一種β-甘露聚糖酶mRmMan5A及其編碼基因與應用
【專利摘要】本發明涉及一種β?甘露聚糖酶mRmMan5A及其編碼基因與應用。本發明所述的β?甘露聚糖酶mRmMan5A，與原始β?甘露聚糖酶RmMan5A相比具有以下優點：最適pH低，為4.5，最適溫度高，為65℃。與以前所報道的β?甘露聚糖酶相比，在食品、飼料等行業中具有更大的應用價值。將該蛋白的編碼基因導入畢赤酵母中構成的工程菌發酵液的β?甘露聚糖酶的酶活力可達72626U/mL(蛋白含量為9.1mg/mL)，實現了高效表達。將該β?甘露聚糖酶用于水解汽爆處理后的棕櫚粕，水解液中主要為聚合度為2?4之間的甘露寡糖，甘露寡糖得率為19.6％，甘露聚糖轉化率約為60％。
【專利說明】
一種卜甘露聚糖酶mRmMan5A及其編碼基因與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體說是一種e-甘露聚糖酶mRmMan5及其編碼基因與 應用。
【背景技術】
[0002] 甘露聚糖是甘露糖通過0-1，4_糖苷鍵連接而成的高分子多聚糖，是半纖維素的 第二大組成部分。甘露聚糖的主鏈通常由甘露糖組成，期間還會插入一些葡萄糖殘基，如 葡甘露聚糖;此外，在一些甘露聚糖中還存在以a-1，6-糖苷鍵連接的半乳糖側鏈，如半乳甘 露聚糖和半乳葡甘露聚糖（Malgas et al. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2015，31:1167-1175)。由于甘露聚糖結構復雜，其完全降解需要多種酶的 協同作用，如甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、0_甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、0_葡萄糖苷酶 (已〇3.2.1.21)、€[-半乳糖苷酶（￡03.2.1.23)和甘露聚糖乙酰酯酶（￡03.1.1.6)等 (Moreira et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2008,79:165-178)。0_甘露 聚糖酶可以隨機水解甘露聚糖主鏈中0-l，4-糖苷鍵，產生低分子量的甘露寡糖，是甘露聚 糖降解酶系中最重要的糖苷水解酶。因此近年來甘露聚糖酶被廣泛應用于食品、飼料、燃 料乙醇等行業中（Chauhan et al .Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93: 1817-1830)。
[0003] 甘露聚糖酶主要來自糖苷水解酶5、9、26、44、113和134家族，其在細菌、真菌以 及高等植物中均有發現(Dhawan et al. Critical Reviews in Biotechnology ,2007,27: 197-216)。細菌來源的甘露聚糖酶主要是中性偏堿性的甘露聚糖酶，而真菌來源的甘 露聚糖酶一般呈酸性（van Zyl et al ? Process Biochemistry，2010,45:1203-1213)。目前 已經有許多甘露聚糖酶被克隆表達，但這些甘露聚糖酶的酶學性質往往存在一定缺陷， 如:最適pH不合適、溫度穩定性差、表達量低等，限制了甘露聚糖酶在實際生產中的應用。 在大部分食品及飼料加工應用中，甘露聚糖酶主要在酸性環境下使用，因此，對甘露聚 糖酶進行定向進化，開發在酸性條件下更加穩定的甘露聚糖酶對于其在食品、飼料等工 業中應用具有重要意義。
[0004] 定向進化技術通常不依賴于目的蛋白詳細的結構信息，已經廣泛地應用于改善酶 的酶學性質，如：最適催化條件、穩定性、催化活性等（Wang et al . Bioresource Technology，2012，115:117-125)。易錯PCR和DNA改組技術是定向進化技術中最主要的兩種 技術手段。易錯PCR是指在體外擴增目的基因時以一定的頻率在基因內部引入點突變，由于 突變只發生在單一分子內部，屬于無性進化。而DNA改組技術則是利用重疊延伸PCR技術，將 已獲得的存在于不同基因中的多突變信息隨機重組到同一個DNA分子，形成新的基因隨機 突變庫，屬于有性進化。目前，已有一些甘露聚糖酶通過定向進化技術優化了酶學性質， 使其更加適合于工業應用，如來源于成團泛菌(Wang et al. Journal of Biotechnology, 2013,167:350-356)和柄孢霉（Couturier et al.PLoS one,2013,8:e7980011)的甘露聚 糖酶。
