嗜熱共生桿菌meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了五種輔酶偏好性翻轉后的<i>meso</i>-二氨基庚二酸脫氫酶突變體。所用模板酶為來源于嗜熱共生桿菌（<i>Symbiobacterium thermophilum</i>）的NADP（H）依賴型<i>meso</i>-二氨基庚二酸脫氫酶(StDapdh)，酶突變后其特征在于：將同源性比較相當于模板酶的35位的氨基酸殘基替換為谷氨酸，即R35E；將同源性比較相當于母本酶的35位、36位的氨基酸殘基分別替換為谷氨酸及纈氨酸即R35E/R36V；將同源性比較相當于母本酶的35位、36位的氨基酸殘基分別替換為天冬氨酸及纈氨酸即R35D/R36V；將同源性比較相當于母本酶的35位、36位的氨基酸殘基分別替換為天冬氨酸及谷氨酰胺即R35D/R36Q；將同源性比較相當于StDapdh的35位、36位、76位的氨基酸殘基分別替換為谷氨酸、纈氨酸、纈氨酸即R35E/R36V/Y76V；這些突變體酶，輔酶偏好性均由NADP（H）突變為NAD(H)。
【專利說明】
嗜熱共生桿菌二氨基庚二酸脫氫酶突變體
技術領域
[0001] 本發明屬于蛋白質工程領域，涉及一種對生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶 的輔酶偏好性改造，并獲得使二氨基庚二酸脫氫酶的輔酶偏好性從NADP (H)變為 NAD (H)的突變體。
【背景技術】
[0002] D-氨基酸是一種非天然氨基酸，也是重要的手性中間體，在食品、化妝品和制藥 工業廣泛應用（王穎，李云政，iT尹眾了2003，」以58-60.)。已知的D-氨基酸脫氫酶 多為膜蛋白（Tanigawa M.，Shinohara T.，et aJ, Jciofe 2010，激，247-255; Xu S. J. , Ju J. S. , Ma Y. H. , Wei Sheng Wu Xue Bao 2007, 47, 634-638; Jones H., Venables ff. A., Biochimie\99>?>, 65, 177-183; Jones H. , Venables ff. A., FEES Lett. 1983, 151, 189-192; Wild J. , Obrepalska B. , Mol. Gen. Gent. 1982, 186, 405-410; Wild J. , Klopotowski T. , Mol. Gen. Gent 1981, 181, 373-378; Olsiewski P. J.，Kaczorowski G. J.，Walsh C.，J；1980，之55； 4487-4494.)，不 能被用于工業生產，僅有二氨基庚二酸脫氫酶（DAPDH) (EC 1. 4. 1. 16)及其突變體 可用來進行 D-氨基酸的生物合成（Misono H.，Soda K.，JoyraaJ CAev??. 1980， 255, 10599-10605; Vedha-Peters K. , Gunawardana M. , Rozzell J. D. , Novick S. J., J. Am. n Chem. Soc. 2006, 128, 10923-10929; Akita H. , Doi K. , Kawarabayasi Y., Ohshima T. , Biotechnol. Lett. 2012, 34, 1693-1699; Akita H. , Suzuki H., Doi K., OhshimaT., ificraAioZ 價okcA 2013，你,1135-1143.)。在輔酶偏好性方面， 已知的DAPDH酶及突變體的輔酶偏好性均為NADP (H)，到目前為止也沒有DAPDH家族酶輔 酶偏好性改造的研究報道。相比與輔酶NADP (H)，輔酶NAD (H)有更好的穩定性，更低廉的 價格及更廣的輔酶循環方法，NAD(H)依賴型氨基酸脫氫酶可使用甲酸脫氫酶（FDH)以及甲 酸氨作為輔酶循環體系，而NADP(H)依賴型氨基酸脫氫酶則主要使用葡萄糖脫氫酶（GDH) 以及葡萄糖作為輔酶循環體系。氨基酸脫氫酶需要堿性pH條件進行催化反應，GDH循環體 系中使用葡萄糖作為底物，循環生成的葡萄糖酸會降低體系的pH值，影響反應的進程，且 不易除去，還需另外添加反應所需的銨鹽，這些額外成分將增加后續分離工藝難度；FDH循 環體系可以使用甲酸氨作為共底物，其中氨直接參與合成，而甲酸被氧化成易揮發除去的 C0 2，反應液中沒有額外雜質，將極大簡化后續產物的分離純化過程，在使用氨基酸脫氫酶 合成氨基酸的過程中，使用NAD(H)作輔酶以及FDH做循環系統將更有應用優勢。因此，獲 得NAD(H)依賴型的D-氨基酸脫氫酶是非常重要的。
