱在使用前用0.5M NaOH溶液清洗消毒，然后用10CV的去離子水沖洗至中性，再用 10CV的平衡緩沖液A[20mM DTT、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]充分平衡。取樣品液，上 樣前用平衡緩沖液A[20mM DTT、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]適當稀釋樣品液至其電 導率降至20mS/cm，以200cm/h的流速栗入層析柱，上樣完成后先用10CV的平衡緩沖液A [20mM DTT、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]充分沖洗除去未結合的雜蛋白和不溶物，再 用20(^平衡緩沖液扯0.05%了￥6611-80、？!1 7.4501111 ?8]平衡完全清除01'1'殘留，消除01'1'對 后續處理的影響。先用洗脫緩沖液I[1.5M NaCl、0.05%Tween-80、pH 7.4、50mM PB]洗脫去 除雜蛋白組分，然后用洗脫緩沖液11 [ 0.05 % Tween-80、pH 7.4、500mM PB ]洗脫目的蛋白組 分。
[0041] 3)收集人乳頭瘤病毒L1蛋白類病毒顆粒
[0042]收集含目的蛋白組分的洗脫峰，進行SDS-PAGE檢測、透射電鏡觀察和HPLC-SEC (High Performance Liquid Chromatography-Size-Exclusion Chromatography，高壓液 相色譜-分子篩層析)分析。
[0043] 檢測結果見附圖。圖1中，Mr:標準分子量Marker; 1，陽離子層析捕獲的HPV16L1; 2， 羥磷灰石穿透液；3,羥磷灰石過程0.3M NaCl洗脫雜蛋白峰；4,羥磷灰石精純得到的 HPV16L1。電泳結果顯示，通過捕獲和精純兩步層析，獲得的是單一蛋白條帶；圖2中，視野中 可見大量直徑為50nm左右的類病毒顆粒，顆粒大小與理論大小相符，均勻一致;從圖3分析 可知，VLP組裝后能獲得單一組分峰。
[0044] 實施例2
[0045] 1)初步純化
[0046]樣品前處理：收獲發酵培養轉化表達HPV18L1VLP的大腸桿菌細胞，用生理鹽水洗 滌菌體細胞一次，以去除發酵培養基組分殘余，將收集到的菌體細胞于-20°C凍存。取出凍 存的菌體，稱重后以菌液比1:10比例加入預冷至0 °C的含0.2M NaCl、5mM EDTA-2Na、0.05 % Tween-80、pH 8.050mM PB緩沖液，攪拌解凍至完全融溶，高壓勻漿破碎，700bar的操作壓力 下循環兩次，能使95%以上的菌體細胞破碎，溶胞產物在4°C繼續攪拌lh，使目的蛋白完全 溶解在溶胞懸液中，同時加入20mM DTT，使存在形式較不均一的目的蛋白完全解聚成為均 一性較好的L1蛋白五聚體。將溶胞懸液于12000g X 20min離心，除去大部分的不溶性雜質和 菌體碎片，收集上清，即粗提液。
[0047]目的蛋白的捕獲層析：以下步驟均在室溫下進行。GEAKTApurif ier UPC10層析系 統。裝填一個15mL的層析柱Wl.kmUOenO,填料為GE Marco-Cap-SP強陽離子交換層析介 質。該柱在使用前用0.5M NaOH溶液清洗消毒，同時將層析柱處理成0H-型，然后用10CV的去 離子水沖洗至中性，再用10CV的微濾緩沖液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]充分平衡。將含目的蛋白的粗提液在室溫條件下上樣至已平衡的陽離子層析 柱，上樣流速200cm/h，上樣完成后用10CV的微濾緩沖液[20mM DTT、0.2M NaCl、0.05% Tween-80、pH 7.450mM PB]沖洗去除未結合雜蛋白及不溶物。以200cm/h的流速，20CV的緩 沖液，采用連續線性梯度洗脫法洗脫目的蛋白，從100%緩沖液A[20mM DTT、0.3M NaCl、 0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]到100%緩沖液8[20111]\101'1'、1.01恥(：1、0.05%了￥6611-80、pH 7.450mM PB]，280nm檢測，5mL/管分部收集，間隔2-3管進行分析檢測，確認目的蛋白 峰。將各目的蛋白合并，用〇. 45微米濾膜過濾，4 °C備用。
[0048] 2)羥磷灰石層析
