一種快速篩選制備小分子類物質單克隆抗體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速篩選制備小分子類物質單克隆抗體的改良方法。主要包括三個抗體制備條件的變化：1)具用1/10～50脾臟用于細胞融合制備小分子類物質單克隆抗體；2)脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞融合時混合的比例為1∶1；3)融合細胞株篩選方法采用直接競爭ELISA(一步法)，通過此方法可以一步得到與小分子類物質有陽性反應的融合細胞株。本發明建立了一種可通過直接競爭ELISA(一步法)篩選對小分子類物質有陽性反應的雜交瘤細胞株，解決了傳統篩選方法篩選量大，篩選周期長的問題，大大降低了小分子類物質單克隆抗體制備的周期和成本。
【專利說明】
一種快速篩選制備小分子類物質單克隆抗體的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種快速篩選制備小分子類物質單克隆抗體的方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]單克隆抗體技術，是指將某種抗原誘導產生的特異性B淋巴細胞和骨髓瘤細胞經融合，形成雜交瘤細胞，并分離篩選出單個雜交瘤細胞，再將其擴增，最終分離純化制得單克隆抗體。雜交瘤細胞具有雙重特性，既能如骨髓瘤細胞般持續繁殖，又能如B淋巴細胞般分泌針對單一抗原決定簇的特異性抗體，即單克隆抗體。盡管單克隆抗體越來越廣泛地應用于各個研究領域，但是自1975年問世以來，制備單克隆抗體一直沿用傳統方法，成為一經典技術發展的瓶頸。制備單克隆抗體包括抗原制備，動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選、亞克隆、凍存復蘇、雜交瘤細胞及單克隆抗體特性的鑒定以及單克隆抗體的大量生產等一系列復雜步驟，一般要花費6個月以上的時間。其中雜交瘤細胞的篩選這一步驟最為耗時。
[0003]目前篩選小分子類物質單克隆抗體雜交瘤細胞，都是采用兩步法，先通過酶聯免疫篩選出對小分子與載體蛋白復合物有陽性反應的單克隆抗體，再通過競爭抑制法篩選出對小分子抗原有陽性反應的單克隆抗體。此方法耗時且繁瑣，而且傳統的單克隆制備方法細胞融合多數采用骨髓瘤細胞:脾細胞=I: 5-10之間的比例融合，通過一次融合，一般會有數千上萬孔雜交瘤細胞，融合較好的時候100 %的孔里都有多克隆雜交瘤細胞生長，但是最終只有不到10%的孔里面含有目標雜交瘤細胞，所以要從如此多的雜交瘤細胞中篩選出目標雜交瘤細胞，其篩選量是非常巨大的。一輪篩選通常需要進行幾十次間接elisa實驗，花費數周時間，這大大增加了單克隆抗體的制備周期，也增加了生產成本。

【發明內容】

[0004]針對上述現有小分子類物質單克隆抗體雜交瘤細胞篩選技術中存在的缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種優化的細胞融合方式和直接競爭ELISA( —步法)篩選雜交瘤細胞的方法，此方法可以大大縮短了小分子類物質單克隆抗體雜交瘤細胞篩選技術周期。
[0005]本發明一種快速篩選制備小分子類物質單克隆抗體(以苯乙醇胺A為例)的方法，包括如下步驟:
[0006]I)用純化的苯乙醇胺A-BSA人工抗原免疫BALB/C小鼠；
[0007]2)取免疫完成后的小鼠脾臟，分離小鼠的脾臟細胞，等分為10-50份，液氮保存備用；取一份脾臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 (I: I)融合，并在含有HAT的培養基中進行選擇性培養；
[0008]3)直接競爭ELISA(—步法)篩選出對苯乙醇胺A有陽性反應的雜交瘤細胞株(圖1)，并分別進行保存；
[0009]4)用陽性的雜交瘤細胞株制備單一的抗苯乙醇胺A單克隆抗體。
[0010]本發明通過優化的細胞融合方式和一步法雜交瘤細胞篩選的方法，大大地縮短了制備小分子類物質單克隆抗體的周期，大大地節約時間和成本。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明一步法(直接競爭ELISA)篩選雜交瘤細胞株的示意圖。
[0012]圖2為本發明方法制得的抗苯乙醇胺A抗體的抑制ELISA檢測結果
【具體實施方式】
[0013]實施例1實驗動物免疫
[0014]用純化的苯乙醇胺A-BSA人工抗原皮下多點注射免疫6-8周雌性BALB/C鼠(每只小鼠200 μ I)，首次免疫注射時，分別100 μ g/mL的免疫抗原100 μ L，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔直接注射。間隔兩周后，取用樣的抗原，與100 μ L不完全佐劑乳化，同樣方法注射。兩周后取血測定抗體的效價。
[0015]實施例2抗苯乙醇胺A單克隆抗體雜交瘤細胞的制備
[0016]經腹腔注射苯乙醇胺A-BSA結合物加強免疫小鼠，4天后，將小鼠處死。取免疫完成后的小鼠脾臟，分離小鼠的脾臟細胞，等分為10-50份，液氮保存；取一份脾臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0 (I: I)融合，接種4-10個96孔細胞培養板，然后在含HAT的培養基進行選擇培養。
[0017]實施例3抗苯乙醇胺A單克隆抗體雜交瘤細胞的篩選
