煙草中一種具有抗菌活性的生物堿類化合物、其制備方法和用圖
【專利摘要】本發明公開了一種生物堿類化合物，其化學命名為8?羥基?3?羥甲基?6,9?二甲基?7H?苯并[de]異喹啉?7?酮，其分子式為C15H13NO3且具有下述結構：本發明還公開了從煙草中制備上述生物堿類化合物的方法。本發明還公開了上述化合物的用途，經活性測試表明，其具有較好的抑菌作用。本發明化合物結構新穎，且具有較好的抗菌活性。將該化合物用于卷煙接裝紙，能夠消除或降低卷煙接裝紙中細菌滋生和繁殖的可能性。
【專利說明】
煙草中一種具有抗菌活性的生物堿類化合物、其制備方法和 用途
技術領域
[0001] 本發明屬于煙草化學技術領域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的生物堿類 化合物。同時，本發明還涉及該化合物的制備方法和在抗菌接裝紙中的應用。
【背景技術】
[0002] 煙草是世界上化學成分最為復雜的植物，次生代謝產物非常豐富，據1982年Dube 和Green等報道，煙草中已鑒定出的化學成分就超過2549種，至丨」2008年，Rodgman和perf ett i 的報道稱，煙草、煙草代用品以及卷煙煙氣中發現的化合物總數大約為8700種。目前，人們 從煙草中鑒定出來的單體化學物質就超過3000多種，而且還有許多成分尚未鑒定出來。煙 草除主要用于卷煙抽吸用途外，還可從中提取多種有利用價值的化學成分，從中發現有開 發利用價值的先導性化合物。生物堿(alkaloid)是存在于生物體(主要為植物）中的一類含 氮的堿性有機化合物，大多數有復雜的環狀結構，氮素多包含在環內，有顯著的生物活性， 是藥物和生物農藥的重要來源。為充分利用我省煙草資源優勢，進一步尋找新的活性天然 產物，我們對煙草化學成分進行了研究，并從云南烤煙煙葉中分離得到了一種新的生物堿 類化合物，該化合物至今尚未見到相關報道，值得一提的是該化合物具有顯著的抗菌活性。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種新的生物堿類化合物。
[0004] 本發明的另一個目的是提供一種制備所述生物堿類化合物的方法。
[0005] 本發明的目的還在于提供所述生物堿化合物在抗菌接裝紙中的應用。
[0006] 除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為質量百分數。
[0007]本發明從煙草中分1?出一種新的生物堿類化合物，其分子式為C15H13NO3，具有下述 結構廣
[0008；
[0009] 該化甘物的.名為：8-羥.-3-羥中基-6,9-二甲基-7H-苯并[de]異喹啉-7-酮，英 文名為：8_hydroxy-3-(hydroxymethyl)-6，9-dimethyl-7H-benzo[de]quinolin-7_one 〇
[0010] 制備所述生物堿類化合物的方法，該方法包括以下步驟：
[0011] α)浸膏提取:將煙葉樣品粉碎，用高濃度甲醇(w % : 80 %~100 % )或高濃度乙醇 (w% :80%~100%)或高濃度丙酮(w% :60%~90%)為提取溶劑，提取溶劑:煙草(重量比） =2~4:1，浸泡24h~72h，提取3~5次，合并提取液、過濾濃縮成浸膏；
[0012] (2)硅膠柱層析:浸膏用重量比1.5~3倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后用 重量比0.8~1.2倍的80~100目硅膠拌樣，用重量比2~4倍量的160~300目硅膠干法裝柱 進行硅膠柱層析；以體積配比為（1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液 進行梯度洗脫，合并相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮；
[0013] (3)高壓液相色譜分離純化:柱層析洗脫液的8:2部分進一步用高壓液相色譜分離 純化即得所述的生物堿類化合物。
[0014] 高壓液相色譜分離純化是采用21.2mmX250mm，5ym的C18色譜柱，流速為20mL/min， 流動相為52 %的甲醇，紫外檢測器檢測波長為342nm，每次進樣200yL，收集31.5min的色譜 峰，多次累加后蒸干。
[0015] 經所述高效液相色譜分離純化后，一個優選的后續處理方案為，所得化合物再次 用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動相，用凝膠柱層析分離，以進一步分離純化。
