內切褐藻膠裂解酶Alg2B及編碼基因和制備與應用
【專利摘要】本發明公開一種來源黃桿菌(Flavobacterium sp.S20)的內切褐藻膠裂解酶Alg2B的基因序列。本發明還提供了一種制備該新型褐藻膠裂解酶的方法，即利用基因工程的技術方法，將該新褐藻膠裂解酶的基因克隆到大腸桿菌表達載體上，獲得可異源表達該酶的大腸桿菌重組菌株，用該菌株異源表達制備的褐藻膠裂解酶Alg2B，能降解褐藻酸鈉產生單糖和寡糖。本發明提供的褐藻膠裂解酶Alg2B可廣泛應用于農業、食品、飼料添加、醫藥及海藻遺傳工程等領域。CGMCC No.502620110705
【專利說明】
內切褐藻膠裂解酶Alg2B及編碼基因和制備與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種來源于黃桿菌（Flavobacterium sp. S20,保藏編號：CGMCC N0. 5026)的內切褐藻膠裂解酶Alg2B的基因序列及其制備方法和應用。本發明還提供了該 內切褐藻膠裂解酶的重組質粒和重組基因工程菌株。本發明的內切褐藻膠裂解酶Alg2B可 廣泛應用于農業、食品、飼料添加、醫藥及海藻遺傳工程等領域。
【背景技術】
[0002] 褐藻是海洋中含量豐富的經濟類海藻植物，它含有褐藻膠（algin)、褐藻糖 膠（fucoidan)及海帶淀粉（laminaran)等多種多糖。在藻體中，褐藻膠主要以褐藻酸 (alginic acid)、堿金屬鹽類（鈉鹽、鉀鹽）和二價鹽類（媽鹽、鎂鹽）等形式存在（Tusi S K et al.，Biomaterials，2011，32:5438-5458;秦國奎等，中國生物工程雜志，2004, 24: 26-33)。目前市場上的褐藻酸鈉（商品名為海藻酸鈉）或其他褐藻酸鹽主要是從褐藻中獲 得。降解褐藻酸鈉可以獲得單糖和/或寡糖，其中單糖可用于發酵生產生化試劑或生物燃 料（Wargacki A J et al.，Science，2012,335 :308-313)，而寡糖因其具有免疫調節、神經 保護、促生長、誘導植物抗性等多種生物活性，可廣泛應用于農業、食品、飼料添加和醫藥等 領域（竇勇，廣西輕工業，2009, 10:12-13)。
[0003] 褐藻膠裂解酶是一類通過0 -消去反應斷裂褐藻膠的裂解酶，因其具有專一、 高效及反應溫和等優點，且能為后續研究寡糖化學結構提供信息，故而褐藻膠裂解酶逐 步成為優先降解褐藻酸鈉的方法。另外，褐藻膠裂解酶還能應用于肺囊腫性纖維化癥的 治療、海藻飼料加工及海藻遺傳工程等領域的研究（Wong TY et al.，Annual Review of Microbiology，2000, 54:289-340)。褐藻酸裂解酶來源豐富，包括海洋動植物和多種微生 物（包括海洋細菌、土壤細菌和真菌）。褐藻膠裂解酶按底物專一性可分為聚甘露糖醛 酸片段裂解酶（EC 4. 2. 2. 3)和聚古洛糖醛酸片段裂解酶（EC 4. 2. 2. 11)，也可按反應模 式分為內切或外切酶（李麗妍等，生物工程學報，2011,27:838-845)。天然的褐藻膠裂 解酶可通過常規的蛋白質分離純化技術從產酶的生物體中獲得。此種方法雖然能有效的 獲得一定量的酶蛋白，但產量有限，成本較高，較難滿足實際應用需求。基因工程技術的 發展，為褐藻膠裂解酶的高效生產提供了新途徑。通過基因克隆方法已從假單胞菌、鏈霉 菌、鞘氨醇單胞菌等多種微生物中獲得褐藻膠裂解酶（Maki et al.，Journal of General Microbiology，1993, 139:987-993 ;Kim et al.，Marine Biotechnology. 2009. 11:10-16 ; Hye-Jin Yoon et al.，Protein Expression and Purification，2000,19 :84_90) 〇 黃桿 菌屬是一類典型的好氧化能異養細菌，有文獻報道黃桿菌具有良好降解褐藻酸鈉的能力 (JEAN-FRANCOIS BERNARDET et al,Prokaryotes, 2006, 7:481 - 531 ；An Q D et al, Canadian Journal of Microbiology, 2008,54:314-320)，目前對于該屬菌株所產褐藻膠 裂解酶基因研究報道較少，因此將黃桿菌菌株Flavobacterium sp. S20作為出發菌，挖掘其 褐藻膠裂解酶基因資源。

【發明內容】

[0004] 本發明的第一個目的是提供一種新型的內切褐藻膠裂解酶Alg2B及其編碼基因。