[0005] 甘露寡糖是指由2-10個單糖通過糖苷鍵連接而成的寡糖，具有穩定、低熱量、不引 發齲齒、降血糖等特點，是新一代功能性食品，受到國內外研究者的關注。此外，甘露寡糖還 可以有效促進生物體內以雙歧桿菌為代表的腸道有益菌群的增殖，抑制病原菌的生長，具 有改善腸道內菌群結構、減少有毒代謝產物產生、防止便秘、保護肝臟等多種生理功能。目 前，利用酶法制備低聚甘露糖的底物主要為富含甘露聚糖的植物膠類。其中，以魔芋粉與瓜 爾豆膠為原料制備甘露寡糖最為廣泛(Zang et al .Enzyme and Microbial Technology, 2015,78:1-9;Kurakake et al.Journal of Agriculture and Food Chemistry,2006,54: 7885-7889)。中國專利申請號200810237785.9、200910014349.X、201310428885.0、 201510175978.6和201510465107.8中公開的生產甘露寡糖所用的原料均為槐豆膠、魔芋 粉、瓜爾豆膠等植物膠類。此外，一些富含甘露聚糖的農業廢棄物，如:椰子柏、咖啡渣、棕櫚 柏等，也是制備甘露寡糖的良好底物，但是有關報道相對較少(Chiyanzu et al.Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,172:3538-3557；Ghosh et al.Molecular Biotechnology,2015,57:111-127)〇

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種甘露聚糖酶mRmMan5A及其編碼基因與應用，該甘 露聚糖酶mRmMan5A與原始甘露聚糖酶RmMan5A相比具有以下優點：最適pH低，最適溫度 高，在食品、飼料等行業中具有更大的應用價值。
[0007] 本發明所提供的蛋白mRmMan5A，是對來自米黑根毛霉（Rhizomucor miehei) CAU432(-株能夠分泌多種糖苷水解酶的嗜熱絲狀真菌，其分泌的甘露聚糖酶具有多種 優良的酶學性質（Katrolia et al.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013，61:394-401))的甘露聚糖酶基因（RmMan5A，Genbank AGC24277.1)進行體外分子隨 機突變和重組得到的，具有甘露聚糖酶功能，為如下（1)或(2)或(3)或(4)的蛋白質：
[0008] (1)序列表序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0009] (2)序列表序列3自氨基末端第20至378位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0010] (3)在所述(2)的氨基末端添加 Poly-His標簽的蛋白質；具體為在所述(2)的氨基 末端添加 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS 組成的蛋白質。
[0011] (4)將所述（1)或(2)或(3)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加所獲得的具有相同功能的由（1)或(2)或(3)衍生的蛋白質。
[0012] 為了使（1)或(2)或(3)或(4)中的蛋白質便于純化，可在所述蛋白質的氨基末端或 羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0013] 表1標簽的序列
[0015] 上述蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述蛋白 質的編碼基因可通過將序列表序列4所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼 子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標 簽的編碼序列得到。
[0016] 本發明保護上述蛋白質的編碼基因。
[0017]所述編碼基因為以下(a)或(b)或(c)或(d)的DNA分子：
[0018] (a)序列表序列4所示的DNA分子；