[0018]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為100納克每毫升的苯乙醇胺A-OVA結合物加到96孔酶標板的小孔中，4°C放置一晚上。第二天將苯乙醇胺A-牛血清白蛋白結合包被的96孔酶標板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(I % BSA/洗液)室溫封閉2小時。將封閉液倒掉，然后實驗組將50 μ I苯乙醇胺A溶液(濃度為10 μ g/ml)和50 μ I實施例2得到雜交瘤細胞培養液分別加到96孔板，對照組用50 μ I不含苯乙醇胺A的溶劑和50 μ I雜交瘤細胞培養液加到96孔板中。室溫孵育I小時，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ IHRP標記的羊抗鼠IgG抗體加入96孔酶標板的小孔中，室溫孵育I小時，用洗液洗2次，加入100 μ ITMB顯色反應底物，室溫顯色30分鐘后2mol/LH2SO4終止，肉眼即可觀察陽性結果，實驗組無色，對照組黃色即可判定此雜交瘤細胞株為抗苯乙醇胺A特異性的陽性雜交瘤細胞株。
[0019]實施例4雜交瘤細胞的克隆化培養
[0020]單克隆雜交瘤細胞計數，經過系列的稀釋制備濃度為I個細胞/200 μ I的單細胞懸液。將200 μ I的單細胞懸液加到96孔細胞培養板中(I細胞/0.2ml/孔)。在37°C，5%二氧化碳的細胞培養箱培養。約10天左右選擇單克隆孔，檢測抗體，選擇抗體OD值高、細胞生長好的克隆，進行擴大培養、建系、保存。
[0021]實施例5抗苯乙醇胺A單克隆抗體的制備和純化
[0022]腹腔注射成年BALB/C鼠0.1ml不完全福氏佐劑，I周后腹腔注射實施例4得到的生長狀態良好的抗苯乙醇胺A單克隆雜交瘤細胞株(16個細胞/小鼠)，2-4周左右小鼠腹部可見明顯膨大，用注射器吸取腹水。離心后吸取上清，用硫酸銨飽和沉淀后，再用蛋白A或蛋白G親和層析柱繼續純化。
[0023]實施例6抗體效價的測定
[0024]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為10 μ g每毫升的苯乙醇胺A-0VA結合物加到96孔酶標板的小孔中，4°C放置過夜。第二天將苯乙醇胺A-OVA結合包被的96孔酶標板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(1% BSA/洗液)室溫封閉2小時。將封閉液倒掉，然后將抗體稀釋100倍后，按1: 4的比例系列稀釋，將ΙΟΟμΙ各個稀釋度的抗體加到96孔板，室溫孵育2小時，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ I HRP標記的羊抗鼠IgG抗體加入96孔酶標板的小孔中，室溫孵育I小時，用洗液洗2次，加入100 μ I TMB顯色反應底物，室溫顯色30分鐘后2mol/L H2SO4終止，在波長為450納米讀光吸收值。OD值大于陰性對照2.1倍的最高的稀釋倍數即為抗體的效價。實驗結果表明本發明所述抗苯乙醇胺A抗體的效價為102400。
[0025]實施例7抗體親和力測定
[0026]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為10 μ g每毫升的苯乙醇胺A-0VA結合物加到96孔酶標板的小孔中，4°C放置一晚上。第二天將苯乙醇胺A-牛血清白蛋白結合包被的96孔酶標板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(1% BSA/洗液)室溫封閉2小時。先將抗苯乙醇胺A抗體與不同濃度的苯乙醇胺A孵育，然后將該孵育液加到96孔板中，室溫孵育2小時，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ IHRP標記的羊抗鼠IgG抗體加入96孔酶標板的小孔中，室溫孵育I小時，用洗液洗2次，加入100 μ ITMB顯色反應底物，室溫顯色30分鐘后2mol/L H2SO4終止，在波長為450納米讀光吸收值。抗體的親和力用公式A。/ (A0-A) = Ι+Κ/a。計算，A。為苯乙醇胺A濃度為O時的OD值，A為苯乙醇胺A濃度為a。時的OD值，K為親和常數的倒數。實驗結果表明本發明所述的抗苯乙醇胺A抗體的親和力大約為1.6 X 10 SM。
[0027]實施例8苯乙醇胺A抗體IC4。的測定
[0028]將50 μ I溶于CB緩沖液濃度為50ng/ml的苯乙醇胺A-OVA結合物加到96孔酶標板的小孔中，4°C放置過夜。第二天將苯乙醇胺A-OVA結合包被的96孔酶標板用洗液(含有0.05% Tween的PBS緩沖液)洗兩次。然后用封閉液(I % BSA/洗液)室溫封閉2小時。將封閉液倒掉，將50 μ I不同稀釋度(0.01-100ng/ml，每一濃度均作三復孔)的苯乙醇胺A溶液，然后加入50 μ 11: 10000倍稀釋的抗體，混勻。室溫孵育I小時，將上清液倒掉，用洗液洗板2次，然后加入100 μ I HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育I小時，用洗液洗2次，加入100 μ I TMB顯色反應底物，室溫顯色30分鐘后2mol/L H2SO4終止，在波長為450nm讀光吸收值。以競爭物苯乙醇胺A競爭濃度為橫坐標，以加入競爭物苯乙醇胺A的檢測孔的OD450nni(B)與未加競爭物的對照孔的OD450nni(B。)的比例，稱為結合率)為縱坐標制作競爭抑制曲線，得到IC5。。實驗結果表明本發明所述抗苯乙醇胺A抗體的IC5。為5ng/ml (圖 2)。
【主權項】
1.用1/10?50脾臟用于細胞融合制備小分子類物質單克隆抗體。2.脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞融合時混合的比例為1:1。3.融合細胞株篩選方法采用直接競爭ELISA(—步法)，通過此方法可以一步得到與小分子類物質有陽性反應的融合細胞株。4.根據權利1-3所述的3個抗體制備條件同樣適合于青霉素等其它小分子類物質。
【文檔編號】C12N5/20GK105884899SQ201510007043
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月8日
【發明人】張偉
【申請人】成都酷賽生物技術有限公司, 上海酷賽生物技術有限公司