[0003] 我們從嗜熱共生桿菌中獲得了能夠還原氨化 合成 D-丙氨酸的氨基酸脫氫酶 StDapdh (Gao X.，Chen X.，Liu W.，Feng J.，Wu Q.， HuaL.，ZhuD.，々爐丄辦Kiiw?. ificraAioZ 2012，7戌 8595-8600)，該酶可以被直接 用來進行D-氨基酸的合成(專利申請號：201210334554. 6)，在獲得X-射線晶體結構（Liu ff. , Li Z. , Huang C. H. , Guo R. T. , Zhao L. , Zhang D. , Chen X. , Wu Q. , Zhu D., 75； 217-222)、通過改造擴增其底物譜至亮氨酸以及苯丙氨酸（Gao X., Huang F., Feng J., Chen X., Zhang H., Wang Z. , ffu Q., Zhu D. , Appl. Environ. 2013)以及更大位阻的氨基酸如叔亮氨酸(專利申請號：201310459718. 2)等工 作的基礎上，獲得了輔酶偏好性為NAD (H)依賴型的突變子，將能進一步增加該酶實際應用 的可行性。
【發明內容】
[0004] 本發明是對生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶的輔酶偏好性改造，并獲得使 二氨基庚二酸脫氫酶的輔酶偏好性從NADP(H)變為NAD(H)的突變體。
[0005] 本發明中所用生物催化劑，StDapdh突變體的獲取步驟如下： 1?以pET32_StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引 入R35E單位點突變； 2?以pET32_StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引 入R35E/R36V兩位點組合突變； 3?以pET32_StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引 入R3OT/R36V兩位點組合突變； 4?以pET32_StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引 入R3OT/R36Q兩位點組合突變； 5?以pET32_StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引 入R3OT/R36Q/Y76V三位點組合突變； 6. 對所構建的工程菌進行培養、誘導表達，突變體蛋白大多以可溶性形式存在于胞 內； 7. 通過Ni-NTA將該突變體蛋白純化。
[0006] 本發明具有如下優點： 本發明方法以NADP(H)依賴型氨基酸脫氫酶StDapdh出發，獲得了其輔酶偏好性翻轉 為NAD (H)依賴型的突變子酶。
[0007]
【附圖說明】： 附圖1 :相應StDapdh突變子蛋白純化SDS-PAGE電泳圖譜。圖中，泳道M :蛋白質分 子量Marker,泳道1為野生型酶，泳道2-6為純化后五個的突變子酶：R35E，R35E/R36V， R3OT/R36V，R3OT/R36Q，R35E/R36V/Y76V。
[0008]
【具體實施方式】
[0009] 以下通過具體的實施例來進一步說明本
【發明內容】
，但是這些實施例不構成對本發 明的限制。下列實例中所用材料除特別說明外，所用化學藥品、試劑均購自Sigma公司。DNA 和蛋白質Marker均購自Fermentas公司，蛋白純化Ni-NTA填料購自GE。Quick Change Mutagenesis Kit購自Agilent公司，突變引物按照試劑盒要求進行設計。引物合成、DNA 序列測定均由金維治公司（北京）進行，PET32質粒載體，T0P10、BL21 (DE3)高效感受態購自 Novagen。液相色譜分析使用Agilent-1200色譜儀，色譜柱為Eclipse )(DB-C18柱（4.6 X 150 mm)〇
[0010] 實施例1:基因突變 所用S故耶〇%基因Genbank號為AP006840. 1，先將該基因全合成并連接到pET32載體 上獲得質粒：PET32-S故耶〇%，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中對野生型基因進行可溶表達，表 達出的蛋白N-端帶有6*his tag。根據需要突變的位點，參照Quick Change Mutagenesis Kit試劑盒使用說明，合成表1中所用PCR突變引物，從野生型菌種提出質粒DNA，以其為模 板進行PCR產物擴增，對擴增出來的PCR產物進行Dpnl切割，切割后進行核酸回收并轉化 T0P10感受態，挑取單菌落送樣測序，對于測序正確的樣品，轉化BL21菌株。
[0011] 表1:突變PCR引物
以故3/70%質粒為模板，使用引物1和2在質粒上引入R35E單突變，并將突變 后產物轉化至大腸桿菌T0P10感受態，提取質粒并測序驗證，將測序正確的質粒轉化入大 腸桿菌BL21(DE3)感受態中，獲得表達菌株。分別使用引物3和4, 5和6, 7和8,重復上述 步驟，獲得R35E/R36V，R3OT/R36V以及R3OT/R36Q三個雙突變菌株；以R35E/R36V為模板， 使用引物9和10,獲得R35E/R36V/Y76V三突變菌株。