[0005] 本發明的第二個目的是提供一種制備新型內切褐藻膠裂解酶Alg2B的方法。
[0006] 本發明的第三個目的是提供含有所述的內切褐藻膠裂解酶Alg2B基因重組表達 質粒和重組基因工程菌株。
[0007] 本發明的另一個目的是提供新型內切褐藻膠裂解酶Alg2B在褐藻酸鈉降解中的 應用。
[0008] 本發明所提供的內切褐藻膠裂解酶Alg2B，來源于土壤中分離純化的黃桿菌屬新 菌株Flavobacterium sp. S20 (保藏編號：CGMCC N0. 5026)，其氨基酸序列具有如下特征之
[0009] 1)序列表中的SEQ ID N0. 2從氨基端開始的第1-754或28-754位氨基酸殘基序 列，其中1-27位為信號肽，28-754位為有活性的褐藻膠裂解酶Alg2B的氨基酸序列。
[0010] 2)將序列表中的SEQ ID N0. 2從氨基端開始的第1-754或28-754位氨基酸殘基進 行一個或幾個氨基酸取代、缺失或添加而形成具有褐藻膠裂解酶活性不變的氨基酸序列。
[0011] 本發明還提供了內切褐藻膠裂解酶Alg2B的編碼基因（命名為alg2B)，具有下述 核苷酸序列特征之一：
[0012] 1)序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列；
[0013] 2)編碼序列表中SEQ ID N0. 2氨基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列；
[0014] 3)與SEQ ID NO. 1限定的脫氧核糖核酸（DNA)序列的同源性達到80%及以上，且 能編碼降解褐藻酸鹽的蛋白質的脫氧核糖核酸（DNA)序列。
[0015] 3)對序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列進行一個或幾個核苷酸取 代、缺失或添加而得到的編碼具有褐藻膠裂解酶活性的核苷酸序列。
[0016] 本發明的褐藻膠裂解酶Alg2B的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列也可以根據預 測的Alg2B的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列人工合成獲得。
[0017] 制備重組酶Alg2B的方法，是將編碼基因alg2B克隆入重組表達載體，導入宿主細 胞，獲得重組表達的內切褐藻膠裂解酶。
[0018] 所述的重組表達內切褐藻膠裂解酶Alg2B的表達載體可以是大腸桿菌表達載體、 酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真 菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體等。
[0019] 用于重組表達內切褐藻膠裂解酶Alg2B的的重組菌或轉基因細胞系，可以是大 腸桿菌宿主細胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5a 等）、酵母菌宿主細胞（如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces lactis 等）、枯草桿菌宿主細胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如 Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放線菌 宿主細胞（如Streptomyces spp?等）、絲狀真菌宿主細胞（如Trichoderma viride， Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞（如 Bombyx mori，Antharaea eucalypti等）或哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CH0,幼小 倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）。
[0020] 本發明的內切褐藻膠裂解酶Alg2B的基因序列是通過熱不對稱交錯 卩0?〇^11-?0?)技術從黃桿菌菌株520$13￥(*3(^64111118口.520)中克隆得到。該基因編碼 區長2265bp，編碼了 754個氨基酸，分子量約84. 48kDa，屬于多糖裂解酶17家族。大腸桿 菌重組表達獲得的Alg2B，以褐藻酸鈉為底物時，在40°C、pH8. 0的條件下具有最高酶活性， 比活為〇.〇35U/mg。相對于褐藻酸鈉和聚古洛糖醛酸片段（polyG)這兩種底物，Alg2B對聚 甘露糖醛酸片段（polyM)有更高的降解活性。