[0016] 表 1 化合物 1 的1H-NMR 和 13C-NMR 數據(500/125MHz，C5D5N)
[0017]
[0018] 以上述方法制備得到的生物堿類化合物的結構通過以下方法進行測定。本發明化 合物為橙紅色膠狀物，HR-ESI-MS顯示其準分子離子峰為278.0798[M+Na] +，結合1H-和13C-匪R譜確定分子式為C15H13N0 3。其紅外光譜顯示化合物中有羥基（3412cm-1)、羰基（1650cm 一4，和芳環（1610、1567、1462cm-4信號，紫外光譜在246和342nm有最大吸收也證實化合物 中存在芳環結構。從 1Η匪R譜(數據歸屬見表-1)信號可以看出化合物中有3個芳香族氫信 號（δΗ 8.48s，8.01(d)8.1，7.67((1)8.1);2個甲基信號（δΗ 2.51s和2.80s) ;1 個氧化的亞甲 基(δΗ 4.62);以及1個酚羥基(δΗ 10.42)。化合物的13C NMR和DEPT譜顯示化合物中有8個芳 香季碳（δ。125,3s、131,6s、146,6s、124,7s、151,2s、123.Os、158,7s、120,2s);3個芳香次 甲基（δ。142.6d、128.0d、134.3d);l個α，β-不飽和羰基（δ。181.1s);2個甲基（δ。l〇.5q和 24.8q);以及1個氧化的亞甲基66.9t)。根據HSQC譜歸屬了所有氫對應的碳信號。通過 H3-13 和 05、06、06&，!1-5和(：-3&，(：-6&、(：-14，!1-4和(：-3、(：-3&、(：-11，!12-12和(：-2、(：-3、(：-3a，以及H-2和C-3、C-3a、C-12、C-10的HMBC相關，可證實化合物中存在3-羥甲基-6-甲基異 奎啉的結構片斷。根據化合物的不飽和度1 〇，該化合物中還應有1個環。根據H3-l 4和C-8、C- 9、C-10的HMBC相關，可推測α，β-不飽和羰基中的β-碳(C-9)和異喹啉環的C-10位相聯，并且 羰基(C-7)應和C-6a相連接形成1個六元環。另1個甲基(C-14)取代在C-9位由H3-14和C-8、 〇9、(：-1〇的腿8(：相關得到確定。酚羥基取代在(：-8位可根據(：-8的化學位移值0^151.2)在 低場，以及酚羥基信號（δ Η 10.42)和C-7、C-8、C-9的的HMBC相關確定。至此本化合物的結構 得以確定。該化合物命名為:8_羥基_3_輕甲基_6，9_二甲基-7Η-苯并[de ]異卩奎琳_7_酬。
[0019] 對該化合物進行了抗菌活性篩選，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、埃希菌、枯草 桿菌、變形桿菌等具有顯著的活性。
[0020] 該化合物應用到卷煙接裝紙中，和對照相比較，添加過本化合物的接裝紙檢測細 菌總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、溶血性鏈球菌、真菌總數顯著減少;對大腸 桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抑菌率全部達到96%以上，能夠降低或消 除卷煙接裝紙及在貯存過程中細菌滋生和繁殖的可能性，另外，在卷煙吸食、傳遞過程中， 該抗菌作用也能夠對卷煙煙支上的接裝紙被污染的微生物起到抑制作用。
[0021] 與現有技術相比，本發明具有以下突出優點：（1)本發明的化合物原料易得，提取 方法簡單，容易分離得到;分子結構也簡單，容易實現人工合成。（2)采用了常規柱層析和高 效液相色譜結合的制備方法，化合物制備操作流程簡單，所獲得的本發明化合物純度高，后 續的工業化生產容易實現。（3)本發明化合物對動物無毒，使用安全，展現出良好的抗菌活 性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌率全部達到96%以上;應用于卷煙接裝紙，能夠 對卷煙接裝紙被污染的微生物起到抑制作用。卷煙接裝紙直接和口腔接觸，該化合物在卷 煙接裝紙中的使用可避免在卷煙在吸食、傳遞過程中被微生物污染，有效提高了卷煙的衛 生和安全性。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明生物堿類化合物的核磁共振碳譜；
[0023] 圖2為本發明生物堿類化合物的核磁共振氫譜；