[0012] 實施例2:突變體酶的表達、初步純化 將實施例1中獲得的突變體菌株分別于2 L LB液體培養基中進行培養，先于37°C培 養至〇D6。。約0. 8后，加入終濃度0. 5 mM的異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)進行 誘導表達，誘導溫度為25°C，誘導時間為20小時。誘導表達結束后，于5000 rpm離心5分 鐘收集菌體，利用緩沖液A (20 mM Tris-Cl pH 8.0,50 mM氯化鈉）重懸并洗滌菌體，并再 次離心菌體。后續所有純化實驗均在4°C進行，所有緩沖液均先預冷至4°C。將洗滌后的菌 體用100 mL緩沖液A重懸菌體，高壓勻漿破碎，14000 rpm離心30分鐘去除破碎沉淀，上 清上樣用緩沖液A平衡過的Ni-NTA層析柱，并用緩沖液B (20 mM Tris-Cl pH 8.0，50mM 咪唑，500 mM氯化鈉)去除雜蛋白，用緩沖液C(20 mM Tris-Cl pH 8. 0，250mM咪唑，500 mM氯化鈉）洗脫出目的蛋白。將目的蛋白對緩沖液D (20 mM Tris-Cl pH 8.0，50 mM氯 化鈉）進行透析，以去除高濃度咪唑以及氯化鈉。附圖1為純化后的突變子蛋白電泳圖譜。
[0013] 實施例3:突變體的活力測定 突變子的活力利用SPECTRAMAXM2e (MD，USA)酶標儀進行測定，所用測活體系如下：各 成分的終濃度分別為：20 mM底物丙酮酸，200 mM底物氯化銨，1 mM輔酶NADH (或NADPH)， 適量StDapdh突變體純酶，測活緩沖液為100 mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖溶液pH 9. 0,最終 體積200 ML。底物以及蛋白樣品均先加入96孔板中于30° C平衡10分鐘，再向其中添加 輔酶NADH起始反應，通過測量340 nm處吸光度的減少來測定酶活力（NADH在340 nm摩爾 消光系數為6. 22 mM ~ cm ^，酶活力單位定義為催化反應時每分鐘消耗1 Mmol輔酶NADH 所需的酶量，表2為野生型酶以及突變子酶對NADH以及NADPH的比活力，從表中可以看出， 所有突變體的輔酶偏好性均從野生型酶的NADP(H)翻轉為NAD (H)依賴型。
[0014] 表2野生型酶和突變體對NADH以及NADPH的比酶活
【主權項】
1. 五種NAD (Η)依賴型氨基酸脫氫酶突變體，可以作為生物催化劑。2. 包括：利用來源于嗜熱共生桿菌（的NADP (Η)依 賴型氨基酸脫氫酶StDapdh作為模板，通過分子生物學技術進行突變獲得NAD (Η)依賴型 的氨基酸脫氫酶突變體。3. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其蛋白特征在于， 突變體模板為嗜熱共生桿菌（的azeso-二氨基庚二酸脫 氫酶或者是與其氨基酸序列相似度不低于80%的蛋白質。4. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其蛋白序列特征 在于將同源性比較相當于StDapdh第35位的精氨酸（R)替換為谷氨酸（E)，即R35E。5. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其蛋白序列特征 在于將同源性比較相當于StDapdh第35位的精氨酸（R)替換為谷氨酸（E);將同源性比較 相當于StDapdh第36位的精氨酸（R)替換為纈氨酸（V)，即R35E/R36V。6. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其蛋白序列特征 在于將同源性比較相當于StDapdh第35位的精氨酸（R)替換為天冬氨酸（D);將同源性比 較相當于StDapdh第36位的精氨酸（R)替換為纈氨酸（V)，即R3OT/R36V。7. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其蛋白序列特征 在于將同源性比較相當于StDapdh第35位的精氨酸（R)替換為天冬氨酸（D);將同源性比 較相當于StDapdh第36位的精氨酸（R)替換為谷氨酰胺（Q)，即R3OT/R36Q。8. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其蛋白序列特征 在于將同源性比較相當于StDapdh第35位的精氨酸（R)替換為谷氨酸（E);將同源性比較 相當于StDapdh第36位的精氨酸（R)替換為纈氨酸（V);將同源性比較相當于StDapdh第 76位的酪氨酸（Y)替換為纈氨酸（V)，即R35E/R36V/Y76V。9. 如權利要求1所述生物催化劑二氨基庚二酸脫氫酶突變體，其輔酶偏好性從 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH或NADP+)變為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH或NAD+)。
【文檔編號】C12R1/01GK105821014SQ201510006413
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月7日
【發明人】劉衛東, 陳曦, 趙雷明, 李鍵煚, 馮進輝, 吳洽慶, 朱敦明, 馬延和
【申請人】中國科學院天津工業生物技術研究所