[0021] 本發明的內切褐藻膠裂解酶Alg2B可廣泛應用農業、食品、飼料添加、醫藥及海藻 遺傳工程等領域。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :褐藻膠裂解酶Alg2B基因的電泳檢測
[0023] 圖2 :重組褐藻膠裂解酶Alg2B純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（SDS-PAGE)。各 泳道加入的樣品分別是：泳道M-預染蛋白分子量標準；泳道1-E. co 1 i BL21 (DE3) / pET21a-Alg2B破菌后上清；泳道2-破菌上清經鎳柱的流出液；泳道3-20mmol/L咪唑洗脫 液；泳道4-40mmol/L咪唑洗脫液；泳道5-60mmol/L咪唑洗脫液；泳道6-80mmol/L咪唑洗 脫液；泳道7-100mmol/L咪唑洗脫液；泳道8-120mmol/L咪唑洗脫液；泳道9-150mmol/L咪 唑洗脫液
[0024] 圖3 :pH值對內切褐藻膠裂解酶Alg2B的影響曲線；A_Alg2B的最適反應pH值； B-Alg2B的pH值穩定性。
[0025] 圖4 :溫度對內切褐藻膠裂解酶Alg2B的影響曲線；A_Alg2B的最適反應溫度； B-Alg2B的熱穩定性。
[0026] 圖5 :內切褐藻膠裂解酶Alg2B的底物偏好性曲線。
[0027] 圖6 :內切褐藻膠裂解酶Alg2B降解褐藻酸鈉所得產物的薄層層析分析。泳道1 : 半乳糖醛酸標準品；泳道2 :poly(M);泳道3-7 :Alg2B降解poly(M)不同時間的水解產物 (3 :10min ;4 :20min ;5 :40min ;6 :60min ;7 :90min) 〇 本發明中所述黃桿菌Flavobacterium sp. S20,保藏編號為CGMCC N0. 5026,保藏單位 為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，保藏日期為2011年7月5日。
【具體實施方式】
[0028] 實施例1褐藻膠裂解酶全長基因克隆
[0029] 按細菌基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa公司）操作步驟提取黃桿菌菌株S20的基 因組DNA。對Carbohydrate Active Enzyme (CAZy)數據庫中裂解酶17家族的褐藻膠裂解 酶基因序列進行多序列比對分析后，設計簡并引物PL 17-F: 5 ' -TTYTGGCARTGYYTAAAYGA-3 ' ； PL17-R:5' -GTAITRTGNGCWATNGITTGITTKGCCCA-3'。以菌株 S20 的基因組 DNA 為模板進行 PCR擴增。PCR 反應條件為：94°C 5min，l 個循環；94°C 30s，45°C 30s，72°C lmin30s，30 個循 環；72°C 10min，l個循環。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析后，切膠回收目的片段，連接到 PMD18-T載體后測序。根據已獲得的酶基因核苷酸序列設計巢式特異引物，而隨機引物選自 先前已報道的文獻（Gong et al. , African Journal of Agricultural Research, 2009,4 ： 402-408)，然后根據參考文獻（Liu et al.，Genomic, 1995, 25:674-681)中的熱不對稱交錯 PCR方法來擴增褐藻膠裂解酶基因保守段序列兩側的未知序列。PCR產物進行電泳分析，挑 選理想條帶切下膠回收，與PMD18-T載體連接，測序分析并進行序列拼接。根據拼接得到的 酶基因全長序列設計引物（PF:5, -ATGATATAmTTATAAAACAAAA-3' ；PR:5' -TTAITTAATTAA TGTATTATAATG-3'），以菌株S20的基因組DNA為模板，用Pfu DNA聚合酶擴增褐藻膠裂解 酶基因全長。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析后（見圖1)，切膠回收目的片段，連接到 PMD18-T載體后測序。