[0024] 圖3為本發明生物堿類化合物的主要HMBC相關。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明，但不以任何方式對本發明 加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護范圍。
[0026] 實施例1
[0027]制備生物堿類化合物C15H13N03,包括浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離，具 體采用以下步驟：
[0028] 1.浸膏提取:取煙葉粉碎，用高濃度甲醇(w% :95%)或高濃度乙醇(w% :95%)或 高濃度丙酮(w% : 70 % )為提取溶劑，提取溶劑:煙草(重量比）=3: 5，浸泡54h，提取4次，合 并提取液、過濾濃縮成浸膏。
[0029] 2.硅膠柱層析:浸膏用重量比2.5倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酮溶解后用重量 比1.2倍的80~100目硅膠拌樣，用重量比3倍量的250目硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析；以 體積配比為（1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2)的氯仿-丙酮溶液進行梯度洗脫，合并 相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮。
[0030] 3.高壓液相色譜分離:柱層析洗脫液的8: 2部分進一步用高壓液相色譜分離純化 即得所述的生物堿類化合物，高壓液相色譜分離純化是采用21.2_乂25〇111 111，5以111的(：18色譜 柱，流速為20mL/min，流動相為52 %的甲醇，紫外檢測器檢測波長為342nm，每次進樣200yL， 收集31.5min的色譜峰，多次累加后蒸干。
[0031] 高壓液相色譜法分離純化后的物質，一個優選的后處理方案為，所得化合物再次 用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動相，用凝膠柱層析分離，以進一步分離純化。
[0032] 本發明所用煙葉原料不受地區和品種限制，均可以實現本發明，下面以來源于云 南不同產地的煙葉原料，對本發明做進一步說明：
[0033] 實施例2
[0034] 煙草樣品來源于云南玉溪，品種為玉溪K326。將煙草取樣2.0kg粉碎以95%的甲醇 提取5次，每次提取24h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0 倍量的純甲醇溶解后用120g的100目粗硅膠拌樣，0.6kg的160目硅膠裝柱進行硅膠柱層析， 用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監測合并相 同的部分，得到8個部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高 效液相色譜分離，以52%的甲醇為流動相，Zorbax SB-C18(21 · 2 X 250mm，5μπι)制備柱為固 定相，流速為20ml/min，紫外檢測器檢測波長為342nm，每次進樣200yL，收集31.5min的色譜 峰，多次累加后蒸干;所得產物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。
[0035] 實施例3
[0036] 煙草樣品來源于云南大理，品種為云煙200,將煙草取樣3.5kg切碎，以95%的乙醇 提取4次，每次提取48h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0 倍量的純甲醇溶解后用250g的80目粗硅膠拌樣，1.2kg的200目硅膠裝柱進行硅膠柱層析， 用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監測合并相 同的部分，得到8個部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖1100半制備高 效液相色譜分離，以52%的甲醇為流動相，Zorbax SB-C18(21 · 2 X 250mm，5μπι)制備柱為固 定相，流速為20ml/min，紫外檢測器檢測波長為342nm，每次進樣200yL，收集31.5min的色譜 峰，多次累加后蒸干;所得產物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。