[0019] (b)序列表序列4的第58至1137位所示的DNA分子；
[0020] (c)在嚴格條件下與（a)或（b)所限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分 子；
[0021] (d)與(a)或(b)或(c)限定的DNA分子具有至少75%的序列同一性且編碼所述蛋白 質的DNA分子。
[0022] 上述嚴格條件可為在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0 ? 1 % SDS和 1 X SSC，0 ? 1 % SDS各洗膜一次。
[0023] 本發明保護含有以上任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重 組菌。
[0024] 本發明保護擴增以上任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。
[0025] 本發明保護上述蛋白質在水解具有0-1，4糖苷鍵連接的甘露聚糖中的應用，或上 述蛋白質在作為甘露聚糖酶中的應用。
[0026] 所述具有0-1，4糖苷鍵連接的甘露聚糖具體可為槐豆膠。
[0027] 在上述應用中，所述水解的pH值可為3-8.5;具體可為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、 6.5、7、7.5、8、8.5;或上述任兩個所述點值間的范圍值如3-8;或3.5-7.5;或4一7;或4一 6.5;或4-4.5;或4.5-5 內的pH 值；
[0028] 和/或，所述水解的溫度為30-85 °C ;具體可為30°C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、 60°C、65°C、70°C、75°C、80°C ;或上述任兩個所述點值間的范圍值如30-65°C ;或65-80°C ; 或45-75°C ;或55-65°C ;或65-70°C ;或30-60°C ;或30-50°C 內的溫度。
[0029] 在上述應用中，所述應用具體可為在制備甘露寡糖中的應用。
[0030] 在上述應用中，所述制備甘露寡糖為以棕櫚柏為原料進行。
[0031] 本發明保護上述蛋白質、編碼基因及重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在 制備甘露聚糖酶中的應用。
[0032] 所述在制備甘露聚糖酶中的應用具體可為一種制備甘露聚糖酶的方法，包括 如下步驟:發酵培養所述重組菌，得到甘露聚糖酶;所述重組菌具體可為含有所述重組載 體的巴斯德畢赤酵母GS115，具體可為重組菌乙。
[0033] 本發明所述的甘露聚糖酶mRmMan5A，與原始甘露聚糖酶RmMan5A相比具有以 下優點：最適pH低，最適溫度高。與以前所報道的甘露聚糖酶相比，在食品、飼料等行業中 具有更大的應用價值。該酸性甘露聚糖酶mRmMan5A的最適pH為4.5，最適溫度為65°C。將 該蛋白的編碼基因導入畢赤酵母中構成的工程菌（即重組菌乙）在5L發酵罐中高密度發酵， 發酵液的甘露聚糖酶的酶活力可達72626U/mL(蛋白含量為9. lmg/mL)，實現了高效表達。 將該甘露聚糖酶用于水解汽爆處理后的棕櫚柏，水解液(即上清液）中主要為聚合度為2- 4之間的甘露寡糖，甘露寡糖得率為19.6 %，甘露聚糖轉化率約為60 %。本發明為甘露聚 糖酶的蛋白質工程改造提供了重要方法，也為酸性甘露聚糖酶在甘露寡糖制備中的應用 提供了重要依據。
【附圖說明】
[0034] 圖1為重組蛋白mRmMan5A的純化電泳圖。
[0035] 圖2為重組蛋白mRmMan5A和RmMan5A作為甘露聚糖酶的最適pH測定曲線圖。
[0036] 圖3為重組蛋白mRmMan5A和RmMan5A作為甘露聚糖酶的pH穩定性測定曲線圖。
[0037] 圖4為重組蛋白mRmMan5A和RmMan5A作為甘露聚糖酶的最適溫度測定曲線圖。
[0038] 圖5為重組蛋白mRmMan5A和RmMan5A作為甘露聚糖酶的溫度穩定性測定曲線圖。
[0039] 圖6為畢赤酵母高密度發酵分泌甘露聚糖酶mRmMan5A歷程。
[0040] 圖7為重組蛋白mRmMan5A水解汽爆棕櫚柏過程中甘露寡糖各組分含量。
【具體實施方式】