[0030] 實施例2褐藻膠裂解酶基因序列分析
[0031] 測序的結果米用 GenBank 數據庫中的 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)分析，Vector NTI Suite 8.0軟件進行多序列比對，分析其同源性。采用 Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)在線工具分析序列的結構域。
[0032] 獲得的褐藻膠裂解酶基因（命名為alg2B)編碼區長2265bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。alg2B的核苷酸序列與來源于Cellulophaga algicola DSM 14237菌株的 肝素酶II/III家族蛋白的基因（登錄號CP002453. 1)有最高一致性（70% )。alg2B編碼 754個氨基酸和一個終止密碼子，其氨基酸序列如SEQ ID N0 2所示，蛋白質理論分子量為 84. 48kDa，預測等電點為8. 26。SMART分析表明，Alg2B的氨基酸序列中1-27位為信號肽， 405-554位為肝素酶II/III樣蛋白結構域。Alg2B的結構域特征與多糖裂解酶17家族成 員更為相似，由此表明Alg2B為PL17家族的一名新成員。用SWISS-MODEL同源建模服務器 (//swissmodel. expasy. org)對褐藻膠裂解酶Alg2B的蛋白質三維結構進行同源建 模，結果顯示構建的Alg2B結構模型的QMEAN(QMEAN為評價模型質量的分值）較低，說明得 到的Alg2B三維結構模型不可信。
[0033] 實施例3alg2B基因在大腸桿菌中的重組表達
[0034] 以菌株S20的基因組DNA為模板，利用設計的上游引物（NX-F:5, -CCCCCATATGC AAGGGCATCCAAGACTAATCATG-3'）和下游引物（NX-R:5, -CCCCTCGAGITTAATTAATGTATTATAAT GT AC-3'）擴增編碼褐藻膠裂解酶的成熟蛋白的基因序列（不包括信號肽基因）。上下游 引物中分別含有Ndel和Xhol酶切位點。PCR擴增產物和表達載體pET21a(美國Novagen 公司）用Ndel和Xhol進行雙酶切，酶切產物經電泳分離和凝膠回收后，將經過雙酶切的 PCR產物與同樣經過雙酶切pET-21a載體用T4DNA連接酶連接。將連接產物轉化大腸桿菌 T0P10感受態細胞，涂布在含lOOii g/mL氨節青霉素的Luria-Bertani培養基固體平板上， 37°C培養14h，挑取單克隆；將單克隆接入含有100 ii g/mL氨芐西林的液體Luria-Bertani 培養基中培養，提取質粒；將質粒用正向引物NX-F和反向引物NX-R進行菌落PCR驗證，結 果得到大小正確的擴增產物，初步證明構建的重組質粒正確；接著將該重組質粒送去英濰 捷基公司測序，結果表明，在pET-21a的NedI和Xhol酶切位點之間插入SEQ ID NO 1所示 的alg2B基因，且插入方向正確，所以進一步證明構建的重組質粒正確，將該重組質粒命名 為 pET21a-Alg2B。
[0035] 將pET21a_Alg2B轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)(購自美國Novagen公司），然后按 照該公司提供的操作步驟進行褐藻膠裂解酶Alg2B誘導表達及純化。用聚丙烯酰胺凝膠電 泳檢測褐藻膠裂解酶Alg2B的純化情況，結果如圖2所示，純化后的褐藻膠裂解酶Alg2B在 電泳膠上呈單一條帶，且位置與預測的分子量相吻合。
[0036] 序列表

[0041] 實施例4褐藻膠裂解酶Alg2B的酶學性質分析
[0042] (1)褐藻膠裂解酶活力的測定
[0043] 3, 5_ 二硝基水楊酸（DNS)法測定酶活（(Qing-Da An et al. Process Biochemistry, 2008, 43:842-847)，底物為 0.5% (w/v)的褐藻酸鈉，反應時間 30min。酶活 力單位定義為：每分鐘釋放1 P mol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶活力單位 (U)。發酵液酶活力單位定義為每毫升發酵液含酶活單位（U/mL)。使用博彩蛋白質定量測 定試劑盒進行測定，以牛血清白蛋白為標準蛋白。
[0044] (1) pH 對酶 Alg2B 的影響