[0037] 實施例4
[0038] 煙草樣品來源于云南昆明，品種為紅花大金元，將煙草取樣5kg粉碎，以75%的丙 酮用超聲提取3次，每次提取72h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏380g。浸膏用 重量比1.6倍量的純甲醇溶解后用400g的90目粗硅膠拌樣，2.4kg的180目硅膠裝柱進行硅 膠柱層析，用體積配比為1 :〇、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1: 2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC 監測合并相同的部分，得到8個部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用安捷侖 1100半制備高效液相色譜分離，以52 %的甲醇為流動相，Zorbax SB-C18( 21.2 X 250mm，5μ m)制備柱為固定相，流速為20ml/min，紫外檢測器檢測波長為342nm，每次進樣200yL，收集 31.5min的色譜峰，多次累加后蒸干;所得產物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動相，用 Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。
[0039] 實施例5
[0040]------化合物結構的鑒定
[0041 ]取實施例1-4制備的化合物，以上述方法制備得到的生物堿類化合物的結構通過 以下方法進行測定。化合物為橙紅色膠狀物，HR-ESI-MS顯示其準分子離子峰為278.0798[M +Na] +，結合1Η-和13C-NMR譜確定分子式為C15H13N0 3。其紅外光譜顯示化合物中有羥基 (3412cm-〇、羰基（1650cm-和芳環（1610、1567、1462cm-4 信號，紫外光譜在 246 和 342nm 有 最大吸收也證實化合物中存在芳環結構。從1H NMR譜(數據歸屬見表-1)信號可以看出化合 物中有3個芳香族氫信號〇118.488,8.〇1((1)8.1，7.67((1)8.1) ;2個甲基信號0112.518和 2.80s);l個氧化的亞甲基（δH4.62) ;以及l個酚羥基（δHl0.42)。化合物的13CNMR和DEPT 譜顯示化合物中有8個芳香季碳（δ。125.3s、131.6s、146.6s、124.7s、151.2s、123 .Os、 158.7s、120.2s) ;3個芳香次甲基（δ。142.6(1、128.〇(1、134.3(1);1個€[，0-不飽和羰基（3。 181.18) ;2個甲基^10.59和24.89);以及1個氧化的亞甲基^66.壯）。根據!^(：譜歸屬 了 所有氫對應的碳信號。通過 Η3-13 和 C-5、C-6、C-6a，Η-5 和 C-3a，C-6a、C-14，Η-4 和03、0 3&、011，!12-12和(：-2、(：-3、(：-33，以及!1-2和(：-3、(：-33、(：-12、(：-10的腿8(：相關，可證實化合 物中存在3-羥甲基-6-甲基異奎啉的結構片斷。根據化合物的不飽和度10,該化合物中還應 有1個環。根據H 3-14和C-8、C-9、C-10的HMBC相關，可推測α，β-不飽和羰基中的β-碳(C-9)和 異喹啉環的C-10位相聯，并且羰基(C-7)應和C-6a相連接形成1個六元環。另1個甲基(C-14) 取代在C-9位由H 3-l 4和C-8、C-9、C-10的HMBC相關得到確定。酚羥基取代在C-8位可根據C-8 的化學位移值說151.2)在低場，以及酚羥基信號^10.42)和(：-7、(：-8、(：-9的的腿8(：相關 確定。至此本化合物的結構得以確定。該化合物命名為:8_羥基-3-羥甲基-6,9-二甲基-7H-苯并[de ]異喹啉-7-酮。
[0042] 實施例6
[0043] 取實施例3制備的化合物，為黃色膠狀物。測定方法與實施例5相同，確認實施例3 制備的化合物為所述的生物堿類化合物一一8-羥基-3-羥甲基-6,9-二甲基-7H-苯并[de] 異喹啉-7-酮。
[0044] 實施例7
[0045] 取實施例4制備的化合物，為黃色膠狀物。測定方法與實施例5相同，確認實施例4 制備的化合物為所述的8-羥基-3-羥甲基-6，9-二甲基-7H-苯并[de ]異喹啉-7-酮。