[0049] 所有步驟均在室溫下進行。GE AKTA purifier UPC10層析系統。裝填一個llmL的 層析柱丨'(卩丨.k1TOk'm)，填料為Π 型BIO-RAD Marco-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type Π 。該柱在使用前用0.5M NaOH溶液清洗消毒，然后用10CV的去離子水沖洗至中性，再用 10CV的平衡緩沖液A[20mM DTT、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]充分平衡。取樣品液，上 樣前用平衡緩沖液A[20mM DTT、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]適當稀釋樣品液至其電 導率降至20mS/cm，以200cm/h的流速栗入層析柱，上樣完成后先用10CV的平衡緩沖液A [20mM DTT、0.05%Tween-80、pH 7.450mM PB]充分沖洗除去未結合的雜蛋白和不溶物，再 用20(^平衡緩沖液扯0.05%了￥6611-80、？!1 7.4501111 ?8]平衡完全清除01'1'殘留，消除01'1'對 后續處理的影響。先用洗脫緩沖液I[1.5M NaCl、0.05%Tween-80、pH 7.4、50mM PB]洗脫去 除雜蛋白組分，然后用洗脫緩沖液11 [ 0.05 % Tween-80、pH 7.4、500mM PB ]洗脫目的蛋白組 分。
[0050] 3)收集人乳頭瘤病毒L1蛋白類病毒顆粒
[0051]收集含目的蛋白組分的洗脫峰，進行SDS-PAGE檢測、透射電鏡觀。檢測結果見附圖 4、5。圖4中，1為粗提液;2為陽離子捕獲穿透液;3為陽離子純化過程雜蛋白峰;4,陽離子純 化過程目的蛋白峰；5,羥磷灰石過程1.5M NaCl洗脫雜蛋白峰；4為羥磷灰石精純得到的 HPV16L1;圖5視野中可見大量直徑為50nm左右的類病毒顆粒，顆粒大小與理論大小相符，均 勻一致。
【主權項】
1. 一種制備重組人乳頭瘤病毒LI蛋白類病毒樣顆粒的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 取含人乳頭瘤病毒Ll蛋白類病毒樣顆粒的料液進行初步純化，初步純化過程中加入 還原劑，得到初步純化液； 2) 調節初步純化液電導率后，進行羥磷灰石層析，分兩步進行洗脫，第一步用含鹽的 pH6.0-9.0的緩沖液I洗脫，第二步用含磷酸根離子的pH6.0-9.0的緩沖液II洗脫，緩沖液I、 II均不含步驟1)所述還原劑； 3) 收集緩沖液II的洗脫組分，得到粒徑均一的人乳頭瘤病毒Ll蛋白類病毒顆粒。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組人乳頭瘤病毒Ll其表達系統選 自痘病毒表達系統、昆蟲桿狀病毒表達系統、酵母表達系統或大腸桿菌表達系統。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人乳頭瘤病毒包括HPV16、HPV18、 HPV31、HPV45、HPV5、HPV58。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的初步純化包括菌體細胞破 碎、過濾、陽離子交換層析。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的還原劑能破壞二硫鍵，為二 硫蘇糖醇、巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或抗壞血酸。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的還原劑的濃度為10_20mM。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的調節初步純化液電導率為 15_25mS/cm〇8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的緩沖液I和緩沖液II的pH值 獨立地為7.2-7.8。9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的緩沖液I中所含的鹽為不含 磷酸根離子的中性鹽，緩沖液I中鹽的濃度為1.2~2.0M。10. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的緩沖液I為磷酸氫二鈉-磷 酸二氫鈉緩沖液或[三_(輕甲基)_氨基甲燒]-鹽酸緩沖液，緩沖液I的濃度為I 〇~I 〇〇mM。11. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的緩沖液II為磷酸氫二鈉-磷 酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，緩沖液Π 中磷酸根離子的濃度為 400mM-600mM〇
【文檔編號】C12N7/02GK105907729SQ201610279535
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】王振偉, 李勝超, 孫永川, 董軍紀, 熊洋, 蔣鵬, 李志廣, 林小鵲, 蘇彥景, 李文佳
【申請人】廣東東陽光藥業有限公司