[0045] 將底物、重組酶液以及50mmol/L不同pH的緩沖液（pH6. 0-7. 5Na2HP04-KH2P04， pH7. 5-10Tris-HCl)按4:3:3(v/v)的比例混合后，在35°C反應30min，按標準方法測定酶 活。以最高酶活力為100%計算相對酶活。結果如圖3A所示，Alg2B的最適反應pH值為 8. 0〇
[0046] 將重組酶液分別置于50mmol/L不同pH的緩沖液（pH4. 0-5. 0乙酸-乙酸鈉， pH6. 0-8. 0Na2HP04-KH2P04, pH9-10Tris-HCl)中于 4°C 下放置 24h，然后按標準方法檢測殘 余酶活。以初始酶活為100 %計算相對酶活。結果如圖3B所示，Alg2B在pH值5~10之 間具有較好的pH值穩定性。
[0047] (2)溫度對酶Alg2B的影響
[0048] 將底物、重組酶液以及 50mmol/L Na2HP04-KH2P04 緩沖液（pH7. 5)按 4:3:3(v/v)的 比例混合后，分別在20°C、30°C、35°C、40°C、50°C、55°C、60°C下按標準方法測定酶活。以最 高酶活力為100%計算相對酶活。結果如圖4A所示，Alg2B的最適反應溫度是40°C。在最 適溫度和最適pH條件下，按標準方法測得Alg2B的比活為0. 035U/mg。
[0049] 將重組酶液分別置于不同溫度（30°C、4(TC、45°C、5(rC )下保溫lh，然后按標準 方法檢測殘余酶活。以初始酶活為100%計算相對酶活。結果如圖4B所示，Alg2B在低于 40°C的溫度下具有較好的熱穩定性。
[0050] (3)重組酶Alg2B的底物偏好性
[0051] 將重組酶分別與0. 5% (w/v)的褐藻酸鈉、polyM和polyG三種不同底物按l:4(w/ v)的比例混合，然后在30°C，pH7.0條件下反應。用熒光酶標儀記錄不同反應時間產物 在235nm的吸收值。根據紫外法測褐藻膠裂解酶的原理（Qing-Da An et al. Process Biochemistry, 2008, 43:842 - 847)，證實 Alg2B 是裂解酶。另外，如圖 5 所示，Alg2B 對聚 甘露糖醛酸片段降解速率快于對褐藻酸鈉和聚古洛糖醛酸片段的降解，表明Alg2B偏好降 解聚甘露糖醛酸片段。
[0052] 實施例5金屬離子對Alg2B活性的影響
[0053] 將底物、重組酶液以及 50mmol/L Na2HP04-KH2P04 緩沖液（pH7. 5)按 4:3:3(v/v)的 比例混合后，接著向反應體系中添加不同的金屬離子，添加的離子終濃度為5mmol/L，然后 在40°C反應30min，按標準方法檢測酶活性。以沒有加入金屬離子的酶液活性作為對照， 設為100%。結果如表1所示，一價離子K +、Na+對Alg2B的活性有微弱增強作用，二價離子 Ca2+和Mg2+表現出顯著提高酶活效果，分別提高Alg2B的活性約57%和118%。同為二價 離子的此2+、(：〇2+、2112+、(：112+、？6 2+卻抑制41828的活性，其中此2+、(：〇2+分別抑制了約43%和 64%的酶活，其余二價離子完全抑制Alg2B的活性。
[0054] 表1金屬離子對Alg2B活性的影響
[0057] a反應體系中金屬離子終濃度為5mmol/L ;
[0058] b以不添加金屬離子的酶活性定為100% ;
[0059] c沒有檢測到活性。
[0060] 實施例5酶Alg2B的降解產物分析
[0061] 取120ii L 4% (w/v)poly(M)、適量稀釋酶液混合均勻，置于30°C水浴，在10、20、 40、60、90min等時間點取樣，樣品煮沸lOmin將酶滅活，然后進行薄層層析（TLC)分析。TLC 方法：取3 y L樣品點樣于硅膠板上，將硅膠板放置在展開劑（正丁醇：甲酸：水=4:6:1，v/ v)中上行展開2次。展層結束后，在硅膠板上噴霧10%硫酸（溶于乙醇）顯色液，于110°C 烘干 5min 顯色（Kim et al.，MarineBiotechnology，2009，ll:10-16)。
[0062] 如圖6所示，在降解初期（lOmin)，TLC板上可觀察到模糊的單糖斑點，并且隨著酶 解反應的進行，單糖逐漸積累成為主要的產物。酶解20min以后寡糖產物才有明顯的積累， 但寡糖產物始終較少。根據Alg2B降解poly(M)的產物組成特點，初步推測Alg2B可能為 內切型酶。因此，Alg2B可被用于褐藻酸鈉單糖和寡糖的制備以及與褐藻酸鈉降解相關的 領域，包括農業、食品、飼料添加、醫藥及海藻遺傳工程等。