[0046] 實施例8
[0047] 取實施例1-4制備的任生物堿類化合物進行抗菌活性試驗，試驗情況如下：
[0048] 體外抗菌實驗用瓊脂擴散法進行，首先將受試菌均勻地涂在普通瓊脂培養基（牛 肉膏、蛋白胨、氯化鈉、血清、瓊脂）的平板上，再將待測化合物(生物堿化合物用10mL DMS0 溶解，加水稀釋成50yg/mL的溶液)浸泡好的藥片(直徑5mm)放在帶菌的培養基上，放入恒溫 箱內，于25°C孵育24-72h后觀察抑菌圈大小。結果表明：本發明化合物對金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、埃希菌、枯草桿菌、變形桿菌等具有很強的活性;抑制率超過96 %。
[0049] 實施例9
[0050]對本發明化合物進行了安全性評價，通過小鼠骨髓微核實驗、Ames實驗和TK基因 突變實驗，證明本發明化合物對動物無毒，使用安全。本化合物以50yg/mL的濃度加到卷煙 接裝紙上；按中華人民共和國《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979-2002的檢測方法， 取加過本發明化合物的卷煙用接裝紙，2.0X3.0mm大小，檢測細菌總數、大腸菌群、金黃色 葡萄球菌、綠膿桿菌、溶血性鏈球菌、真菌總數。結果表明，添加過本發明化合物的接裝紙菌 落總數明顯減少，本化合物對幾種測試的細菌都有明顯抑制作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄 球菌等的抑菌率全部達到96%以上。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的生物堿類化合物：該化合物的命名為:8-徑基-3-?甲基-6,9-二甲基-7H-苯并[de]異哇嘟-7-酬，英文名 為：8-hydroxy-3-(hydroxymethy1)-6,9-dimethyl-TH-benzo[de]quino1in-7-one。2. -種制備權利要求1所述的生物堿化合物的方法，該方法包括W下步驟： (1) 浸膏提取：W煙葉為原料，將煙葉粉碎或切成小段，用重量百分濃度80%~100%的 甲醇或乙醇，或重量百分濃度60%~90%的丙酬為提取溶劑，提取溶劑:煙葉的重量比=2 ~4:1，浸泡24h~72h，提取3~5次，合并提取液、過濾濃縮成浸膏； (2) 硅膠柱層析:浸膏用重量比2~4倍量的160~300目硅膠干法裝柱進行硅膠柱層析； W氯仿-丙酬溶液進行梯度洗脫，合并相同的部分，收集各部分洗脫液并濃縮； (3) 高壓液相色譜分離純化:洗脫液的8:2部分進一步用高壓液相色譜分離純化即得所 需的生物堿類化合物。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，高壓液相色譜分離純化后 的化合物再次用純甲醇溶解，再W純甲醇為流動相，用凝膠柱層析分離，W進一步分離純 化。4. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，所述的高壓液相色譜分離 純化是采用21.2mm X 250mm，5皿的Cis色譜柱，流速為20mL/min，流動相為52 %的甲醇，紫外 檢測器檢測波長為342nm，每次進樣20化L，收集31.5min的色譜峰，多次累加后蒸干。5. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的浸膏在經硅膠柱層 析粗分前，用重量比1.5~3倍量的純甲醇或純乙醇或純丙酬溶解后，用重量比0.8~1.2倍 的80~100目硅膠拌樣。6. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的梯度洗脫，氯仿-丙 酬溶液體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。7. 根據權利要求1所述的生物堿類化合物用于殺滅細菌和真菌的用途。8. 根據權利要求7所述的用途，其中將該生物堿類化合物應用于卷煙接裝紙上。
【文檔編號】A01P3/00GK105906566SQ201610338953
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】葉靈, 李超, 秦云華, 熊文, 范多青, 芮曉東, 申欽鵬, 楊光宇, 繆明明
【申請人】云南中煙工業有限責任公司