[0041 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0042]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0043]下述實施例中甘露聚糖酶酶活測定方法如下：
[0044] 取0. lmL適當稀釋的酶液，加入到0.9mL 0.5% (質量體積比）的槐豆膠底物溶液中 (用50M，pH 4.5的檸檬酸磷酸緩沖液配制），65°C水浴反應lOmin，采用3，5-二硝基水楊酸 (DNS)法測定所釋放的還原糖量，以甘露糖作為標準。
[0045] 甘露聚糖酶的活力單位定義為:在上述反應條件下，每分鐘反應生成lwnol的還 原糖（以甘露糖計)所需要的酶量為一個酶活力單位(1U)。
[0046] 比酶活定義為lmg蛋白所具有的酶活力單位，表示為U/mg。
[0047] 1個甘露聚糖酶酶活單位的定義:在pH 4.5、65°C條件下，每分鐘分解0.5%槐豆 膠底物釋放1_〇1的甘露糖所需要的酶量，酶活計算公式為:!1=&\11/(1\￥)，其中，11代表 酶活力(U/mL)，Cx代表生成甘露糖物質的量(wnol)，n代表酶液的稀釋倍數，T代表反應時間 (min)，V代表加入稀釋后的酶液體積(mL)。
[0048] 實施例1、0_甘露聚糖酶基因的定向進化
[0049] -、甘露聚糖酶基因(RmMan5A)的隨機突變
[0050] 1、易錯PCR
[0051] 對米黑根毛霉甘露聚糖酶的野生型基因（如序列表的序列2所示)進行序列分 析，發現該基因5'端包含編碼19個氨基酸殘基組成的信號肽的序列。根據米黑根毛霉甘 露聚糖酶的成熟蛋白編碼區（即去掉信號肽編碼序列）設計易錯PCR引物RmMan5AF和 RmMan5AR。引物序列如下：
[0052] RmMan5AF: 5 ' -CGCGGATCCGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG-3 下劃線所示的序列為 Bamm酶切識別位點；下劃線后的序列與序列表序列2或4的第58至80位序列相同；
[0053] RmMan5AR: 5 ' -CCGCTCGAGTCACTTCTTGGCCATGGCATCAGC-3 ' ；下劃線所示序列為Xhol 酶切識別位點；下劃線后的序列與序列表序列2或4的第1137至1114位序列相匹配。
[0054] 以米黑根毛霉CAU432cDNA為模板，用RmMan5AF和RmMan5AR組成的引物對進行易錯 PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0055] 易錯？〇?體系（50此）：7臟〇1/1]\%2+，0.2111111〇1/1]\1112+，0.2111111〇1/1(^丁？，0.2111111〇1/1 dGTP，lmmol/L dCTP，lmmol/L dTTP，0.2iimol/LRmMan5AF，0.2iimol/L RmMan5AR，2.5U Taq DNA聚合酶，20ng cDNA。
[0056] 易錯PCR反應條件：95°C預變性5min，95°C變性3〇8,55°(：復性3〇8,72°(：延伸 1.5min，30 個循環，72°C 總延伸 5min。
[0057] 2、DNA 片段化
[0058] 用DNase I對步驟1的PCR擴增產物進行酶切處理。
[0059]酶切體系（100yL):8mmol/L Mg2+，0.67mmol/L Mn2+，8yg PCR擴增產物，0.0252U DNase I〇
[0060] 酶切條件：20°C反應15min，加入2.5mmol/L EDTA終止反應，90°C保溫lOmin滅活 DNase I〇
[0061 ] 回收純化40-60bp左右的DNA片段。
[0062] 3、獲得隨機突變體庫
[0063] (1)重疊延伸PCR
[0064]將步驟2的DNA片段作為模板，進行重疊延伸PCR，得到重疊延伸PCR產物。
[0065] 重疊延伸PCR體系（50yL):0.2mmol/L dNTP，1.5mmol/L MgS〇4,8yL(約2yg)模板， 1U Pfu DNA聚合酶。
[0066] 重疊延伸PCR條件：95°C預變性5min，95°C變性30s，45°C復性30s，72°C延伸2min， 10個循環，72°C總延伸5min。
[0067] (2)全長 PCR
[0068] 以步驟（1)的重疊延伸PCR擴增產物為模板，用RmMan5AF和RmMan5AR組成的引物對 進行全長PCR，得到PCR擴增產物(隨機突變體庫）。