【主權項】
1. 一種內切褐藻膠裂解酶編碼基因 Alg2B，其核苷酸序列具有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 2) 編碼SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 3) 對序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列進行一個或幾個核苷酸取代、 缺失或添加而得到的編碼具有褐藻膠裂解酶活性的核苷酸序列。2. 按照權利要求1所述的內切褐藻膠裂解酶基因編碼的內切褐藻膠裂解酶，其編碼的 氨基酸序列具有如下特征之一： 1) 序列表中SEQ ID NO. 2從氨基端開始的第1-754或第28-754位氨基酸殘基序列； 2) 對序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸取代、缺失或添 加而形成的具有褐藻膠裂解酶活性的氨基酸序列。3. -種內切褐藻膠裂解酶，該酶具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，該酶對 聚甘露糖醛酸片段降解速率快于對褐藻酸鈉和聚古洛糖醛酸片段的降解速率。4. 一種制備如權利要求2所述的內切褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于：是將權利要 求1所述的內切褐藻膠裂解酶基因克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的 外切褐藻膠裂解酶； 所述的重組表達內切褐藻膠裂解酶的表達載體，是指大腸桿菌表達載體、酵母表達載 體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載 體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體。5. 按照權利要求4所述方法，其特征在于：用于重組表達內切褐藻膠裂解酶的重組菌 或轉基因細胞系，是指大腸桿菌宿主細胞（如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5a 等）、酵母菌宿主細胞（如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等）、枯草桿菌宿主細胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如 Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放線菌宿主細胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細胞（如Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞 (如Bombyx mori，Antharaea eucalypti等），哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO, 幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）中的一種。6. -種如權利要求2所述的內切褐藻膠裂解酶在褐藻酸鹽降解中的應用，其特征在 于：具有如下用途之一或二種以上； 1) 用于斷裂褐藻酸鹽或褐藻多糖的糖苷鍵，獲得褐藻酸鹽單糖和/或寡糖； 2) 用于降解紅藻、或褐藻細胞壁中的褐藻酸鹽組分，抽提原生質體； 或3)用于破壞致病菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)所形成的菌膜中褐藻 酸鈉成分。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于：所述內切褐藻膠裂解酶Alg2B與其他褐藻 膠降解酶混合后，用于協同斷裂褐藻酸鹽糖苷鍵方面的應用。
【文檔編號】C12N15/60GK105821063SQ201510004691
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月5日
【發明人】尹恒, 黃李淑馨, 曹海龍, 李曙光, 王文霞
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所