[0069] 全長PCR體系（50yL) :0.2mmol/L dNTP，1.5mmol/L MgS〇4,0.2_ol/L RmMan5AF， 0.2wnol/L RmMan5AR，lyL(50-100ng)模板，1U Pfu DNA聚合酶。
[0070] 全長 PCR 條件:95°C 預變性 5min，95°C 變性 3〇8,55°(：復性3〇8,72°(：延伸1.5111111，30 個循環，72°C總延伸5min。
[0071] 4、獲得突變體表達文庫
[0072] (1)用限制性內切酶BamHI和Xhol雙酶切步驟3的隨機突變體庫，回收酶切產物。
[0073] (2)用限制性內切酶BamHI和Xho I雙酶切pET_28a (+)載體，回收酶切產物中的載體 骨架。
[0074] (3)將步驟（1)的酶切產物和步驟(2)的載體骨架連接，利用電轉化法將連接產物 轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，收集所有轉化子，即為突變體表達文庫。隨機挑選10個轉化子進 行測序分析，突變率約為〇. 72 %。
[0075]二、突變體表達文庫定向篩選
[0076] 1、將步驟一的突變體表達文庫適當稀釋后均勻涂布于LB平板(含50iig/mL卡那霉 素），37°C培養 24h。
[0077] 2、收集步驟1平板上的菌落，編號，轉移至篩選平板(含有0.5%槐豆膠、lmmol/L異 丙基硫代-0-D-半乳糖苷（IPTG)和50yg/mL卡那霉素的LB平板），37°C培養1天。
[0078] 3、將步驟2中的篩選平板于60 °C放置lh，使菌體裂解，然后用0.1 %剛果紅溶液染 色15min后，用lmol/L NaCl溶液脫色;通過透明圈對應菌落相應編號，從原平板上挑取相應 菌落，進行步驟4復篩。
[0079] 4、將步驟3得到的菌株進行酶學性質鑒定，具體方法如下：
[0080] 將采用相同培養條件得到的各菌株的發酵液于lOOOOXg離心5min，菌體用蒸餾水 重懸，超聲破壁后l〇〇〇〇Xg離心10min取上清液(粗酶液）。在測定溫度為55°C條件下，分別 用不同pH的檸檬酸磷酸緩沖液測定粗酶液酶活力。在測定pH值為7.0的條件下，分別在不同 溫度下測定粗酶液酶活力。
[0081] 在pH小于7.0和溫度高于55°C的條件下，如果突變菌株的粗酶液甘露聚糖酶酶 活力高于對照菌(該對照菌是將序列表的序列2自5'末端第58至1137位核苷酸所示的DNA片 段插入pET-28a( + )載體的BamHI和Xho頂每切位點間得到的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)得到的重組菌)的粗酶液，則該菌株即為正突變子。經復篩，得到1個正突變子。
[0082] 5、將正突變子提取質粒進行測序，質粒中插入的DNA片段序列與RmMan5A基因（序 列表序列2第1至1137位)對比，有5個核苷酸發生突變，分別為T-C(序列表的序列2自5'末 端第754位核苷酸）、T-C(序列表的序列2自5'末端第840位核苷酸）、A-T(序列表的序列2 自5'末端第848位核苷酸）、A-G(序列表的序列2自5'末端第1011位核苷酸）、A-G(序列表 的序列2自5'末端第1085位核苷酸），即序列表的序列2所示的RmMan5A基因突變為序列表的 序列4所不的DNA，將其命名為mRmMan5A基因；以上核昔酸突變引起了序列表的序列1所不蛋 白質的三個氨基酸殘基發生突變，分別為Y-H(序列表的序列1自N末端第252位氨基酸殘 基）、K-M(序列表的序列1自N末端第283位氨基酸殘基）、N-S(序列表的序列1自N末端第 362位氨基酸殘基），即序列表的序列1所示的RmMan5A蛋白質突變為序列表的序列3所示的 蛋白質，將序列表的序列3所示的蛋白質命名為mRmMan5A蛋白質。該正突變子即將重組載體 甲（即在質粒pET-28a( + )的BamHI和Xhol酶切位點之間插入了序列表的序列4自5 '末端第58 至1137位核苷酸序列所示的DNA片段)轉化至大腸桿菌BL21(DE3)得到的重組菌甲。
[0083]實施例2、0_甘露聚糖酶的制備及其酶學性質測定 [0084] 一、重組蛋白制備
[0085] 1、重組蛋白的誘導表達
[0086]將重組菌甲或對照菌接種至液體LB培養基(含有50yg/mL卡那霉素)振蕩培養(37 °C，200rpm)，至0D_達到0 ? 6-0 ? 8之間，加入IPTG至終濃度lmmol/L，30°C誘導培養過夜， 10000 X g收集菌體，重懸后超聲破碎，10000 X g離心10min，收集上清液即為粗酶液。
[0087] 2、重組蛋白的純化
[0088] 使用瓊脂糖Ni-IDA親和柱純化重組蛋白。具體步驟如下：
[0089]用緩沖液A平衡Ni-IDA親和柱5-10個柱體積，將步驟1得到的重組菌甲或對照菌的 粗酶液以0.5mL/min流速上樣，分別用緩沖液A和緩沖液B以lmL/min流速洗脫至0D28Q〈0.05， 最后以緩沖液C洗脫并收集目的蛋白質，得到純化產物。
[0090] 其中，緩沖液A為含有NaCl(300mmol/L)和咪唑（20mmol/L)的磷酸緩沖液（pH 8.0)；
[0091] 緩沖液B為含有NaCl(300mmol/L)和咪唑(50mmol/L)的磷酸緩沖液(pH 8.0);
[0092] 緩沖液C為含有NaCl(300mmol/L)和咪唑(200mmol/L)的磷酸緩沖液(pH 8.0)。
[0093]重組菌甲的粗酶液得到的純化產物為重組蛋白mRmMan5A(其氨基酸序列為在序列 表序列3中第2 0至3 7 8位所示氨基酸序列的氨基末端添加了 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS)，對照菌的粗酶液得到的純化產物為重組蛋白 RmMan5A(其氨基酸序列為在序列表序列1中第20至378位所示氨基酸序列的氨基末端添加 TMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS)。
[0094] 重組菌甲的粗酶液及其得到的純化產物（重組蛋白mRmMan5A)的SDS-PAGE純化圖 如圖1所示。
[0095] 圖1中，泳道M為分子量標準，1為重組菌甲的粗酶液，2為重組菌甲的粗酶液的純化 產物即重組蛋白mRmMan5A。圖1的結果表明，重組蛋白mRmMan5A的大小為44kDa，與預期大小 一致。
[0096] 二、重組蛋白mRmMan5A作為甘露聚糖酶的酶學性質
[0097] 1、最適pH的測定
[0098] 將實施例2步驟一制備的重組蛋白RmMan5A的水溶液和mRmMan5A的水溶液作為待 測酶液，將其分別在不同pH的緩沖液條件下進行酶活測定。各種緩沖液具體如下：
[0099] 1)檸檬酸磷酸緩沖液(pH 3.0-7.0);
[0100] 2)醋酸緩沖液(pH 4.0-6.0);
[0101] 3)磷酸緩沖液(pH 6.0-8.0);
[0102] 4)Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)緩沖液(pH 7.0-9.0);
[0103] 5)CHES(1-環己氨基乙磺酸)緩沖液(pH 8.0-10.0);
[0104] 6)甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.5-11.0)。
[0105] 測定RmMan5A酶活力時反應溫度為55°C，測定mRmMan5A酶活力時反應溫度為65°C。 在不同緩沖液存在重疊pH的情況下，選擇酶活力較高的結果作為該pH下的結果。將RmMan5A 在最適pH下的酶活力作為100%，計算其他pH下RmMan5A的相對酶活（％);將mRmMan5A在最 適pH下的酶活力作為100%，計算其他pH下mRmMan5A的相對酶活（％ )，結果如圖2所示。 [0106] 圖2中：方形點代表RmMan5A的結果，RmMan5A在55°C條件下的最適pH為7.0;圓形點 代表mRmMan5A的結果，mRmMan5A在65 °C的最適pH為4.5。
[0107] 2、pH穩定性測定
[0108] 將實施例2步驟一制備的重組蛋白RmMan5A的水溶液和mRmMan5A的水溶液分別用 步驟1中的緩沖液進行稀釋，置于50°C水浴鍋中處理30min，將其迅速置于冰水中冷卻 3 0m i n，然后測定酶活力。以未經上述5 0 °C保溫處理的RmMan 5 A和mRmMan 5 A的酶活力分別作 為100%，計算經過不同pH處理后RmMan 5 A和mRmMan 5 A的相對酶活。
[0109] 測定RmMan5A酶活力的條件為:50mmo 1/L檸檬酸磷酸緩沖液(pH 7.0)反應溫度55 r。
[0110] 測定1^禮&1^酶活力的條件為:5〇111111〇1/1檸檬酸磷酸緩沖液化114.5)反應溫度65 r。
[0111] 結果如圖3所示：方形點代表RmMan5A的結果，圓形點代表mRmMan5A的結果， RmMan5A和mRmMan5A在酸性環境下pH穩定性基本一致，在堿性換環境下RmMan5A的穩定性好 于mRmMan5A〇
[0112] 3、最適溫度的測定
[0113] 將實施例2步驟一制備的重組蛋白RmMan5A和mRmMan5A用各自最適pH緩沖液適當 稀釋后，分別在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90°〇測定各自酶活 力。以RmMan5A和mRmMan5A在各自最適溫度下的酶活力為100%，計算其他溫度下RmMan5A和 mRmMan5A的相對酶活（％ )。
[0114] 結果如圖4所示：方形點代表RmMan5A的結果，圓形點代表mRmMan5A的結果， RmMan5A的最適溫度為55°C，mRmMan5A的最適溫度為65°C。
[0115] 4、溫度穩定性的測定
[0116] 將實施例2步驟一制備的重組蛋白RmMan5A的水溶液和mRmMan5A的水溶液用各自 最適pH緩沖液適當稀釋后，分別在不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 °C)保溫30min，將其迅速置于冰水中冷卻30min，然后測定酶活力。以未經上述不同溫度保 溫處理的RmMan5A和mRmMan5A的酶活力分別作為100%，計算經過不同溫度保溫處理后 RmMan5A和mRmMan5A的相對酶活（％ )。測定RmMan5A酶活力的條件為:50mmol/L梓檬酸磷酸 緩沖液(pH 7.0)反應溫度55°C。測定mRmMan5A酶活力的條件為:50mmol/L檸檬酸磷酸緩沖 液(pH 4.5)反應溫度65°C。
[0117] 結果如圖5所示：方形點代表RmMan5A的結果，圓形點代表mRmMan5A的結果， RmMan5A和mRmMan5A的溫度穩定性基本一致，在55 °C以下保持穩定。
[0118] 實施例3、畢赤酵母高密度發酵表達重組蛋白mRmMan5A
[0119] -、重組菌的獲得
[0120] 1、以實施例1獲得的正突變子所提取質粒（含mRmMan5A基因）為模板，采用 mRmMan5AF和mRmMan5AR引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。引物序列如下：
[0121] mRmMan5AF：5, -CCATGTACGTAGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG-3 下劃線所示的序列為 SnaB頂每切識別位點；下劃線后的序列與序列表序列2或4的第58至80位序列相同；
[0122] mRmMan5AR: 5 ' -CCGCCTAGGTCACTTCTTGGCCATGGCATC-3 下劃線所示的序列為 Avrn酶切識別位點；下劃線后序列與序列表序列2或4的第1117至1137位序列相匹配。
[0123] 2、用限制性內切酶SnaBI和AvrII對步驟1得到的PCR擴增產物進行雙酶切，回收酶 切后的DNA片段；用限制性內切酶SnaBI和AvrII對pPIC9K載體進行雙酶切，回收酶切后的骨 架載體;將DNA片段與骨架載體連接，得到重組載體乙（即在pPIC9K載體的SnaBI和AvrII酶 切位點之間插入了序列表的序列4自5'末端第58至1137位核苷酸所示的DNA片段）。
[0124] 3、將重組載體乙轉化巴斯德畢赤酵母GS115,得到含有重組載體乙的重組菌乙。
[0125] 二、重組菌乙的發酵
[0126] 1、發酵方法
[0127] 發酵方法參照文獻"Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B， 053002，Invitrogen)"中的方法。發酵米用5L發酵罐。種子培養基、發酵基本培養基、甘油分 批補料培養基和100%甲醇誘導培養基參照上述文獻中的方法配制。整個發酵過程采用分 批培養、甘油分批補料培養、100%甲醇誘導培養三個階段。
[0128] 2、發酵結果
[0129] 檢測發酵過程中上清液(含重組蛋白mRmMan5A，其氨基酸序列為在序列表序列3中 第20至378位所示氨基酸序列）中甘露聚糖酶的酶活力。酶活力測定條件:50mmol/L檸檬 酸磷酸緩沖液(pH 4.5)，反應溫度65°C。
[0130] 發酵過程中，重組菌乙生長及分泌甘露聚糖酶歷程如圖6所示。圖6中，三角形點 代表菌體濕重(g/L);方形點代表發酵液酶活力(U/mL);圓形點代表發酵液蛋白濃度(mg/ mL) 〇
[0131] 結果表明，經過168h發酵，重組菌乙的發酵上清液中甘露聚糖酶的酶活力達到 72626U/mL，發酵液蛋白含量達到9. lmg/mL，菌體濕重達465g/L。
[0132] 實施例4、重組蛋白mRmMan5A作為甘露聚糖酶在制備甘露寡糖中的應用
[0133] 1、將棕櫚柏于40°C干燥24h，取500g干燥后的棕櫚柏與一定量蒸餾水混合至終含 水率為50 %，靜置過夜后，進行汽爆處理，汽爆條件：1.5MPa，保溫7.5min。
[0134] 2、取汽爆后的棕櫚柏，按照料水比1:5調漿，調節pH至4.5,每克棕櫚柏加入實施例 2步驟一或實施例3步驟二中制備的重組蛋白mRmMan5A 200U(即200個甘露聚糖酶酶活單 位），50°C下水解0-24h，加熱至100°C滅酶lOmin。取2mL酶解液，10000 X g離心5min，取上清 液。
[0135] 3、在水解0、1、2、4、6、8、12、24h時，分別用高效液相色譜法(HPLC)檢測上清液中甘 露寡糖組分及含量。色譜條件：色譜柱為Sugar-D，柱溫35°C，流動相為75%乙腈，流速為 lml/min，示差檢測器。
[0136] 實施例2步驟一制備的重組蛋白mRmMan5A在不同水解時間上清液中甘露寡糖含量 如圖7所示。結果表明：上清液中主要為聚合度2-4之間的甘露寡糖。最終，甘露寡糖得率為 19.6 %，其中，甘露糖得率0.3 %，甘露二糖得率9.6 %，甘露三糖得率為8.6 %，甘露四糖得 率為1.2% (圖7未示出）。棕櫚柏中甘露聚糖制備甘露寡糖轉化率約為60%。
[0137] 實施例3步驟二制備的重組蛋白mRmMan5A在不同水解時間上清液中甘露寡糖含量 結果與圖7所示結果相同。
[0138] 本說明書中未作詳細描述的內容屬于本領域專業技術人員公知的現有技術。
【主權項】
1. 一種蛋白質，是以下（1)或(2)或(3)或(4)的蛋白質： (1) 序列表序列3所不的氣基酸序列組成的蛋白質； (2) 序列表序列3自氨基末端第20至378位所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (3) 在所述(2)的氨基末端添加 Po ly-Hi s標簽的蛋白質； (4) 將所述（1)或(2)或(3)的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加所獲得的具有相同功能的由（1)或(2)或(3)衍生的蛋白質。2. 權利要求1所述蛋白質的編碼基因。3. 如權利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為以下(a)或(b)或(c)或 (d)的DNA分子： (a) 序列表序列4所示的DNA分子； (b) 序列表序列4的第58至1137位所示的DNA分子； (c) 在嚴格條件下與（a)或(b)所限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白質的 DNA分子； (d) 與（a)或(b)或（c)限定的DNA分子具有至少75%的序列同一性且編碼權利要求1所 述蛋白質的DNA分子。4. 含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5. 擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。6. 權利要求1所述蛋白質在水解具有β_1，4糖苷鍵連接的甘露聚糖中的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于:所述水解的pH值為3-8.5; 和/或，所述水解的溫度為30-85 °C。8. 如權利要求6或7所述的應用，其特征在于:所述應用為在制備甘露寡糖中的應用。9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于:所述制備甘露寡糖為以棕櫚柏為原料進行。10. 權利要求1所述蛋白質、權利要求2或3所述編碼基因及權利要求4所述重組載體、表 達盒、轉基因細胞系或重組菌在制備甘露聚糖酶中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105821020SQ201610324502
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】江正強, 李延嘯, 閆巧娟, 徐夢宇, 易萍, 劉學強
【申請人】中國農業大學